Ex Vivo globules rouges Assay Hémolyse pour l'évaluation des pH-sensibles agents endosomolytique pour la livraison des médicaments cytosolique Biomacromolecular

Résumé

Un essai d'hémolyse ne peut être utilisée comme rapide, à haut débit écran de cytocompatibilité systèmes d'administration de médicaments et de l'activité de la livraison des marchandises endosomolytique intracellulaire. Le test mesure la perturbation des membranes des érythrocytes en fonction du pH de l'environnement.

Résumé

Bicouches de phospholipides qui constituent endo-lysosomal vésicules peuvent constituer un obstacle à la livraison de médicaments biologiques à des cibles intracellulaires. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de transporteurs de drogues synthétiques ont été conçus pour une perturbation active de la membrane de l'endosome et livrer de la marchandise dans le cytoplasme. Ici, nous décrivons le test d'hémolyse, qui peut être utilisé aussi rapide et à haut débit pour l'écran et l'activité cytocompatibilité endosomolytique des systèmes de délivrance de médicaments intracellulaires.

Dans l'essai d'hémolyse, des globules rouges humains et des matériaux de test sont co-incubés dans des tampons à des pH définies, qui imitent extracellulaires début endosomes, et la fin de l'endo-lysosomiaux environnements. Après une étape de centrifugation à granulés de globules rouges intacts, la quantité d'hémoglobine libérée dans le milieu est mesurée par spectrophotométrie (405 nm pour la gamme plus dynamique). La perturbation pour cent des globules rouges est ensuite quantifié par rapport au contrôle positif sampLes lysées avec un détergent. Dans ce système, le modèle de la membrane du globule rouge sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Le résultat souhaité est l'hémolyse négligeable à pH physiologique (7,4) et une hémolyse robuste dans la gamme de pH endo-lysosomal d'environ 5 à 6,8 pH.

Introduction

Bien qu'il existe de nombreux potentiels à fort impact cibles thérapeutiques à l'intérieur de la cellule, la délivrance intracellulaire d'agents pose un défi de taille. Souvent, les médicaments, les produits biologiques, en particulier sont internalisés par les cellules et la traite dans des vésicules qui soit conduire à une dégradation de leur contenu par la voie endo-lysosomal, ou la navette de retour hors de la cellule par exocytose. ¹ Dans ce dernier procédé, le pH interne des vésicules est acidifiée à environ 5-6, qui est le pH optimal pour l'activité des enzymes qui agissent dans ce compartiment, tel que le lysozyme. ²

Récemment, un certain nombre de matériaux ont été spécialement conçues pour tirer parti de l'acidification des endosomes pour faciliter la distribution cytosolique de leur cargaison. Un exemple de cette approche utilise des nanoparticules de polymères synthétiques, des micelles dont l'activité principale est zwitterionique et charge neutre au pH physiologique (c. 7.4). Cependant, à pH 6,0- 6,5, les polymères deviennent protonés et acquérir une charge positive nette qui déstabilise le noyau des micelles, et les segments de polymère exposées interagir avec et désorganiser la membrane de l'endosome. Cette activité a été montré pour favoriser l'évasion endosomal des peptides et des acides nucléiques thérapeutiques à base leur permettant d'accéder à leurs cibles cytosoliques. ^3,4 D'autres exemples de méthodes élaborées pour servir de médiateur évasion endosomal qui perturbent la barrière de la membrane comprennent fusogènes '«peptides ou protéines qui peuvent médier la fusion membranaire ou transitoire formation de pores dans la bicouche phospholipidique. ⁵ Homopolymères de anioniques acides acryliques d'alkyle tels que le poly (acide propylacrylique) sont une autre approche bien étudiée, et dans ces polymères, l'état de protonation de l'acide carboxylique pendant dicte transition dans un hydrophobe, membrane interruption de l'État dans des gammes de pH endo-lysosomal. ^6,7

Un système modèle utile pour le criblage comportement endosomolytique est l'ex dépendante du pH in vivo hémolyse dosage. ⁸ Dans ce système modèle, la membrane érythrocytaire sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Ce modèle généralisable a été utilisé par d'autres pour évaluer le comportement endosomolytique des peptides de pénétration cellulaire et d'autres polymères de systèmes de transfert de gènes. ^8-11 Dans cette expérience, les globules rouges humains et matériels de test sont co-incubées dans des tampons à des pH définis qui imitent extracellulaires (7,4), au début des endosomes (6,8), et la fin de l'endo-lysosomal (<6,8) environnements. La quantité d'hémoglobine libérée au cours de la période d'incubation est quantifié comme une mesure de la lyse des globules rouges, qui est normalisée à la quantité d'hémoglobine libérée dans les échantillons témoins positifs lysées avec un détergent.

