$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Les organes internes comme le cœur, le cerveau et l'intestin développer gauche-droite (LR) asymétries qui sont critiques pour leurs fonctions normales 1. Cils mobiles sont impliqués dans l'établissement LR asymétrie dans des embryons de vertébrés, y compris la souris, grenouille, poisson zèbre et 2-6. Ces «cils LR engendre de l'écoulement du fluide asymétrique qui est nécessaire pour déclencher une asymétrie conservée Nodal (TGF-β superfamille) cascade de signalisation dans le mésoderme de la plaque latérale gauche, ce qui est pensé pour fournir des informations de motifs LR pour le développement des organes 7. Ainsi, pour comprendre les mécanismes sous-jacents de motifs LR, il est essentiel d'identifier les gènes qui régulent l'organisation des cellules ciliées LR, la motilité et la longueur des cils LR et leur capacité à générer des flux robuste asymétrique.
Dans l'embryon du poisson zèbre, les cils LR sont situés dans des vésicules de Kupffer (KV) 2,4,5. KV est constitué d'une seule couche de cellules épithéliales monociliatedqui entourent une lumière remplies de liquide. Cartographie destin a montré que KV est dérivé d'un groupe de ~ 20-30 cellules appelées cellules précurseur dorsales (SFD) qui migrent à la marge blastoderme dorsal pendant les étapes épibolie 8,9. Au cours des phases précoces de somites, le cluster DFC et se différencient en cellules épithéliales ciliées pour former KV dans le bourgeon caudal de l'embryon 10,11. La capacité d'identifier et de suivre les SFD en combinaison avec transparence optique et le développement rapide de l'embryon du poisson zèbre zèbre faire-KV un excellent modèle pour étudier les cellules ciliées LR.
Fait intéressant, les progéniteurs de la lignée cellulaire DFC / KV conserver des ponts cytoplasmiques entre la cellule vitelline jusqu'à 4 heures après la fécondation (HPF), tandis que les ponts cytoplasmiques entre la cellule vitelline et d'autres cellules embryonnaires près au bout de 2 hpf 8. Profitant de ces ponts cytoplasmiques, nous avons développé une stratégie d'injection spécifique du stade de livrer morpholino oligonucleotides (MO) uniquement aux SFD et démontable de la fonction d'un gène ciblé dans ces cellules 12. Cette technique crée des embryons chimères dans lesquelles la fonction du gène est renversé dans la lignée DFC / KV développement dans le contexte d'un embryon de type sauvage. Pour analyser l'écoulement du fluide asymétrique KV, on injecte des microbilles fluorescentes dans la lumière KV et enregistrement de mouvement de billes utilisant la vidéomicroscopie 2. L'écoulement du fluide est facilement visualisée et peut être quantifiée en suivant le déplacement perle au fil du temps.
Ici, en utilisant la phase spécifique DFC ciblée technique inactivation génique et l'injection de microbilles fluorescentes dans KV à visualiser la circulation, nous présentons un protocole qui fournit une approche efficace pour caractériser le rôle d'un gène particulier au cours du développement et de la fonction KV.