La micro-injection d&#39;insuline de l&#39;hippocampe et<em&gt; In vivo</emMicrodialyse&gt; Test de la mémoire spatiale cours

Résumé

Modulation de charge hippocampally-mémoire de travail spatiale par micro-injection directe intrahippocampique, accompagnée et suivie d' In vivo pour les métabolites dans des animaux conscients et se comportent.

Résumé

Le métabolisme du glucose est un marqueur utile pour l'activité neuronale locale, formant la base de méthodes telles que l'imagerie par résonance 2-désoxyglucose et magnétique fonctionnelle. Cependant, l'utilisation de ces méthodes dans des modèles animaux nécessite une anesthésie et donc à la fois modifie l'état du cerveau et empêche mesures comportementales. Une autre méthode est l'utilisation de la microdialyse in vivo de prendre la mesure en continu des concentrations cérébrales fluides extracellulaires de métabolites du glucose, de lactate et connexes dans éveillé, animaux en liberté. Cette technique est particulièrement utile lorsqu'il est combiné avec des tâches visant à s'appuyer sur des régions spécifiques du cerveau et / ou de manipulation pharmacologique aiguë, par exemple, les mesures de l'hippocampe au cours d'une tâche de mémoire de travail spatiale (alternance spontanée) montrent une baisse de la glycémie extracellulaire et l'augmentation de lactate qui sont suggestive de ^1,2 glycolyse accrue, et l'administration d'insuline à la fois intrahippocampique améliore la mémoire et augmente glycol hippocampelyse ^3. Des substances telles que l'insuline peut être livré à l'hippocampe par la sonde de microdialyse même utilisé pour mesurer les métabolites. L'utilisation de l'alternance spontanée comme une mesure de la fonction hippocampique est conçu pour éviter tout confondre de motivation stressantes (p. ex footshock), de retenue ou de récompense (par exemple la nourriture), qui peuvent tous altérer l'exécution des tâches à la fois et le métabolisme, cette tâche fournit également un mesurer l'activité motrice qui permet de contrôler pour les effets non spécifiques de traitement. Ensemble, ces méthodes permettent la mesure directe des variables neurochimiques et régulant le comportement métabolique.

Protocole

1. Préparation chirurgie

1. Manipulation. Animaux (le plus souvent, les rats ou les souris, bien que la méthode de microdialyse et la combinaison avec les tests comportementaux est en grande partie un problème général avec tout requis spécifiques aux espèces adaptations nécessaires, par exemple pour l'anesthésie) sont traitées pour un minimum de 10 min / jour pendant au moins deux jours avant la chirurgie. Manipulation de grande envergure a été montré pour laisser les animaux dans un état ​​non contraint au moment du test, en évitant confondre possible ^2,4,5. Nous allons utiliser tout au long de ce protocole rats comme une espèce par exemple. Manipulation doit se faire sans le stress occasionné en tirant sur ​​la fourrure à partir de latex ou en nitrile par exemple: cela peut être mieux réalisé à mains nues, en consultation avec le vétérinaire installation et responsables de la santé des employés. Si cela n'est pas possible, des gants en coton doux doivent être portés sur les gants barrière pour éviter de tirer sur la fourrure des rats.
2. Préparation du champ stérile. Avant de commencer la chirurgie, la Surgiczone al est préparé, un champ stérile préparé dans le dispositif stéréotaxique et un drap stérile placé à travers l'appareil, couvrant un coussin chauffant qui est utilisé pour maintenir la température du corps du rat. Plaquette de l'eau chaude circulant à thermostat précis est utilisé pour éviter une surchauffe de l'animal.
3. Induction de l'anesthésie. Le vaporisateur isoflurane est vérifiée pour contenir un niveau optimal de l'isoflurane et reliée à la chambre d'induction. Connexions sont vérifiés afin de confirmer une boucle fermée. Le système d'aspiration de traitement d'air est vérifié pour être opérationnel. Vaporisation isoflurane est allumé et l'animal placé dans la chambre d'admission en utilisant un isoflurane 5% dans le mélange en oxygène, c'est-5% d'isoflurane ajoutée dans un courant d'oxygène à 100% et directement à la chambre d'induction.
4. Placement dans l'appareil. Les animaux sont fixés dans le dispositif stéréotaxique utilisant earbars et une barre de dent. Correctes des résultats de placement earbar dans une tête immobile et les oreilles qui se trouvent à plat le long des earbars. Animauxsont fixés rapidement et le nez inséré dans un but conçu coiffe anesthésique; livraison de l'isoflurane vaporisé est commuté de la chambre d'induction de la coiffe et le mélange anesthésique adapté pour délivrer 2-3% d'isoflurane dans le flux d'oxygène allant de la coiffe.
5. Confirmation de l'anesthésie. Un plan chirurgical anesthésique est confirmée par délivrant un pincement dur pour le pied et une bouffée d'air à l'oeil, ni devrait provoquer une réponse. Ces tests sont répétés à intervalles d'environ 15 min à travers une intervention chirurgicale pour confirmer le maintien d'un plan chirurgical d'anesthésie. Cheveux est éliminée du site d'incision avant d'entrer dans le champ stérile.

