4D imagerie de l'agrégation des protéines dans les cellules vivantes

Résumé

La viabilité cellulaire dépend de la prise en charge rapide et efficace des mauvais repliement des protéines. Nous décrivons ici une méthode pour visualiser les différents destins possibles d'une protéine mal repliée: repliement, la dégradation ou la séquestration dans les inclusions. Nous démontrons l'utilisation d'un capteur de pliage, Ubc9 ^Ts, Pour protéostasie suivi et contrôle de la qualité d'agrégation dans les cellules vivantes par microscopie 4D.

Résumé

L'une des tâches essentielles de toute cellule vivante est de maintenir le repliement correct des protéines nouvellement synthétisées dans un contexte de constante évolution des conditions environnementales et un environnement intracellulaire qui est serrés, collants et dangereux à ¹ la stabilité des protéines. La capacité à équilibrer la production de protéines, de pliage et de la dégradation exige hautement spécialisé mécanisme de contrôle de la qualité, dont la nécessité absolue est observée mieux quand elle est en panne. Des maladies telles que la SLA, la maladie d'Alzheimer, de Parkinson, et certaines formes de fibrose kystique ont un lien direct vers repliement des protéines, des composants de contrôle de qualité ^2, et donc le futur développement thérapeutique nécessite une compréhension de base des processus sous-jacents. Notre défi expérimental est de comprendre comment les cellules intègrent les signaux des dommages et des ripostes adaptées aux diverses circonstances.

La raison principale pour laquelle les mauvais repliement des protéines représente un thre existentielleà la cellule est la propension des protéines mal repliées à l'ensemble, ce qui entraîne une perturbation globale de l'environnement encombré et délicat pliage intracellulaire ^1. La santé pliage, ou «protéostasie», du protéome cellulaire est maintenu, même sous la contrainte de vieillissement, le stress et les dommages oxydatifs, par l'action coordonnée des différentes unités mécaniques dans un système de contrôle de la qualité élaborée ^3,4. Une machinerie spécialisée des chaperons moléculaires peuvent se lier non indigènes polypeptides et de promouvoir leur pliage en l'état natif ^1, les cibler pour la dégradation par le système ubiquitine-protéasome ^5, ou les diriger vers des inclusions d'agrégation de protection ^6-9.

Chez les eucaryotes, la charge d'agrégation cytosolique contrôle de la qualité est partagé entre deux compartiments ^8-10: le compartiment de la qualité juxtanucléaire de commande (JUNQ) et le dépôt de protéines insolubles (IPOD) (Figure 1 - Modèle).Les protéines qui sont l'ubiquitine par la protéine contrôle de la qualité des machines de pliage sont livrés à l'JUNQ, où elles sont traitées pour la dégradation par le protéasome. Protéines mal repliées qui ne sont pas ubiquitine sont déviés vers l'IPOD, où ils sont activement regroupées dans un compartiment de protection.

Jusqu'à ce point, le paradigme méthodologique de cellules vivantes microscopie à fluorescence a été en grande partie aux protéines d'étiquettes et de suivre leurs emplacements dans la cellule spécifique points temporels et généralement en deux dimensions. Les nouvelles technologies ont commencé à accorder des expérimentateurs accès sans précédent à l'échelle submicronique dans les cellules vivantes, l'architecture dynamique du cytosol est venu en vue comme une difficile frontière pour la caractérisation expérimentale. Nous présentons une méthode pour contrôler rapidement les distributions spatiales 3D de plusieurs protéines marquées par fluorescence dans le cytosol de la levure au cours du temps. 3D timelapse (imagerie 4D) n'est pas seulement un défi technique; ratelle, elle facilite aussi un changement radical dans le cadre conceptuel utilisé pour analyser la structure cellulaire.

