Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d'analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Résumé

Un protocole d'analyse de suivi de nanoparticules (NTA) et cytométrie de flux à haut débit afin d'évaluer polymères nanoparticules de transfert de gènes est décrite. NTA est utilisé pour caractériser la distribution des tailles de particules des nanoparticules et la distribution de particules de plasmide par. Cytométrie en flux à haut débit permet l'évaluation quantitative efficacité de transfection pour une bibliothèque de biomatériaux de transfert de gènes.

Résumé

Transfert de gènes non viral en utilisant des nanoparticules polymériques est apparue comme une approche intéressante pour la thérapie génique pour traiter les maladies génétiques ¹ et comme une technologie pour la médecine régénérative ^2. Contrairement aux virus, qui ont des problèmes de sécurité importants, des nanoparticules polymériques peuvent être conçus pour être non-toxique, non-immunogène, non mutagène, plus faciles à synthétiser chimiquement polyvalent, capable de transporter plus de fret acide nucléique et biodégradable et / ou soucieux de l'environnement. Polymères cationiques s'auto-assembler à l'ADN chargé négativement par l'intermédiaire d'une interaction électrostatique pour former des complexes de l'ordre de 100 nm qui sont communément appelées nanoparticules polymériques. Des exemples de biomatériaux utilisés pour former l'échelle nanométrique des nanoparticules polycationiques de transfert de gènes comprennent la polylysine, polyphosphoesters, le poly (amidoamines) s et polyéthylènimine (PEI), ce qui est un non-dégradable off-the-shelf polymère cationique couramment utilisé pour la délivrance d'acides nucléiques ^1,3. Poly (bêta-aminoester) s (PBAEs) sont une nouvelle classe de polymères cationiques ⁴ qui sont hydrolytiquement dégradable et ^5,6 ont été montré pour être efficace au transfert de gènes à des types cellulaires difficiles à transfecter comme les cellules endothéliales rétiniennes humaines (HREC) ^7, les cellules épithéliales mammaires de souris ^8, les cellules humaines de cancer du cerveau ⁹ et macrovasculaires (veine ombilicale humaine, HUVEC) des cellules endothéliales ^10.

Un nouveau protocole pour caractériser des nanoparticules polymériques en utilisant des nanoparticules d'analyse de suivi (NTA) est décrite. Dans cette approche, tous les deux la distribution granulométrique et la distribution du nombre de particules par les plasmides sont obtenus ^11. En outre, un haut débit de dosage de 96 puits de transfection plaque pour le dépistage rapide de l'efficacité de transfection des nanoparticules polymériques est présenté. Dans ce protocole, le poly (bêta-amino ester) s (PBAEs) sont utilisés en tant que polymères de l'homme et des modèles de cellules endothéliales rétiniennes (HREC) sont utilisés comme mocellules del humains. Ce protocole peut être facilement adapté pour évaluer une nanoparticule polymère et n'importe quel type cellulaire d'intérêt dans un format de plaque multi-puits.

Introduction

La détermination du nombre de plasmides complexés par nanoparticule est important de concevoir des nanoparticules efficaces des stratégies de transfert de gènes, en particulier pour la co-délivrance de plasmides multiples à la même cellule cible, comme il est souvent nécessaire dans les cellules souches reprogrammation des études ^12. Quelques approches pour calculer le nombre de plasmides associés à une nanoparticule unique ont été décrites, et chaque approche présente des inconvénients dans les techniques utilisées pour l'estimation de ^13-16. Quantum dot (QD) combiné avec l'étiquetage TEM a été utilisée pour estimer les plasmides par des particules de chitosane à base de nanoparticules. Estimation avec cette technique QD est compliquée en raison de la nécessité pour marquer l'ADN, ce qui peut altérer ses propriétés d'auto-assemblage, la possibilité que l'ADN encapsulé sans étiquette n'est pas directement détectée; plasmides potentiellement se chevauchent et QDS dans les images TEM 2D de particules, et d'autres hypothèses simplificatrices ^13. Une autre approche qui est unepplicable quand microdomaines ordonnés existent dans les particules a été utilisée pour étudier Lipopolyamine-ADN par cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET), diffraction des rayons X et diffusion de lumière dynamique (DLS) ^14,15. Malheureusement, les matériaux tels que les nanoparticules polymériques étudiés ici ne sont pas applicables à cette méthode. . Dans une autre étude, Collins et al ont utilisé une particule flux de l'analyse d'image technique pour étudier (Lys) _{16-peptidiques} contenant / ADN, mais leur méthode ne peut évaluer plus, particules microniques ^16. Ainsi, nous avons récemment mis au point un nouveau test et flexible afin de quantifier le nombre de plasmides par nanoparticule ^11.