2. Chirurgie

1. Animale traitement initial. Pommade ophtalmique est appliqué à chaque globe oculaire pour éviter le dessèchement. 1 ml de solution saline stérile est donnée sc pour éviter toute déshydratation pendant une intervention chirurgicale, et le corps est couvert d'un drap stérile. Bétadine est appliquée sur le cuir chevelu, et frottée du centreavec un coton-tige; éthanol à 70% est frottée même, et les deux étapes eau pour le lavage sont répétés deux fois plus d'assurer une incision adéquate. Temps de contact avec la peau de la bétadine et de l'alcool doit être d'au moins 3 minutes avant l'incision. L'anesthésie est entretenu et vérifié régulièrement tout au long de la chirurgie, une seule injection sous-cutanée de carprofène 5 g / kg) est donnée pour initier l'analgésie, et une technique aseptique est utilisée. L'analgésie est donné suite à l'induction de l'anesthésie afin de minimiser les contraintes de l'injection.
2. Incision et la préparation du crâne. Une coupe 3-4 cm est faite dans le plan sagittal centre du crâne. Un mélange 1:1 de bupivicaïne: épinéphrine est appliqué par voie topique pour l'analgésie et de minimiser les saignements. Le cuir chevelu est maintenu à distance de l'incision à l'aide des pinces chirurgicales et des tampons stériles sont utilisés pour enlever les membranes recouvrant le crâne. Coordonnées de forage sont mesurées à l'aide bregma comme point de référence, marqués à l'aide d'un foret stérile (ou, alternativement, une main cautérisation device), et re-confirmé l'exactitude avant le début de forage. Coordonnées des régions spécifiques du cerveau d'intérêt (par exemple ici l'hippocampe) sont déterminés en utilisant un atlas du cerveau. Pour microdialyse l'hippocampe, nous utilisons un site de forage à 5,6 mm en arrière du bregma, +5,0 latérale, et 3,0 ventrale de dure-mère.
3. Forage. Trois trous sont percés à travers le crâne, en prenant soin d'appliquer une force minime tels que le traumatisme de la dure-mère et les membranes sous-jacents est faible ou absent. Un trou est mesurée sur le site d'insertion de la canule, les deux autres sont positionnés aussi pratique pour l'insertion de vis du crâne. But de taille vis (par exemple 1,17 mm vis autotaraudeuses; Outils Fine Science) sont insérés dans ces trous sans impact sur ​​le cerveau en dessous, et sont utilisés comme points d'ancrage pour l'application ultérieure du ciment dentaire.
4. Placement canule et la fermeture. La canule est positionnée à l'insertion des coordonnées, qui sont re-confirmé comme étant le site de trou foré,et est ensuite lentement descendu à la profondeur cible. Une fois correctement positionné, la canule est maintenue en place avec du ciment dentaire. Si nécessaire, une simple suture chirurgicale stérile est utilisé pour fermer la plaie. Un stylet est inséré dans la canule pour maintenir la perméabilité. Dans ce protocole, nous allons utiliser une sonde CMA12 et guide de canule (RMR / microdialyse).
5. Aiguë soins post-chirurgicaux. 3 ml de solution saline stérile est donnée pour continuer l'hydratation cutanée; une seule injection sous-cutanée de carprofène 5 g / kg) est également proposée pour initier une analgésie. Les animaux sont retirés de l'appareil et placés dans une chambre de récupération chauffé, dans une cage propre et contrôlée jusqu'à ce qu'elles soient complètement récupéré de l'anesthésie. Le rétablissement complet est évaluée par la restauration de redresser locomotion réflexe et normal. Les animaux sont ensuite retournés dans leur cage et une salle tenue régulière.
6. À court terme des soins de suivi. Les cages d'animaux qui ont subi une chirurgie sont marqués avec la date de la chirurgie. Les animaux sont contrôlés au moins une fois par jour pendant au moins three jours après la chirurgie, et donné un comprimé à croquer de carprofène (2 mg) le jour après la chirurgie et chacun des deux jours suivants. Si les animaux ne consomment pas le carprofène, le carprofène injectable peut être accordée pour assurer une analgésie adéquate. Contrôlez l'état de santé général de l'animal et de l'état du site de la plaie (pour l'infection, rougeur, etc) à la suite des directives institutionnelles de soins aux animaux et demander de l'aide ou des conseils auprès du personnel de soins aux animaux ou au vétérinaire en cas de besoin. Surtout, notez que la gestion appropriée et d'acclimatation à l'expérimentateur est essentielle: les animaux doivent être manipulés largement, y compris la manipulation de la canule, jusqu'à ce que aucun signe de nervosité ou de stress reste lorsqu'ils sont manipulés par l'expérimentateur.
7. Après les soins aux animaux et de traitement. Animaux suivra les procédures d'essai appropriées et l'euthanasie selon le protocole approuvé et leur groupe expérimental spécifique.