Nous utilisons une protéine cytosolique capteur de pliage en levures vivantes pour visualiser destins distincts pour les protéines mal repliées dans le contrôle de la qualité cellulaire agrégation, utilisant rapide 4D imagerie de fluorescence. Le mutant sensible à la température de la protéine Ubc9 ^10-12 (Ubc9 ^ts) est extrêmement efficace à la fois comme capteur de proteostasis cellulaire, et un modèle physiologique de contrôle de qualité de suivi agrégation. Comme avec la plupart des protéines ts, ^ts Ubc9 est entièrement repliée et fonctionnel à des températures permissives en raison de chaperons cellulaires actifs. Au-dessus de 30 ° C, ou lorsque la cellule est confrontée le stress repliement, Ubc9 misfolds ^ts et suit le destin d'une protéine globulaire native qui a été mal repliées due à une mutation, dénaturation par la chaleur, ou les dommages oxydatifs. En fusionnant la GFP ou à l'd'autres fluorophores, il peut être suivi en 3D car elle constitue stress foyers, ou est-directed à JUNQ ou IPOD.

Protocole

1. Préparations de levures

1. Transformer des souches de levure avec un plasmide portant une cassette d'GAL1-GFP-Y68L (UBC9 ^ts).
2. Croître la levure dans un milieu synthétique contenant du raffinose 2% pendant 24 h et retour dilué à 2% de galactose support contenant pendant 16 heures ou O / N. Incuber les cellules à 30 ° C sous agitation à 200 tours par minute.
3. Le lendemain matin, diluer la souche requête à DO ₆₀₀ = 0,2. Agiter pendant 4-6 heures à 30 ° C (200 rpm) jusqu'à ce que la culture atteigne _DO600 = 0.8 à 1.0.
4. Pour réprimer l'expression (afin de surveiller que la piscine déjà traduite et plié de GFP-Ubc9 ^ts), changer le support aux médias synthétiques additionnés de 2% de glucose (SD) 30 min avant l'imagerie.
5. Traitement - choc thermique des cellules pendant 20 minutes à 37 ° C afin d'induire mauvais repliement, ou en continu dans un microscope incubateur de suivre l'agrégation des protéines de choc thermique dans les conditions. Remarque - si vous utilisez le microscope à n'importe quelle température au-dessus de la température ambiante, préchauffer for 2 h environ à équilibrer la température le long du corps du microscope et les objectifs (voir ci-dessous).

2. Plaque \ préparations sur lame

1. Choisissez appropriée de la plaque. La principale considération est la capacité à maintenir le cap lors de l'acquisition d'imagerie. Les points suivants sont essentiels pour l'imagerie 4D et non laps de temps d'imagerie 2D ou 3D.
   1. Plusieurs puits de plaque le fond des puits différents peuvent ne pas être homogènes (c'est à dire le puits va être à des hauteurs différentes par rapport à l'objectif). Ainsi, il sera difficile de maintenir l'attention sur les points et les points xy temps, indépendamment de la technique mise au point automatique est utilisé.
   2. Matériau Slide: verre en plastique vs. Lames de verre sont plus à fond z homogène entre les puits, mais sont plus chers.
   3. Epaisseur du fond de la plaque: nous avons l'habitude d'utiliser des plaques à fond lamelle indice de 1,5, mais l'index 1 est également acceptable en fonction de l'objectif.
2. Cover fond de la plaque \ diaporama avec ConA (0,25 mg / ml) pendant 10 min. ConA est utilisé pour faire adhérer des cellules sur la lame, ce qui permet à la suite d'une seule cellule avec le temps.
3. Retirer ConA et incuber la lame dans une hotte chimique pour que la ConA excès s'évaporer.
4. Plaque 200 ul d'échantillon de levure _(DO600 = 0,5) dans le ConAed bien.
5. Incuber pendant 15 minutes, pour permettre cellules adhèrent à la surface de la plaque.
6. Extrait du milieu et laver trois fois avec du milieu nouveau pour obtenir une couche de cellules. Remarque: si un long laps de temps est prévu, ensemencer les cellules à faible densité de sorte que les nouveaux bourgeons ne se remplit pas et interrompent la région d'intérêt.

