L'analyse de la fonction des gènes et visualisation de Cilia généré par l'écoulement des fluides dans des vésicules de Kupffer

Summary

Cilia généré par l'écoulement du fluide dans des vésicules de Kupffer (KV) contrôle de gauche à droite structuration de l'embryon de poisson zèbre. Nous décrivons ici une technique permettant de moduler la fonction du gène spécifiquement dans les cellules KV. En outre, nous montrons comment livrer des billes fluorescentes dans KV de visualiser l'écoulement du fluide.

Abstract

Les organes internes comme le cœur, le cerveau et l'intestin développer gauche-droite (LR) asymétries qui sont critiques pour leurs fonctions normales ^1. Cils mobiles sont impliqués dans l'établissement LR asymétrie dans des embryons de vertébrés, y compris la souris, grenouille, poisson zèbre et ^2-6. Ces «cils LR engendre de l'écoulement du fluide asymétrique qui est nécessaire pour déclencher une asymétrie conservée Nodal (TGF-β superfamille) cascade de signalisation dans le mésoderme de la plaque latérale gauche, ce qui est pensé pour fournir des informations de motifs LR pour le développement des organes ^7. Ainsi, pour comprendre les mécanismes sous-jacents de motifs LR, il est essentiel d'identifier les gènes qui régulent l'organisation des cellules ciliées LR, la motilité et la longueur des cils LR et leur capacité à générer des flux robuste asymétrique.

Dans l'embryon du poisson zèbre, les cils LR sont situés dans des vésicules de Kupffer (KV) ^2,4,5. KV est constitué d'une seule couche de cellules épithéliales monociliatedqui entourent une lumière remplies de liquide. Cartographie destin a montré que KV est dérivé d'un groupe de ~ 20-30 cellules appelées cellules précurseur dorsales (SFD) qui migrent à la marge blastoderme dorsal pendant les étapes épibolie ^8,9. Au cours des phases précoces de somites, le cluster DFC et se différencient en cellules épithéliales ciliées pour former KV dans le bourgeon caudal de l'embryon ^10,11. La capacité d'identifier et de suivre les SFD en combinaison avec transparence optique et le développement rapide de l'embryon du poisson zèbre zèbre faire-KV un excellent modèle pour étudier les cellules ciliées LR.

Fait intéressant, les progéniteurs de la lignée cellulaire DFC / KV conserver des ponts cytoplasmiques entre la cellule vitelline jusqu'à 4 heures après la fécondation (HPF), tandis que les ponts cytoplasmiques entre la cellule vitelline et d'autres cellules embryonnaires près au bout de 2 hpf ^8. Profitant de ces ponts cytoplasmiques, nous avons développé une stratégie d'injection spécifique du stade de livrer morpholino oligonucleotides (MO) uniquement aux SFD et démontable de la fonction d'un gène ciblé dans ces cellules ^12. Cette technique crée des embryons chimères dans lesquelles la fonction du gène est renversé dans la lignée DFC / KV développement dans le contexte d'un embryon de type sauvage. Pour analyser l'écoulement du fluide asymétrique KV, on injecte des microbilles fluorescentes dans la lumière KV et enregistrement de mouvement de billes utilisant la vidéomicroscopie ^2. L'écoulement du fluide est facilement visualisée et peut être quantifiée en suivant le déplacement perle au fil du temps.

Ici, en utilisant la phase spécifique DFC ciblée technique inactivation génique et l'injection de microbilles fluorescentes dans KV à visualiser la circulation, nous présentons un protocole qui fournit une approche efficace pour caractériser le rôle d'un gène particulier au cours du développement et de la fonction KV.