De criblage d'une petite bibliothèque de matériaux d'essais potentiellement endosomolytiques, on peut en déduire que les échantillons qui produisent aucune hémolyse à pH 7,4, mais l'ourlet significativement élevéolysis à pH <6,5, seront les candidats les plus efficaces et cytocompatible pour l'administration de médicaments cytosolique. Les matériaux qui répondent à ces critères on peut s'attendre à rester inerte et non pas aveuglément détruire membranes bicouches lipidiques (c. qui pourrait provoquer une cytotoxicité) avant d'être exposé à une baisse du pH local après internalisation dans l'endo-lysosomal compartiments.

Dans ce protocole, les érythrocytes sont isolés à partir d'un donneur humain et co-incubée à pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 avec expérimentales endosomolytiques agents de délivrance de médicaments. Érythrocytes intacts sont culottées, et les surnageants (contenant de l'hémoglobine libérée des érythrocytes lysés) sont analysés pour l'absorbance caractéristique de l'hémoglobine par l'intermédiaire d'un lecteur de plaque (figure 1).

Protocole

1. Préparation et stérilisation des tampons et des agents de test

1. NaCl 150 mM tampon: dissoudre 4,383 g de cristaux de NaCl dans 500 ml d'eau nanopure.
2. Tampons pH: Préparation des tampons phosphate à pH 5,6, 6,2, 6,8, et 7,4 en mélangeant des quantités appropriées d'monobasique et de phosphate de sodium dibasique. Si les échantillons doivent être testés à des valeurs de pH plus faibles (c.-à pH <5,6), puis un tampon plus approprié, comme un tampon citrate, doit être utilisé. Recettes tampons sont facilement disponibles, et une référence par exemple a été fourni ici ^12.
3. Stériliser tous les tampons indiquées ci-dessus à travers un appareil sur flacon vide filtration et re-vérifier tampon de pH.
4. 20% de Triton X-100 (contrôle positif): Mélanger 20 ml pur Triton X-100 dans 80 ml d'eau nanopure. Vortex vigoureusement et sonication à se dissoudre. Laisser à température ambiante pendant une nuit avant de l'utiliser.

2. Préparation des érythrocytes

1. Obtenir 25 ml de sang from un donateur anonyme humaine, tirées directement dans des tubes Vacutainer K _2-EDTA recouvertes pour éviter la coagulation.

REMARQUE: Toutes les procédures doivent être approuvés au préalable par le comité d'examen institutionnel approprié (CISR) et ponction veineuse et de prélèvement sanguin doit être effectué par un préleveur formé afin de minimiser le risque pour le donneur. Les procédures standards de saignée ont été publiés ailleurs ^13.

2. Centrifuger le sang à 500 xg pendant 5 min, et les niveaux d'hématocrite marque (rouge, couche inférieure) et le plasma (jaunâtre, couche supérieure) sur le tube.
3. Aspirer doucement le plasma par l'intermédiaire d'une micropipette, ajouter dans l'eau de Javel, et jeter dans les déchets biologiques.
4. Remplir le tube à hématocrite ligne marquée (niveau initial du plasma) avec une solution de NaCl 150 mM. Cap et la retourner plusieurs fois pour mélanger doucement. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min.
5. Répétez l'étape 2.3 à 2.4 pour laver les globules nouveau. Puis aspirer supernatfourmi et remplacez-le par du PBS à pH 7,4. Mélanger par inversion.
6. Fractionner le sang uniformément dans quatre tubes, chacun correspondant à un pH qui va être testée. Etiqueter les tubes en fonction de chaque pH à tester (5,6, 6,2, 6,8, 7,4).
7. Centrifuger les tubes de sang à 500 xg pendant 5 min. Marquer les niveaux sur les tubes, puis aspirer le surnageant.
8. Remplir chaque tube à la ligne marquée avec un tampon de pH approprié (comme indiqué au point 2.6).
9. Étiquette quatre tubes de 50 ml coniques (un par unité de pH à l'essai), et une pipette 49 ml de PBS de pH approprié dans chaque tube conique.
10. Ajouter 1 ml d'érythrocytes (même pH) dans le tube correspondant à une dilution de 1:50. Inspectez visuellement le sang dilué, ce qui devrait être trouble et se déposeront si on les laisse tranquille. Si aucun formulaire à granulés, les cellules ont lysées.

3. Essai de lyse 96 Réglages Plate bien et quantification

1. Préparer les solutions mères de tous les agents d'administration de médicaments expérimentaux, à 20x la concentration finale désirée à tester (testaura 10 ul d'agent de l'administration de médicaments + 190 pl dilué globules rouges, conduisant à une dilution de 1/20 de l'agent de l'administration de médicaments d'origine dans le mélange d'essai final). Stocks de 20, 100 et 800 pg / ml sont proposés, ce qui entraîne des concentrations d'essai finales de 1, 5 et 40 ng / ml, respectivement.
2. Pipeter 10 ul de chaque solution mère dans V-bottom plaques à 96 puits. Pour des résultats optimaux, chargez chaque échantillon en triple ou quadruple.

REMARQUE: Pour plus de facilité, il est recommandé qu'un séparée plaque de 96 puits doit être préparé pour chaque pH à tester, à chaque échantillon (pour chaque concentration) chargé à n = 3-4 par plaque.