3. Préparations microscopiques

1. Nous utilisons un microscope confocal Nikon A1Rsi avec quelques modifications non standard. Pour l'imagerie levure que nous utilisons jusqu'à 4 lasers (405 nm, 50 mW; CUBE laser 457-514 nm, 65 mW laser à ions argon, 561 nm, 50 mW Sapphire laser; et 640 nm, 40 mW CUBE laser), et jusqu'à 4 PMT équipés d'filtres. La plupart de nos images se fait avec un ensemble filtre vert pour EGFP et un ensemble filtre rouge pour mCherry et tdTomato. Avec la GFP et mCherry il n'ya presque pas bleedthrough, donc nous utilisons souvent balayage simultané. Toutefois, la ligne de balayage peut aussi être utilisé pour prévenir bleedthrough lorsqu'elle se produit. Notre confocale est également équipé d'une platine piézo PInano (MCL), ce qui peut rendre 3 étapes ms en z, z-3.2 permettant piles (30-50 sections) par seconde. Le système comporte également un détecteur spectral, mise au point parfaite (laser offset), et deux scanners - un scanner galvanométrique et un scanner résonant.
2. Choisissez objectif approprié. Considérations principales:
   1. Eau / air / huile objectif: la principale considération est l'indice de réfraction du milieu d'imagerie vs la moyenne de l'échantillon.
      1. Avantages objectifs de pétrole:
         1. Objectifs plus élevés du pétrole peut avoir des ouvertures numériques (huile de pauses plus de lumière que l'eau, et donc plus de photons revenir à l'objectif). Objectifs du pétrole peut avoir jusqu'àà NA 1,49, contre 1,27 pour l'eau. (Cependant, ce n'est pas vraiment une énorme différence dans la résolution).
         2. L'indice de réfraction de l'huile correspond à l'indice de réfraction du verre, donc pas de photons sont perdus allant de l'échantillon, à travers la vitre, à l'objectif. (Remarque - a choisi une huile d'immersion qui a un indice de réfraction qui est approprié pour votre objectif et votre lamelle).
         3. Huile permet sans tracas à long temps de défaillances-car il ne s'évapore pas.
         Objectif inconvénients du pétrole:
         1. La résolution plus élevée possible par l'augmentation de NA objectifs huile se dégrade rapidement si la lumière doit parcourir à travers un milieu aqueux (par exemple une cellule).
         2. Images généralement aberrations sphériques et un plus "tendu" l'effet en 3D.
         3. Le pétrole est collante, en désordre, et un danger pour les objectifs.
      2. Avantages objectifs en eau
         1. La cellule elle-même est une solution aqueuse, donc il ya moins de distorsions dans Z, ae la résolution reste élevée en profondeur dans un échantillon aqueux.
         2. Nettoyez et convivial. Inconvénients objectives d'eau: s'évapore rapidement, donc pas utilisable pour de longs films sans accords spéciaux déployés pour pomper l'eau en permanence à l'objectif.
      3. Air avantages objectifs: 1. Aucun matériel est perdu / s'évapore lors de l'acquisition de points multiples ou un film de long. 2. Nettoyez et convivial. Inconvénient: faible résolution et la sensibilité de signal faible.
   2. La température ambiante et de l'incubateur: température changeante affecte propriétés de la matière, et dans les systèmes délicats change le focus. La température doit être réglée avant de choisir les points d'acquisition. Le changement de température lors de l'acquisition va perturber l'imagerie et se traduira par une perte de concentration. Nous laissons notre système de microscope s'équilibrer pendant 2 heures à la température désirée avant l'imagerie.
   3. Colliers de correction: les objectifs sont livrés avec une bague de correction permettantl'objectif à régler pour une donnée lamelle épaisseur. Il est recommandé de réglage de la bague de correction lors de l'utilisation de billes fluorescentes de visualiser la fonction d'étalement de point. Cela permettra d'assurer réglages corrects pour chaque échantillon.
   4. Porte-échantillons stables: nous constatons que la plupart des porte-échantillons disponibles dans le commerce sont la partie la plus faible du microscope. Ils sont souvent bancal et pas droite. C'est une catastrophe pour la haute résolution, multi-point l'imagerie 4D. Nous concevons nos propres porte-échantillons qui sont droites et sont correctement installées sur la scène. Ils peuvent également être boulonnés en cas de besoin.
   5. Multi-point d'acquisition: notre système d'imagerie est équipé du Nikon "focus parfait" système, qui est essentiellement une base de laser auto-focus mécanisme. Cependant, l'autofocus n'est pas nécessairement nécessaire avec l'imagerie 4D, surtout si le système ne dérive pas beaucoup.