Protocole

1. L'ensemencement de cellules

1. Ne pas permettre aux cellules de se développer à overconfluency. Utilisez le passage des cellules au début quand la transfection de cellules primaires.
2. Vingt-quatre heures avant la transfection, les cellules trypsiniser, compter le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre, et diluer la suspension cellulaire avec les médias pour atteindre la densité cellulaire désirée (cellules / volume). Cellules de semences dans les tissus clairs culture traitée à fond plat de 96 puits des plaques en utilisant un réservoir et pipettes multicanaux. La densité choisie devrait donner 70-80% de confluence le jour de la transfection. Par exemple, comme le montre le tableau 1, les cellules ont été diluées de 25 à 50 cellules / ul pour les données de transfection présentés ici.

2. La transfection de cellules

1. La dilution du polymère et les stocks d'ADN. Décongeler polymère et les solutions mères d'ADN à température ambiante (RT). Diluer la solution mère de polymère et solution de l'ADN, séparément claires plaques à 96 puits en utilisant une pipette douze canaux, Avec un solvant approprié à des concentrations nécessaires pour obtenir le poids souhaité de polymère à des rapports pondéraux d'ADN (poids / poids). Dans ce cas, le solvant choisi est de 25 mM de tampon acétate de sodium (pH = 5,2).
   1. ADN dilution. Typiquement, l'ADN stocké à 1 mg / ml est dilué dans un tampon d'acétate de sodium à une concentration de 0,03 à 0,06 mg / ml dans une claire non traitée culture de tissus de 96 puits (un puits pour une formulation unique). Tableau 2 montre le protocole de dilution ADN typique pour une formulation unique utilisée pour transfecter des quatre puits répliqués dans une plaque de 96 puits ensemencés avec des cellules de l'étape 1.
   2. Dilution polymère. La 100 mg / ml de polymère / DMSO solution est diluée dans du tampon acétate de sodium selon la concentration nécessaire pour obtenir le polymère souhaité à l'ADN poids / poids rapport. La gamme de poids / poids ratios généralement utilisés pour la délivrance de gènes de poly (bêta-amino ester) s (PBAEs) est de 20 à 100. Polymères sont PBAE première diluée à 10 mg / ml, suivie de la dilution protocole comme indiqué dans le tableau 3. Les dilutions de polymère peut être réalisée dans un tissu transparent non-culture traitée plaque 96-puits qui correspond à l'orientation de l'échantillon de la plaque de dilution d'ADN.
2. Formation des nanoparticules. Ajouter la solution PBAE à un volume égal de la solution d'ADN plasmidique en utilisant une pipette douze canaux et mélanger vigoureusement. Laissez le mélange incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre l'auto-assemblage.
3. Transfection des nanoparticules. Après l'auto-assemblage, 20 pl nanoparticules sont ajoutés par puits goutte à goutte au milieu de culture à l'aide de la pipette douze canaux. Puits en double ne sont pas traitées ou sont transfectées avec des réactifs disponibles dans le commerce comme témoins. Les cellules transfectées sont incubées à 37 ° C pendant deux à quatre heures, puis les puits sont remplacés par du milieu frais (100 pl / puits). Le choix du temps d'incubation dépend de la lignée cellulaire, des conditions de culture et un système de transfection. La différence de transfectionl'efficacité et la toxicité pour les cellules par suite de faire varier la période d'incubation seront quantifiées par le protocole d'analyse décrite à l'étape 3.