3. Microdialyse (mD)

1. Perfusmangé préparation. Artificielle liquide extracellulaire (AECF) est faite avec 153,5 mM de Na, 4,3 mM K, Mg 0,41 mM, 0,71 mM de Ca, 139,4 mm Cl, 1,25 mM de glucose, tamponnée à pH 7,4 ⁶ NOTE que la composition fluide précis est essentiel:. Inexactitudes ou utiliser d'autres, moins fluides physiologiques tels que la sonnerie ou du PBS pour microdialyse se traduira par des résultats nettement erronés ^6. Plus précisément, notons que la composition ionique du liquide extracellulaire (LEC) n'est pas le même que celui de la LCR, comme nous l'avons montré dans une étude de 2004 de l'ECF détaillée hippocampe ^6. Le jour du test, l'albumine sérique bovine (BSA) devrait être ajouté à 2% en poids / poids et entièrement dissous, ce qui réduit la perte de peptides tels que l'insuline de l'adhésion à la tubulure, et réduit également le risque de perte de liquide (ultrafiltration) à la membrane de la sonde. Après la préparation, la perfusion doit être filtré à travers un filtre 0,2 um.
2. Si un traitement tel que l'insuline doit être livré à la gorgedans la région d'intérêt (ici l'hippocampe), la préparation de ce traitement en utilisant une partie aliquote de l'AECF préparée avec la concentration du médicament approprié. Pour l'insuline, une concentration de 400 nM (66,7 uU / ul) à la livraison par microdialyse inverse a été démontré qu'elle affecte l'hippocampe métabolique et la fonction cognitive ^7. Notez que la concentration tissulaire résultant de l'insuline n'est pas mesurée ici et reste inconnue.
3. Mise en place sonde mD et des lignes. Préparer une sonde de microdialyse frais et ligne le jour avant le test. Créer deux lignes séparées pour les «entrées» et «sorties». Utilisez PE50 tuyau pour relier deux 1 mètre de longs morceaux de tube FEP et s'assurer qu'il n'ya espace mort minimal entre les lignes. Branchez le tuyau d'entrée d'une seringue de 1 ml Hamilton rempli de filtration stérile, désionisée H ₂ 0 ₍₂ 0 dH), puis fixez la sonde.
4. Pivotant microdialyse. Pour permettre un mouvement libre des animaux tout en prenant des mesures, une connexion pivotante liquide à la inflow et les lignes d'évacuation, à proximité de la pompe, en utilisant un tube supplémentaire FEP. Se rappeler de prendre du volume interne de ce tube pivotant et compte tenu de la période de collecte d'échantillon (ci-dessous).
5. Mise en place de la pompe mD. Tournez sur la pompe mD et fonctionne à 1,5 ul / min jusqu'à ce que vous voyez dH ₂ 0 la sortie du tube de sortie de la sonde. Puis, lorsque la pompe est éteinte, brancher l'autre ligne entre le tube de sortie et un tube de prélèvement d'échantillon. Exécuter 5 ml dans le tube et placer la sonde dans un flacon stérile contenant dH ₂ 0 du jour au lendemain, s'assurer que la sonde reste toujours humide.