4. Imagerie

1. Allumez le système: lasers, scène, contrôleur, appareil photo et compulogiciel ter.
2. Placez la plaque sur le support stade, bien fixé et stabilisé.
3. Utilisez le port œil pour déterminer la position et l'orientation de la levure.
4. Utilisation clair, évaluer la santé et la viabilité cellulaire en fonction de la forme et de la texture.
5. Allumez la lumière à fluorescence selon le fluorophore pertinentes (par exemple filtre FITC pour la GFP), et de se concentrer sur les cellules présentant le phénotype qui est soumise à votre recherche. Des cellules qui sont hautement fluorescent à une longueur d'onde plus peuvent être déchargées et par conséquent autofluorescente. Nous visualisons le noyau avec un fluorophore tdTomato fusionnée à un signal NLS de SV40 (NLS-PTF). PTF est deux fois la taille de la GFP, et donc au-dessus de la limite de diffusion du noyau, donc il fonctionne très bien comme un marqueur nucléaire. On peut aussi exciter la PTF avec un vert (488 nm) laser en même temps que la GFP, mais capter les émissions vert et rouge en deux PMT séparés pour la résolution spectrale.
6. Réglez les paramètres suivants pour réduire le bruitet de sursaturation:
   1. Puissance du laser - photoblanchiment et de phototoxicité vs luminosité de l'image doit être envisagée.
   2. Gain: affecte sensibilité de la caméra, ce signal sur bruit.
   3. Diamètre Sténopé - doit être ajusté en fonction du laser avec la plus courte longueur d'onde. Le diamètre détermine l'épaisseur sténopé (hauteur) de la section optique imagée. Ainsi, l'ouverture du sténopé permettra de recueillir plus de lumière (photons dans plus de laisser), mais diminue la résolution en z (moins confocalité).
7. Conseils utiles:
   1. Si différents fluorophores émettent longueur d'onde congruent, utilisez la fonction de détection spectrale qui permet le choix des filtres virtuels. Gardez à l'esprit que les détecteurs spectraux sont moins sensibles que les PMT réguliers.
   2. Si différents fluorophores sont excités par le même laser, utilisez la fonction de numérisation en ligne.
   3. Un scanner Galvano permet une plus grande sensibilité, mais il a un risque plus élevé de photoblanchiment. Un scanner de résonance permet d'accélérer unecquisition, réduisant ainsi le risque de photoblanchiment, mais est moins sensible.
   4. En moyenne entre 2 et 16 images, il améliore le rapport signal sur bruit, mais rend l'acquisition plus lente et, bien sûr, implique une plus grande exposition de l'échantillon au laser.
   5. Durée de l'acquisition dépend de la question biologique (par exemple JUNQ et la formation IPOD prend environ 2 h). Nous avons imagé la levure avec le scanner de résonance pour un maximum de 30 heures en 3D time-lapse.
   6. Time Lapse intervalles plus petits intervalles-va créer un film plus cohérent mais peut causer des photoblanchiment et donc une perte de signal.

Résultats

Figure 1. Modèle. Compartimentation subcellulaire des protéines mal repliées mécanisme de contrôle de la qualité dirige les protéines mal repliées dans des compartiments distincts ayant des fonctions distinctes: les protéines solubles, destinés à la dégradation, l'objet d'un poly-ubiquitination et sont envoyés au compartiment Ju XTA-N NUCLEAIRE Q ualité de commande (JUNQ ). Protéines insolubles qui ne peuvent pas être ubiquitine sont envoyés pour la séquestration de protection de la I nsoluble Pr otein eposit D (FIFO), à côté de la vacuole, où ils subissent l'agrégation actif.