3. Analyse de l'efficacité et de la toxicité cellulaire Transfection

Efficacité de la transfection est analysée visuellement avec un microscope à fluorescence et quantifiés à l'aide d'un cytomètre de flux 48 heures post-transfection. Toxicité cellulaire est analysée visuellement avec un microscope à fluorescence et quantifiés en utilisant la CellTiter 96 aqueuses Un essai de 24 heures après la transfection.

1. La microscopie à fluorescence. Analyser visuellement les puits pour l'expression du gène rapporteur transfectée (par exemple, l'EGFP ou DsRed) en utilisant le canal approprié fluorescence. Acquérir les images pour chaque puits, en choisissant des champs de vision que correctement représentent l'efficacité de transfection des formulations particulières (figure 1). Prenez note de toute toxicité cellulaire observée visuellement.
2. Cytométrie en flux.
   1. N'utiliser que des pipettes multicanaux pour préparer la plaque de 96 puits pour la cytométrie en flux. Laver avec du PBS, trypsiniser avec 30 ul / puits de trypsine / EDTA, neutraliser avec 170 ul de tampon FACS (PBS + 2% de FBS), une pipette de haut en bas dans chaque puits, y compris autour des bords, et de transférer la totalité de 200 ul volume de chaque puits dans les puits correspondants dans un fond rond ou en V 96 puits à fond plat.
   2. Centrifuger la plaque à 130 xg pendant 5 min à 4 ° C.
   3. Retirez les médias 170 ul de chacune des cellules ainsi la pipette pour remettre tout en évitant les bulles. Pour utiliser une viabilité tache comme l'iodure de propidium (PI), ajouter 10 ul de tampon FACS + PI (50:1 tampon FACS: PI dilution, la concentration actions PI 1 mg / ml) dans chaque puits. Immédiatement placer sur la glace et couvrir de la lumière.
   4. Démarrez le cytomètre en flux C6 Accuri, le HyperCyt de 96 puits de fixation, et le logiciel HyperView. Utilisez les onglets Conception et HyperView Protocole de choisir la p appropriéeType tard, disposition de la plaque, et d'autres paramètres tels que le tremblement / sip / rinçage / secouer de temps. Pour le protocole ci-dessus, les paramètres suivants ont été utilisés, un premier pré-plaque pendant une minute, et un tremblement de pré-plaque pendant 30 secondes à 2400 rpm. Temps d'aspiration a été fixée au 15 sec à 15 tours par minute, une sonde de rincer chaque puits pendant 2 secondes, et une inter-bien agiter toutes les 12 puits pendant 12 sec à 2400 rpm. La secousse inter-puits est important de garder les cellules dispersées dans les médias, ainsi que pour une meilleure capacité à traiter les données en incluant les pauses chronométrées entre les groupes de puits (dans ce cas, 12 secondes).
   5. Utilisez l'onglet HyperView identification Eh bien, pour traiter les données et séparées dans le puits approprié (Figure 2). Afin d'identifier les puits individuels, il peut aider à utiliser le filtre de bruit du logiciel, ainsi que notamment une base de même filtre dans les paramètres avancés.
   6. Quantifier le pourcentage de cellules vivantes positivement transfectées par déclenchement approprié de séparer pop différenteulations (figure 3). Première afficher les données de flux sur un diagramme de dispersion FSC vs SSC afin de séparer les cellules de débris (figure 3A). Si l'iodure de propidium (PI) a été utilisé, porte la population de cellules individuelles et estime que les données sur un terrain FSC vs FL3 afin de séparer les cellules vivantes des cellules mortes et les portes des cellules vivantes. Afin de quantifier le nombre de cellules transfectées, voir la population de cellules en direct sur les canaux appropriés, par exemple, la GFP peut être vu dans FL1. En utilisant la population traitée, porte les cellules non traitées afin de déterminer le signal de fond (Figure 3B). Les cellules transfectées de façon positive peut alors être isolé en utilisant cette grille et en visualisant les populations transfectées en utilisant à la fois la dispersion et tracés de contour (figure 3C et 3D). Il peut y avoir un continuum de cellules transfectées de façon positive, comme les cellules transfectées seront différentes à différents degrés de fluorescence.
3. CellTiter 96 aqueuses Un dosage
   1. Transfecter une autre plaque exactement de la même manière pour les mesures de toxicité cellulaire.
   2. Premix 1 ml de la solution d'essai CellTiter 96 aqueuse avec 10 ml Un milieu frais. Retirez le papier de cellules et utiliser une pipette multicanaux pour ajouter 110 ul de la solution prémélangée + média par puits.
   3. Mesurer l'absorbance à 490 nm chaque intervalle d'une heure de 1 à 4 heures jusqu'à ce que l'absorbance du puits avec la condition traitée est dans la gamme linéaire du dosage. Inclure les quatre puits de contrôle avec seulement des médias + la solution pour une lecture d'absorbance de fond.
   4. Les valeurs moyennes de l'absorbance des quatre puits répétés par condition et soustraire l'absorbance de fond moyenne de chaque moyenne. Normaliser la moyenne corrigée pour chaque affection traitée à la moyenne corrigée de l'état non traité afin de déterminer la viabilité cellulaire pour cent.