Protocol

Vue d'ensemble de la phase spécifiques injections embryon du poisson zèbre

Oligonucléotides antisens morpholino (MO), qui se lient à un ARNm cible et perturber l'expression des protéines à partir de ce compte rendu, sont largement utilisés dans inactivation génique (perte de fonction) des études chez le poisson zèbre ^13,14. Outils Gene, LLC offre des OM qui sont marqués soit avec carboxyfluorescéine (émet la fluorescence verte) ou lissamine (émet la fluorescence rouge) pour détecter MO embryons injectés en utilisant la microscopie à fluorescence. En injectant de MO dans la cellule jaune à différents stades de développement du poisson zèbre, il est possible de livrer le MO à des compartiments spécifiques de l'embryon (figures 1A-F). MO injecté dans le jaune d'oeuf entre les étapes 1-4 de cellules (0-1 HPF) pénètre dans toutes les cellules embryonnaires (figures 1A, D, D ') par l'intermédiaire des connexions avec le jaune d'oeuf qui persistent jusqu'à l'étape ^32-15 cellule démontable pour faciliter global. MO injecté dans le jaune pendant midblastétapes ula (2,5-3 hpf) peut entrer dans les progéniteurs des SFD (figures 1B, E, E ') probablement par des ponts cytoplasmiques ⁸ et la fonction des gènes knockdown spécifiquement dans la lignée cellulaire DFC / KV ^12, sans entrer dans la plupart des autres lignées de cellules embryonnaires . Comme un contrôle important de tester si la fonction du gène est nécessaire DFC / KV ou également en jaune ^12,16, il est également possible de limiter la cellule MO jaune par injection entre les étapes épibolie dôme-30% (~ 4,5 HPF) après tous les ponts cytoplasmiques ont fermé leurs portes (figures 1C, F, F '). Ces injections ont été utilisés en combinaison pour analyser la fonction des gènes dans des PLC / KV cellules ^17-24. Pour évaluer l'écoulement du fluide dans le KV, des microbilles fluorescentes sont injectés dans la lumière KV entre les 6-10 somites étapes (12-14 hpf) et puis tout de suite imagée en utilisant la vidéomicroscopie (figures 1G-J). Microbilles sont disponibles qui émettent une fluorescence rouge ou vert (ou les deux), il est donc possible d'utiliser différentscanaux à l'image fluorescente microbilles et MO.

1. Spécifiques au stade de l'injection de morpholinos (MO)

L'injection de MO dans embryons de poisson zèbre a été démontré précédemment ^25,26. Ici, nous décrivons brièvement spécifiques au stade injections MO. Après toutes les injections, les embryons sont transférés dans une boîte de Pétri et incubés à 28,5 ° C.

1. Mondiale injection MO: Recueillir des embryons immédiatement après la fécondation et les charger dans une plaque d'injection. Chargez fluorescente MO dans une aiguille capillaire et monter l'aiguille sur un microinjecteur (par exemple, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injecteur). Briser le bout de l'aiguille et régler les paramètres d'injection (pression et / ou de temps) pour créer une chute d'injection qui a un volume de 1 nl comme décrit ^25,26. L'utilisation d'un stéréomicroscope à dissection, injecter 1 nl de MO dans le jaune (figure 1A) ≥ 50 embryons par expérience. Travaillez rapidement pour compléter injections par le cerf à 4 cellulese.
2. DFC-cible d'injection MO: Recueillir des embryons immédiatement après la fécondation et incuber à 28,5 ° C. Lorsque les embryons ont atteint le stade de 256 cellules (~ 2,5 hpf), rapidement les charger dans une plaque d'injection et injecter 1 nl fluorescente MO dans le jaune d'≥ 100 embryons entre les stades 256-cellulaires et 1000 cellules (Figure 1B).
3. Jaune-injection ciblée MO: Recueillir des embryons immédiatement après la fécondation et incuber à 28,5 ° C. Au stade de dôme (~ 4 hpf), chargez les embryons dans une plaque d'injection et injecter 1 nl fluorescente MO dans le jaune d'≥ 100 embryons entre le dôme et les étapes épibolie 30% (figure 1C).