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Figure 2. Mauvais repliement des protéines modélisation avec GFP-Ubc9 ^ts. Dans des conditions normales, la GFP-Ubc9 ^ts (vert) est nativement plié, et est localisée de manière diffuse dans le noyau et le cytoplasme. Le noyau est marqué par NLS-PTF (rouge). Expression de Ubc9 ^ts a été coupée par l'addition de 2% de glucose avant l'imagerie dans toutes les expériences. Cliquez ici pour agrandir la figure .

1. Sur le décalage de la température à 37 ° C, GFP-Ubc9 ^ts (vert) est mal pliée et forme Foci stress cytosolique. Le noyau est marqué par NLS-PTF (rouge).
2. Lors de la récupération de choc thermique à 23 ° C, le thermiquement dénaturée GFP-Ubc9 ^ts est dégradé, comme indiqué par le niveau de fluorescence diminue.
3. Sur le décalage de la température à 37 ° C et l'inhibition du protéasome MG132 de 80 mm, GFP-U BC9 ^ts est mal pliée et transformée en JUNQ et inclusions IPOD. Le noyau est marqué par NLS-PTF (rouge).
4. Sur le décalage de la température à 37 ° C et l'inhibition de l'ubiquitination, GFP-Ubc9 ^ts est mal repliées et transformé en l'inclusion IPOD. Le noyau est marqué par NLS-PTF (rouge). La protéase ubiquitine 4 (Ubp4) est surexprimé à bloquer Ubc9 ubiquitination ^ts.

Figure 3. Time lapse de JUNQ et la formation IPOD. Après changement de température à 37 ° C et l'inhibition du protéasome MG132 de 80 mm, la GFP Ubc9 foyers stress ^ts sont transformées en JUNQ et inclusions IPOD. Le noyau est marqué par NLS-PTF (rouge). Des images en 3D ont été acquises à des intervalles de 4 min. (Voir aussi Vidéo 1).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir la figure.

Discussion

Nos intuitions sur les processus biochimiques tirer des expériences paillasse dans lequel une solution bien mélangée de réactifs et de produits est autorisé à atteindre l'équilibre dans un bécher. Dans un tel contexte, la concentration d'une espèce chimique donnée peut être exprimée par un seul nombre, qui est le rapport d'une quantité molaire de molécules dans un volume macroscopique. Une grande partie de ce que nous savons à propos de la structure des protéines et la fonction découle de l'utilisation de méthodes qui reflètent le classique, image réaction en masse: western blots, des centrifugations, et les mesures spectrophotométriques effectuées sur des extraits de homogénats de populations entières de cellules.

Comme la technologie que nous utilisons pour observer les cellules sous un grossissement améliore à pas de géant, il devient de plus en plus clair que les conditions dans lesquelles la plupart des réactions biochimiques se déroulent in vivo portent seulement la moindre ressemblance avec ceux du scénario de paillasse classique. Non seulement l'intérieur de la cella dense environnement, dans lequel les effets d'éviction modifier substantiellement les activités de divers réactifs, il est également tout à fait à l'opposé de bien mélangée. C'est ce qui explique la disparité fréquente entre in vitro et in vivo l'efficacité d'un large éventail de réactions complexes macromoléculaires.

Nulle part sont des intuitions issues de la musique classique dans des expériences biochimiques in vitro plus enclins à induire en erreur quant aux questions relatives à la dans le repliement in vivo, mauvais repliement et l'agrégation des protéines. Alors que les études de chimie des protéines dans les réactions en vrac peut traiter la question de pliage pour une protéine donnée comme un simple oui ou par non, toute tentative de suivre la dynamique des populations entières de macromolécules dans une cellule vivante doit être sensible à la distribution de l'ensemble possible conformationnels résultats disponibles pour une chaîne polypeptidique, et en particulier pour le risque de mauvais repliement et l'agrégation. Par exemple, nous pourrions examiner une cellule ment en vracsate agrégation d'une protéine par Western blot, et de déterminer que la protéine est essentiellement insoluble et non ubiquitinée. Cependant, dans la cellule vivante d'un discret sous-population de la protéine, difficile à détecter quand la moyenne sur de nombreuses cellules, peuvent être solubles et ubiquitinée dans un compartiment particulier lorsque la concentration locale de l'espèce est extrêmement élevé. Ce dernier scénario pourrait avoir des conséquences plus importantes pour la viabilité de la cellule que la plus grande masse sous-population. En outre, alors que les accompagnateurs présentent une variété de comportements pléiotropes et fonctions in vitro, il devient évident que, dans la cellule de leurs fonctions discrètes sont spatialement et temporellement limité.