6. Pré-test sous test. 24 heures avant le test, retirez le stylet factice de la tête du rat et insérer une sonde mD (utilisé uniquement à cette fin, et non pas pour l'échantillonnage) pendant 10 min. Puis remplacer le stylet mannequin et mettre le rat nouveau dans sa cage. Cette procédure est conçue pour minimiser l'effet de la gliose réactive le jour de l'essai ⁸ et dans nos mains, ce qui donne une bonne results qui correspondent données provenant d'autres techniques et semblent refléter activation de l'hippocampe ^2,5,7,9, d'autres ont utilisé une approche similaire qui laisse la sonde en place pendant 24 heures avant la mesure, qui est également une bonne approche si les dommages à la sonde pendant la nuit peut être évitée.
7. Équilibre de la sonde. Le jour de microdialyse, remplir la seringue Hamilton et flacon à scintillation avec AECF filtrée et pomper par s'équilibrer pendant 1 h. Si nécessaire, remplir une seconde seringue Hamilton avec un traitement préparé (par exemple, l'insuline AECF) et mettre dans la pompe seringue.
8. Insertion de la sonde. Lorsque l'équilibration est terminée, retirez le stylet mannequin et insérez doucement la sonde mD équilibrée dans le cerveau du rat par la canule. Placez le rat dans une boîte en plastique transparent qui contient quelques-uns des lits à la maison du rat. S'assurer de contrebalancer le tube: attacher un tube de 1,6 ml microcentrifugeuse rempli d'eau au tube extérieur de la cage de telle sorte que la gravité maintient la microdilignes ALYSE unkinked mais pas tendu. Laissez la sonde équilibrer chez le rat pendant 2 heures. Au début de cette période, vérifiez que le débit de perfusion est débloqué: il est plus facile à faire en collectant des sorties perfusion sur une période déterminée et pesée de l'échantillon pour confirmer que le volume prévu est de sortir du système. Toute sonde que les rendements <90% du volume prévu, et ne pas s'auto-corriger après le retrait et la réinsertion, doit être remplacé (sinon oedème à la pointe de la sonde entraîne). Si le débit est constamment faible ou absente, vérifier toutes les connexions pour fuites, à défaut, débrancher tube par étapes pour voir si le blocage peut être isolé. Si le problème n'est pas identifié, remplacer la sonde, si le problème n'est pas résolu, il peut être nécessaire de repartir à zéro avec la nouvelle sonde et les lignes de la section 3.3. La période d'équilibration de deux heures permet la barrière hémato-encéphalique pour refermer autour de la sonde et éviter tout effet aigu d'insertion de la sonde.
9. Prélèvement d'échantillons. Assurez-vous que la coopérationrrelation entre dialyse échantillon (du cerveau) et de la collecte (en tube) est calculé avec précision. Par exemple, au moyen de deux mètres de tube FEP entre pivotant et sonde, il ya un volume total entre la sonde et la collecte de 30 pi et donc il prend 20 min à 1,5 l / min de débit pour l'échantillon de passer à travers les sondes, tubes, connecteurs et pivoter pour atteindre l'extrémité du tube de collecte. Lorsque la collecte d'échantillons que vous collectez assez de volume pour avoir la concentration nécessaire pour vos tests. Ici, nous allons utiliser 5 bacs d'échantillonnage min, et donc de recueillir 7,5 pi de dialysat dans chaque tube de prélèvement.
