Ex Vivo globules rouges Assay Hémolyse pour l'évaluation des pH-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique Biomacromolecular

Résumé

Un essai d'hémolyse ne peut être utilisée comme rapide, à haut débit écran de cytocompatibilité systèmes d'administration de médicaments et de l'activité de la livraison des marchandises endosomolytique intracellulaire. Le test mesure la perturbation des membranes des érythrocytes en fonction du pH de l'environnement.

Résumé

Bicouches de phospholipides qui constituent endo-lysosomal vésicules peuvent constituer un obstacle à la livraison de médicaments biologiques à des cibles intracellulaires. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de transporteurs de drogues synthétiques ont été conçus pour une perturbation active de la membrane de l'endosome et livrer de la marchandise dans le cytoplasme. Ici, nous décrivons le test d'hémolyse, qui peut être utilisé aussi rapide et à haut débit pour l'écran et l'activité cytocompatibilité endosomolytique des systèmes de délivrance de médicaments intracellulaires.

Dans l'essai d'hémolyse, des globules rouges humains et des matériaux de test sont co-incubés dans des tampons à des pH définies, qui imitent extracellulaires début endosomes, et la fin de l'endo-lysosomiaux environnements. Après une étape de centrifugation à granulés de globules rouges intacts, la quantité d'hémoglobine libérée dans le milieu est mesurée par spectrophotométrie (405 nm pour la gamme plus dynamique). La perturbation pour cent des globules rouges est ensuite quantifié par rapport au contrôle positif sampLes lysées avec un détergent. Dans ce système, le modèle de la membrane du globule rouge sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Le résultat souhaité est l'hémolyse négligeable à pH physiologique (7,4) et une hémolyse robuste dans la gamme de pH endo-lysosomal d'environ 5 à 6,8 pH.

Introduction

Bien qu'il existe de nombreux potentiels à fort impact cibles thérapeutiques à l'intérieur de la cellule, la délivrance intracellulaire d'agents pose un défi de taille. Souvent, les médicaments, les produits biologiques, en particulier sont internalisés par les cellules et la traite dans des vésicules qui soit conduire à une dégradation de leur contenu par la voie endo-lysosomal, ou la navette de retour hors de la cellule par exocytose. ¹ Dans ce dernier procédé, le pH interne des vésicules est acidifiée à environ 5-6, qui est le pH optimal pour l'activité des enzymes qui agissent dans ce compartiment, tel que le lysozyme. ²

Protocole

1. Préparation et stérilisation des tampons et des agents de test

1. NaCl 150 mM tampon: dissoudre 4,383 g de cristaux de NaCl dans 500 ml d'eau nanopure.
2. Tampons pH: Préparation des tampons phosphate à pH 5,6, 6,2, 6,8, et 7,4 en mélangeant des quantités appropriées d'monobasique et de phosphate de sodium dibasique. Si les échantillons doivent être testés à des valeurs de pH plus faibles (c.-à pH <5,6), puis un tampon plus approprié, comme un tampon citrate, doit être utilisé. Recettes tampons sont facilement disponibles, et une référence par exemple a été fourni ici ^12.
3. Stériliser tous les tampons indiquées ci....

Résultats

Typiquement, les agents qui présentent idéal dépendante du pH comportement hémolytique ont le plus grand potentiel pour la livraison de médicaments cytosolique, des acides nucléiques ou d'autres molécules bioactives. Ceci est illustré par l'agent n ° 1 comme représenté à la figure 2, qui présente une hémolyse minimale à un pH de 7,4, mais une forte augmentation des comportements à hémolytique gammes de pH des endosomes (<6,5). Certains agents peuvent présenter des niveaux significatifs .......

Discussion

pH-sensible polymères ou d'autres agents conçus pour fonction endosomolytique peut être rapidement et efficacement sélectionnés en fonction de lyse des globules rouges à des valeurs de pH rencontrées dans l'endosome (figure 1; pH 6,8 - endosome précoce, pH 6,2 - endosome tardif, pH 5,6 - lysosome). ^14-17 dépendante du pH hémolyse a été utilisé pour cribler la capacité des transporteurs à la médiation de libération de médicaments endosomal biomacromolecular (peptides, par exemple,<.......

Matériaux

Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
BD Vacutainer - Tubes Vacutainer EDTA K2	Fisher Scientific	22-253-145	Pour la collecte de sang
BD Vacutainer Aiguilles de prélèvement sanguin, 20,5 calibre	Fisher Scientific	02-665-31	Pour la collecte de sang
BD Vacutainer Tube Holder / aiguille adaptateur	Fisher Scientific	22-289-953	Pour la collecte de sang
Marque BD Tampons d'alcool isopropylique	Fisher Scientific	13-680-63	Pour la collecte de sang
BD Vacutainer sans latex Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Pour la collecte de sang
L'acide chlorhydrique (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	Pour le réglage du pH de D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Contrôle positif
PBS Dulbecco	Invitrogen	14190
Nalgene Bouteille à usage unique stérile MF75-Haut Unité de filtration avec membrane SFCA	Fisher Scientific	09 à 740-44A
BD plaques à 96 puits, à fond plat, en polystyrène, de culture de tissu traité	Fisher Scientific	08 à 772-2C	Pour plaque de lecture à la fin de l'essai.
BD plaques à 96 puits, polystyrène à fond rond, de culture de tissu traité	Fisher Scientific	08-772-17	L'incubation de globules rouges avec des agents expérimentaux.