Dans le nouveau paradigme pour comprendre la biochimie, la concentration devient une propriété de variable spécifique de chaque nano-environnement dans la cellule, et les événements moléculaires qui sous-tendent les processus biologiques doivent être analysés non seulement dans le temps, mais aussi dans space. L'approche d'imagerie 4D présentée ici permet la modélisation sensible du mauvais repliement des protéines dans les cellules vivantes, même si elle peut être utilisée pour étudier un certain nombre d'autres processus biologiques et la façon dont ils sont réglementés dans l'espace, le temps et la suite de changements dans les conditions environnementales. Dans ce document, nous utilisons le capteur ^ts Ubc9 pliage, ce qui montre bien les étapes et les options pour faire face à l'apparition de l'agrégation des protéines dans le cytosol. En plus d'illustrer la biologie cellulaire de contrôle de la qualité d'agrégation, cette approche peut servir comme un outil puissant pour déchiffrer l'effet des perturbations ou des mutations génétiques sur protéostasie (par exemple Ubc9 ^ts peut être utilisé pour mesurer le stress repliement des protéines en réponse à l'oxydation, l'expression d'un agrégat toxique, ou des mutations dans la voie de contrôle de la qualité).

L'imagerie 4D est également essentiel pour déterminer avec précision la localisation des protéines ou colocalisation entre deux protéines différentess, et pour détecter des phénomènes qui peut être transitoire mais importante. Par exemple, surtout dans un petit organisme sphérique comme la levure, il peut sembler être le cas que d'une structure ou d'un agrégat possède localisation juxtanucléaire, alors que l'imagerie 4D peut révéler que ce n'est tout simplement un artefact de l'angle de l'inspection.

Dans l'expérience par exemple que nous présentons ici, nous démontrons l'utilisation d'un modèle mal repliées des protéines, Ubc9 ^ts, de suivre l'agrégation contrôle de la qualité au fil du temps et de l'espace dans le cytosol. À la température permissive, Ubc9 ^ts est pliée et diffusé dans le cytosol et le noyau. Lors de la chaleur induite par repliement, il forme d'abord rapidement diffuser des petits foyers de stress globaux qui sont traitées à la dégradation par le protéasome. Lorsque le protéasome est inhibée partiellement, ces foyers de tension sont convertis en JUNQ et inclusions IPOD au cours de l'ordre de 2 h. Si l'ubiquitine dégradation n'est pas disponible comme une option de contrôle de la qualité, Ubc9 ^ts est ré-acheminé immédiatement à l'inclusion IPOD pour l'agrégation de protection. Ces outils offrent des possibilités incroyables à découvrir de nouveaux facteurs génétiques impliqués dans le contrôle de la qualité d'agrégation, et d'étudier leur régulation spatiale et temporelle dans la cellule.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MG132	Mercury	mbs474790
con A	Sigma	C2010
Plaques à fond en verre	ibidi	ibd81158
4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Des films 3D confocaux ont été acquis à l’aide d’un microscope Nikon A1R-si équipé d’une platine piézoélectrique (MCL) PInano, à l’aide d’un objectif à eau 60x NA 1,27, tranches de 0,3 micron, puissance laser de 0,5 % (à partir d’un laser 488 de 65 mW et d’un laser 561 de 50 mW). Les piles z ont été acquises toutes les 5 minutes pendant 90 min. Chaque série z a été acquise avec une taille de pas de 0,5 micron et un total de 30 pas. Le traitement de l’image a été effectué à l’aide du logiciel NIS-Elements.