2. Sélection d'embryons injectés pour l'analyse

1. Lorsque MO injecté embryons atteignent le stade à 75% épibolie (8 hpf), retirer les embryons non fécondés et les embryons morts, puis l'écran qui vivent sous un microscope à fluorescence dissection pour la distribution de la MO fluorescent. Puis allow sélectionné embryons de se développer à 28,5 ° C.
   1. Pour mondial MO injections, sélectionner les embryons qui ont fluorescence uniformément répartis dans toute les cellules embryonnaires (figure 1D; figure 2A).
   2. Pour DFC-cible injections MO, sélectionner les embryons qui fluorescente MO a diffusés dans tout le jaune d'oeuf et semble concentrée sur la marge blastoderme dorsal (DFC) (figure 1E, figure 2B). A ce stade, il peut être difficile de visualiser les SFD fluorescentes en raison de fluorescence brillante dans le jaune d'œuf sous-jacent. Prenez soin d'exclure les embryons dans lequel la lampe fluorescente MO a incorporés dans des cellules embryonnaires autres que les SFD reste agrégées ou au site d'injection (figure 2D).
   3. Pour le jaune ciblées injections MO, sélectionner les embryons qui en MO fluorescence est uniformément réparties dans le jaune et le non-respect dans toutes les cellules embryonnaires (figure 1F, figure 2C). Encore une fois, retirez embryons dans lequel la fluorescence reste MOagrégées au niveau du site d'injection.
2. Entre les étapes 2-4-somites (~ 11 hpf), écran embryons une seconde fois sous un microscope à fluorescence en utilisant un plus fort grossissement. Ensuite, laisser embryons sélectionnés pour développer à 28,5 ° C.
   1. Pour les injections MO mondiaux, assurer embryons sélectionnés ont MO fluorescence répartie uniformément dans KV et toutes les cellules embryonnaires (figure 1D »; figure 2E).
   2. Pour DFC-cible injections MO, soigneusement sélectionner les embryons qui ont fluorescence MO uniquement dans les cellules KV et le jaune (figure 1E). Embryons transgéniques qui expriment la GFP dans les cellules KV, tels que Tg (Dusp6: d2EGFP) ^27, peuvent aider à l'identification des embryons dans lequel MO a été livré avec succès à des cellules KV (figure 2F). Jeter embryons avec MO fluorescence dans les cellules embryonnaires d'autres cellules que les KV.
   3. Pour le jaune ciblées injections MO, sélectionner les embryons qui ont fluorescence MO exclusivement dans le jaune (figure 1F ': Figure2G).

3. Les embryons de montage pour analyser l'écoulement des fluides dans KV

1. Pour analyser l'écoulement du fluide asymétrique KV mondiale de la MO, MO DFC-cible ou jaune-ciblées embryons injectés MO, soigneusement dechorionate ~ 20 embryons entre 4-6 étapes somites (~ 11-12 hpf) avec une pince tranchants.
2. Préparer 50 ml de 1% à bas point de fusion d'agarose et aliquote en tubes de 5 ml d'être maintenu sous forme liquide dans un bain à sec à 42 ° C.
3. Transfert d'un embryon à une diapositive dépression verre (Fournitures United Scientific, Inc) et retirer autant d'eau que possible. Immobiliser l'embryon en ajoutant assez chaud 1% à bas point de fusion d'agarose pour juste couvrir l'embryon (trop d'agarose peuvent interférer avec l'imagerie ultérieure). Comme l'agarose se solidifie, utilisez une pince pour positionner l'embryon tel que KV est orientée vers le haut (vue dorsale) (figure 1H). Monter 10 embryons avec un seul embryon par diapositive. Travaillez rapidement pour s'assurer que toutes les injections dans l'étape suivante sont complETED par le stade 10 somites (14 hpf).

4. L'injection de microbilles fluorescentes dans KV

1. Diluer Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 micron de diamètre des microsphères (Polysciences, Inc) à 1:50 dans de l'eau stérile dans un tube Eppendorf de 1,5 ml.
2. Mélanger la dilution 1:50 de microbilles soigneusement en tapotant le tube et charger 3 pi dans une aiguille capillaire. En utilisant la même microinjecteur utilisé pour MO injections (par exemple Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injecteur), briser la pointe de l'aiguille avec une pince et d'ajuster les paramètres d'injection pour générer la chute d'injection plus faible possible (<0,5 nl).
3. Sous une loupe binoculaire, aligner l'aiguille avec la lumière KV de l'embryon d'abord monté. Insérez l'aiguille dans la lumière et injecter un petit volume (<0,5 nl) de billes (figure 1G). Une pointe de l'aiguille des petites et volume d'injection petit sont critiques pour éviter KV dommageable.
4. Injecter tous les embryons montés. Une fois que l'embryon a été injected, une goutte d'eau stérile peut être ajouté au-dessus de l'agarose pour l'empêcher de se dessécher. Au cours de ces injections, les perles sont souvent obstacle à l'ouverture de l'aiguille. Cela exige de briser la pointe de l'aiguille et en ajustant le volume d'injection en modulant le réglage de la pression ou l'heure de l'appareil micro-injection. Remplacer l'aiguille si elle s'émousse assez pour causer des dommages importants lors de l'injection.
5. Écran des embryons injectés pour la livraison réussie de perles sous un microscope composé fluorescent verticale (par exemple Zeiss AxioImager M1) à l'aide d'un objectif 20X. Tout d'abord, déterminer si la structure KV est intacte en utilisant un éclairage en fond clair (figure 1J), puis utilisez la fluorescence pour observer les perles. Sélectionner les embryons dont les perles sont présents et se déplaçant à l'intérieur de la lumière KV. Jeter les embryons atteints de lésions KV ou pas de perles flottantes KV. Il est facile de manquer KV et de livrer des perles pour les tissus voisins ou le jaune sous-jacent. En cas d'échec, montage another 10 embryons et répétez la procédure d'injection.