_title "> 4. nanoparticules Dimensionnement avec le NTA et le plasmide calculs particule par

1. Premier du système fluidique de l'NS500 NanoSight faisant fonctionner la pompe diluant avant à environ 1/5ème de la vitesse maximale et la pompe de prélèvement vers l'arrière à environ 1/10ème de la vitesse max. Continuer jusqu'à ce que le système fluidique est rincé avec du diluant.
2. Préparer les nanoparticules à analyser. Dans le cas de PBAEs, séparément diluer l'ADN plasmidique actions (1 mg / ml) et le stock PBAE (100 mg / ml) dans un tampon d'acétate de sodium (25 mM, pH 5) dans des tubes Eppendorf.
3. Diluer la concentration d'ADN plasmidique à 0,06 mg / ml. Concentration du polymère peut varier en fonction du poids requis rapport poids de polymère d'ADN (par exemple, pour 60 en poids / poids des particules de polymère est diluée à 3,6 mg / ml).
4. Ajouter la solution de polymère à un volume égal de la solution d'ADN plasmidique et mélanger vigoureusement. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes pour permettre l'auto-assemblage.
5. Dila solution de nanoparticules luth 100-pli dans du PBS pour que la concentration des nanoparticules à être dans la plage appropriée pour le NTA et d'obtenir un volume final de 500 pl au moins.
6. Chargez l'échantillon dans le NanoSight en plaçant le tube de chargement dans l'échantillon Eppendorf tube (figure 4A). Assurez-vous de ne pas introduire de bulles d'air.
7. Dans le mode de capture, augmenter le niveau de la caméra jusqu'à ce que les particules peuvent être vues. Réglez la mise au point afin que les particules aspect lisse (figure 4A et 4B).
8. En mode standard, réglez le niveau devant la caméra au point que toutes les particules peut être vu à l'écran. Puis diminuer le niveau de la caméra à la plus faible de telle sorte que les particules peuvent tous être encore observée. Si un niveau intermédiaire caméra est nécessaire, passez en mode avancé et modifier l'obturateur et de gagner des niveaux appropriés.
9. Contrôler visuellement pour s'assurer qu'il ya entre 20 à 100 particules sur la screen. Un nombre idéal pour le suivi des nanoparticules est d'environ 50 particules. S'il ya trop ou trop peu, rincez le NS500, ajuster la dilution dans du PBS, et re-charger l'échantillon.
10. Ajuster la durée de capture en fonction de la table de mode standard. Typiquement 30 - 60 sec est d'une longueur de capture approprié (figure 4B).
11. Pour charger l'échantillon suivant, rincer le système, puis re-charger le nouvel échantillon.
12. Une fois les vidéos sont capturées, passez à l'étape du traitement par l'ouverture d'un fichier vidéo.
13. Il ya un certain nombre de paramètres qui peuvent être réglés pour mieux traiter une vidéo (figure 4C). L'objectif est de sélectionner les paramètres qui conviennent le mieux capturer chaque particule à l'écran, comme indiqué par une croix rouge sur l'écran au-dessus de chaque particule (figure 5).
14. Augmenter le gain de l'écran pour mieux voir les particules. Dans le mode standard ou avancé, sélectionnez le réglage automatique des paramètres par ClickIng les cases appropriées. Dans le cas où les réglages automatiques ne suffisent pas à sélectionner des particules, décochez la case et définir manuellement les paramètres (figure 4C).
15. Une fois que toutes les particules sont cueillies à l'écran, cliquez sur le bouton processus du logiciel pour traiter le fichier vidéo (figure 4C). Ceci permet d'obtenir la distribution de taille des particules, de taille moyenne, ainsi que la concentration des particules.
16. Afin de s'assurer que la concentration en particules est exacte, changer la dilution PBS, par exemple en augmentant la dilution d'un facteur 2, et répétez la procédure ci-dessus. Mesure des dilutions multiples d'un même échantillon est recommandé de s'assurer que la mesure de la concentration de l'échantillon est exacte. Une bonne gamme de mesure est de 10 ⁷ -10 ⁹ particules / ml.
17. Vérifier que tous les plasmides sont incorporés dans des nanoparticules en exécutant l'électrophorèse sur gel de nanoparticules et d'évaluer si un ADN libre est présent.Si ce n'est pas tous les plasmides sont encapsulés, utilisez des techniques standard pour mesurer l'absorbance de l'ADN dans le but de quantifier total des plasmides encapsulés.
18. Pour calculer le nombre moyen de plasmides par particule, il faut diviser la concentration totale encapsulée plasmide par la concentration de NTA particule mesurée. Afin d'estimer le plasmide de distribution par échantillon de particules, utilisez d'abord l'histogramme NTA taille des particules pour calculer la fraction volumique de chaque bac 1-nm de particules. Multipliez cette répartition de la fraction de volume par la quantité totale de plasmide pour obtenir le nombre de plasmides par cellule. Diviser ces chiffres par le nombre de particules dans chaque cellule afin d'obtenir le nombre de plasmides-p-particule pour chaque taille de particules (figure 6).