10. Échantillons de référence. Une fois l'équilibrage terminé, commencer la collecte de l'échantillon. Prélever au moins trois échantillons tandis que le rat est au repos dans la chambre de la maison à établir une base stable de mesures
11. Moment du traitement. Prenez soin de calculer le calendrier requis pour l'initiation du traitement avant l'expérience: rappelez-vous que, tout comme il ya un décalage dans le temps entre la dialyseet la collecte de l'échantillon, il ya un décalage (généralement identique) entre perfusat laissant la seringue et à destination de l'hippocampe de l'animal. Par conséquent, dans notre configuration avec un volume de 30 ul entre la seringue et la sonde, changer la seringue à celui contenant traitement perfusat 20 min avant le traitement que vous souhaitez commencer à arriver à l'hippocampe.
12. Changement de seringues. Un interrupteur liquide peut être utilisé si vous le souhaitez, mais n'est pas nécessaire: le moment venu, il suffit de débrancher la conduite d'amenée de la seringue contrôle perfusat et rapidement se connecter à la seringue au traitement perfusat. Ce ne devrait pas prendre plus de 5 secondes pour éviter une interruption importante de la circulation perfusat. NOTE que ce processus doit être inversé après la dose souhaitée a été livré, si une livraison limitée dans le temps de traitement est souhaitée. Sinon, le traitement peut se poursuivre pendant toute la durée de l'échantillonnage (voir Figure 2). Les bulles d'air ne doit pas être introduit dans la ligne lors de la commutation deseringues, car ils peuvent s'accumuler sur la membrane de dialyse et de réduire l'efficacité de la sonde.
13. Tests comportementaux. Si vous effectuez une tâche comportementale, suivez cette procédure (voir la section 4 ci-dessous). NOTE que la coordination avec la livraison d'un traitement à l'hippocampe est important. Par exemple, la livraison d'insuline doit être programmée pour se produire 10 min avant le test à partir du ^10. Par conséquent, le passage à un liquide de perfusion contenant l'insuline doit se faire 30 minutes avant les tests de comportement (20 min pour perfusion à passer à travers les lignes de plus 10 min de temps de livraison souhaitée avant les essais).
14. Achèvement de la collecte des échantillons. Après avoir recueilli les échantillons souhaités, retirez délicatement la sonde de la tête de l'animal, en vous rappelant de prendre en décalage dans le temps entre le compte de la dialyse et de collecte de l'échantillon. Retour à l'animal de sa cage et observer de près pour tout changement post-expérimentale en matière de santé ou de comportement jusqu'à ce que l'animal est tué et enlevé le cerveau pour confirmer correcteplacement de la sonde. Si le sacrifice n'aura pas lieu immédiatement, replacez le stylet mannequin à la canule afin d'éviter toute introduction de corps étrangers.
15. Analyse. La méthode d'analyse varie en fonction de l'analyte (s) d'intérêt. Comme l'échantillonnage dialyse ne permet pas pour l'équilibrage analyte complète à la membrane de la sonde, les concentrations d'échantillons doivent être corrigées pour obtenir des concentrations ECF en utilisant la méthode zéro-net-flux ^11,12.