3. Pour les puits de contrôle positif, ajouter 10 ul de Triton 20% X-100.
4. Pour les puits de contrôle négatif, ajouter 10 ul de tampon phosphate. Utiliser un tampon au même pH à tester.
5. Pipeter 190 pi d'érythrocytes dilué (voir 2.10) à chaque puits, en s'assurant que la solution mère cellule restehomogène au cours du transfert. Astuce: Utilisez pipette multi-canaux pour simplifier cette tâche.
6. Incuber les plaques à 37 ° C pendant une heure (en option: Utiliser un agitateur orbital ou à bascule).
7. Centrifuger les plaques pendant 5 min à 500 xg à granulés érythrocytes intacts. Remarque: lorsque vous retirez la plaque de la centrifugeuse et le transporter à l'étape suivante, à manipuler avec précaution et être certain de ne pas perturber le culot cellulaire.
8. En utilisant une pipette multicanaux, transférer 100 ul de surnageant de chaque puits dans un cadre clair, à fond plat de 96 puits. Remarque: si le culot cellulaire est agité accidentellement pour n'importe quel échantillon (s), on peut re-centrifuger la plaque, puis procéder au transfert de surnageant.
9. Mesurer l'absorbance des surnageants avec un lecteur de plaques. Notez que toute une gamme de longueurs d'onde peuvent être utilisés (400 - 541 nm).

REMARQUE: les lecteurs de plaques différentes peuvent avoir des points de saturation et des sensibilités différentes, de sorte que le choix d'une longueur d'onde pour moiasurements dépend de si oui ou non les données hémolyse des échantillons expérimentaux peuvent être normalisés de manière fiable l'hémolyse maximale induite par traitement avec un détergent. Cela nécessite une mesure précise des valeurs d'absorbance des échantillons témoins positifs.

10. Utilisation de Microsoft Excel ou un logiciel similaire des données d'analyse, trouver le moyen de les lectures d'absorbance de fond portant sur les échantillons témoins négatifs mis en place pour chaque pH (étape 3.4). Soustraire cette valeur d'absorbance de fond de tous les autres échantillons qui ont été mesurés à ce pH.
11. Après soustraction de fond, trouver l'absorbance moyenne du contrôle positif de détergent échantillons traités (étape 3.3). Puis normaliser tous les points de données expérimentales à cette valeur moyenne de l'absorbance, ce qui devrait représenter 100% d'hémolyse. Enfin, il faut multiplier chaque valeur et de 100% pour calculer% d'hémolyse qui s'est produite dans chaque puits par rapport au témoin détergent.

Résultats

Typiquement, les agents qui présentent idéal dépendante du pH comportement hémolytique ont le plus grand potentiel pour la livraison de médicaments cytosolique, des acides nucléiques ou d'autres molécules bioactives. Ceci est illustré par l'agent n ° 1 comme représenté à la figure 2, qui présente une hémolyse minimale à un pH de 7,4, mais une forte augmentation des comportements à hémolytique gammes de pH des endosomes (<6,5). Certains agents peuvent présenter des niveaux significatifs ...

Discussion

pH-sensible polymères ou d'autres agents conçus pour fonction endosomolytique peut être rapidement et efficacement sélectionnés en fonction de lyse des globules rouges à des valeurs de pH rencontrées dans l'endosome (figure 1; pH 6,8 - endosome précoce, pH 6,2 - endosome tardif, pH 5,6 - lysosome). ^14-17 dépendante du pH hémolyse a été utilisé pour cribler la capacité des transporteurs à la médiation de libération de médicaments endosomal biomacromolecular (peptides, par exemple,<...

Matériaux

Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
BD Vacutainer - Tubes Vacutainer EDTA K2	Fisher Scientific	22-253-145	Pour la collecte de sang
BD Vacutainer Aiguilles de prélèvement sanguin, 20,5 calibre	Fisher Scientific	02-665-31	Pour la collecte de sang
BD Vacutainer Tube Holder / aiguille adaptateur	Fisher Scientific	22-289-953	Pour la collecte de sang
Marque BD Tampons d'alcool isopropylique	Fisher Scientific	13-680-63	Pour la collecte de sang
BD Vacutainer sans latex Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Pour la collecte de sang
L'acide chlorhydrique (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	Pour le réglage du pH de D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Contrôle positif
PBS Dulbecco	Invitrogen	14190
Nalgene Bouteille à usage unique stérile MF75-Haut Unité de filtration avec membrane SFCA	Fisher Scientific	09 à 740-44A
BD plaques à 96 puits, à fond plat, en polystyrène, de culture de tissu traité	Fisher Scientific	08 à 772-2C	Pour plaque de lecture à la fin de l'essai.
BD plaques à 96 puits, polystyrène à fond rond, de culture de tissu traité	Fisher Scientific	08-772-17	L'incubation de globules rouges avec des agents expérimentaux.