Résultats

La figure 1 montre une image de microscopie à fluorescence d'un exemple d'une transfection réussie de HREC avec le plasmide EGFP. L'image en fond clair est utile de s'assurer que les cellules conservent leur morphologie habituelle. En outre, les tests de viabilité cellulaire, tels que MTS ou des tests similaires, peuvent être utilisés pour évaluer la toxicité des nanoparticules ^7. La cytométrie en flux, tel que décrit, peut être utilisé pour quantifier l'efficacité de la transfection. Lorsque...

Discussion

Les protocoles ci-dessus décrivent des méthodes pour évaluer l'efficacité de transfection des formulations de nanoparticules, ainsi que d'un moyen pour caractériser la taille des particules et de la charge des nanoparticules d'ADN. Le nombre de plasmides par des particules est un paramètre important qui peut aider à prédire l'efficacité de la particule et peut également être utilisé pour la détermination de la dose. Analyse de suivi de nanoparticules peut être effectuée dans une gamme de différentes solu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			Réactif
Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Trypsine	Invitrogen	25300
Un tampon d'acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S7899	Diluer à 25 mM dans de l'eau désionisée
Le diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP ADN	Biopharmaceuticals Elim	NA
ADN DsRed	Addgene	21718
Prince-Édouard, ramifié	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter 96 aqueuse une	Promega	G3580
			Matériels
Effacer fond plat de 96 puits, stérile	Sarstedt	82.1581.001
Effacer fond rond de 96 puits, stérile	Sarstedt	82.1582.001
12-canaux Finnpipette	Thermo Scientific	NA	5-50 et 50-300 ul
Microscope à fluorescence	Zeiss	NA	Numéro de modèle: AX10
Cytomètre en flux C6 Accuri	BD Biosciences	NA
Attachement HyperCyt	Intellicyt	NA
NS500	NanoSight	NA