5. Visualisation et analyse des écoulements KV

1. Pour chaque embryon sélectionné avec des perles à l'intérieur KV, ajouter une goutte d'eau stérile pour couvrir l'agarose, puis observer KV sous le microscope composé fluorescent verticale en utilisant un objectif 63X d'eau de trempage (Figure 1I). Alternativement, une lamelle peut être appliquée pour une utilisation avec de l'eau non-objectifs de trempage et / ou des microscopes inversés.
2. Utiliser une caméra à haute vitesse monté sur le microscope (par exemple Zeiss AxioCamHSm) pour enregistrer un film de 10 secondes. Enregistrer à la fois les perles en utilisant le canal de fluorescence (environ 70 images / sec) et la lumière en utilisant un fond clair KV ou le contraste d'interférence différentiel (DIC) canal.
3. Pour visualiser tous les mouvements de perles au fil du temps, importer le film de billes fluorescentes en logiciel ImageJ (téléchargement gratuit sur ​​http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) unee créer une projection maximale de tous les signaux fluorescents dans le film. Pour effectuer la projection maximale dans ImageJ, cliquez sur "Image → → Piles projet Z». Dans le projet «Z» fenêtre, projeter toutes les tranches avec le type de projection de "l'intensité maximale». Cette image peut être superposée à une image DIC du KV dans lequel les perles ont été imagées (figures 3A-B).
4. Les mouvements des billes individuelles peuvent être suivis en utilisant ImageJ. Un plugin ("Alignement manuel") peut être téléchargé à http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Ouvrez le film fluorescent perles dans ImageJ et exécutez la fonction de suivi manuel. Dans la fenêtre de suivi manuel, vérifiez les paramètres "show" et les paramètres "pour des intervalles de temps» et «x / y de calibrage". Sélectionner manuellement perles qui restent dans le plan focal du film pendant ≥ 50 images puis de suivre ≥ 5 billes par embryon. La trajectoire et la vitesse de chaque bille est générée par elogiciel de courrier (figures 3 CD).

Results

Spécifiques au stade injections MO fournir une approche utile pour analyser la fonction des gènes dans des compartiments spécifiques de l'embryon. La figure 1 présente un diagramme des stratégies d'injection utilisés pour tester la fonction des gènes dans des PLC / KV cellules et comment introduire des billes fluorescentes de visualiser l'écoulement du fluide dans KV. La distribution des MO fluorescente succès spécifiques au stade embryons injectés est représenté schématiquement dans les figures...

Discussion

L'utilisation spécifiques au stade injections de cibler MO à la lignée cellulaire DFC / KV est une approche utile pour étudier des cellules autonomie de la fonction des gènes et de phénotypes pléiotropes éviter causés par inactivation génique globale. Toutefois, ces injections peuvent être techniquement difficile. L'injection de MO entre les étapes 256-cellulaires et 1.000 cellules peut aboutir à trois résultats possibles: 1) la MO reste agrégées au site d'injection, 2) les diffuse à travers le MO jaune et e...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue
Norme de contrôle oligo-Lissamine étiqueté	Gene Tools, LLC
Personnalisée Rock2b morpholino oligo	Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 micron microsphères	Polysciences, Inc	24054