4. Test comportemental

1. Placement sur labyrinthe. Après échantillons de référence (c'est à dire après au moins trois échantillons ont terminé la dialyse, mais peut-être encore dans la tubulure de sortie étant collectées), déplacez doucement le rat dans l'appareil de test de comportement. Toute tâche appropriée peut être utilisée, les données de la figure 1 ont été recueillies à l'aide de quatre bras en forme de plus-labyrinthe et la mesure de l'alternance spontanée, qui est une mesure de la mémoire de travail spatiale: le rat est placé initialement dans le centreter du labyrinthe et a permis d'explorer librement ^9,13. Parce que tout test de comportement peuvent être utilisés, la mise au point de ce protocole n'est pas sur la tâche spécifique utilisée ici comme exemple (qui est détaillé ailleurs ^9,14,15), mais en bref, les animaux sont permis d'explorer le labyrinthe (la période de la boîte de gris sur la figure 1) et en utilisant hippocampally processus dépendant de conserver la mémoire de ces bras viennent d'être vu.
2. Mouvement des tubes de dialyse au cours des essais. Tenir le tube de telle sorte qu'il se déplace librement, ni gêne le mouvement du rat, ni être autorisés à se déplacer à l'avant de l'animal et le distraire. Rester en place et de minimiser votre propre mouvement afin de ne pas affecter le comportement du rat.
3. Prélèvement de l'échantillon constant. Comme au cours de référence, déplacez le tuyau d'évacuation à un nouveau tube collecteur toutes les 5 min.
4. Tests alternance. Permettre à l'animal d'explorer librement le labyrinthe pendant 20 min. Enregistrer la séquence et le calendrier des entrées bras soit à l'aideun enregistrement vidéo ou à la main pour l'analyse des tâches performances tard ^9,15.

5. Post-test

1. Prélèvement de l'échantillon final. Après des essais, retirez délicatement le rat de labyrinthe et de retour pour contrôler chambre. Continuer collecte d'échantillons de micro-dialyse pendant au moins quatre échantillons pour couvrir la période de rétablissement de l'exécution de la tâche.
2. Le retrait de la sonde. Lorsque tous les échantillons ont été recueillis, retirez délicatement la sonde de la tête de l'animal et le placer dans une fiole de stockage; retourner l'animal à sa cage.
3. De stockage de la sonde. Après le retour des animaux à la cage et de compléter la collecte de toute dialysat reste, rincez soigneusement la sonde à dH ₂ 0 et conserver dans un flacon à scintillation rempli de dH ₂ 0 et couvert avec du parafilm. Rincer le tube en passant à une seringue contenant une solution de 1:10,000 Kathon dans dH ₂ 0 pour empêcher la croissance microbienne. Les sondes peuvent être réutilisés dans la mesure où ils maintiennent un bon écoulement et ontaucun dommage à la membrane; avec soin ce qui devrait être systématiquement supérieure à dix utilisations.
4. Histologie. Tuer l'animal et enlever le cerveau. Tranche sur un cryostat et utiliser les techniques habituelles histologiques (par exemple coloration au violet de crésyl) pour confirmer le placement correcte de la sonde.

Résultats

Les rats doivent se remettre rapidement de la chirurgie et être à l'affût, mobiles et actifs dans les 30 min après l'arrêt de l'anesthésie. L'impact du bouchon canule devrait être minime si l'opération est effectuée proprement et minimale de ciment dentaire est utilisé. Si aucun signe d'infection est remarqué au cours de la surveillance post-opératoire, ou le rat est de toute façon à montrer des signes de détresse ou d'inconfort, résilier immédiatement l'expérience, ce qui devrait être ex...

Discussion

Toutes les solutions utilisées dans microdialyse doit être filtré immédiatement avant l'utilisation, en utilisant un filtre 0,2 um. Après l'insertion de la sonde dans la canule de guidage, d'observer afin de confirmer que l'écoulement est libre et collecte des échantillons est en cours. Si le débit s'arrête après l'insertion, la cause la plus probable des dommages à la membrane de la sonde causée par l'insuffisance des soins lors de l'insertion, et une sonde de frais doit être remplacé. <...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			La majorité des réactifs de laboratoire sont de qualité standard et peut être obtenu auprès d'un fournisseur de choix. De même, des équipements tels que pompes à seringues et des tubes peut être utilisé à partir de n'importe quel de plusieurs fabricants. Les éléments spécifiques utilisés ici pour les détails qui sont importants sont:
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