L'implantation de cellules cancéreuses dans l'organe d'origine peut servir de modèle préclinique utile pour évaluer de nouvelles thérapies. Des cellules de carcinome de la vessie MB49 peuvent être cultivées à l'intérieur de la vessie après l'instillation intravésicale. Ce protocole illustre le cathétérisme de la vessie de la souris dans le but d'implantation de la tumeur et la livraison adénoviral.
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Article de méthode
Un modèle de cancer de la vessie orthotopique d'études livraison Gene
Dans cet article
Résumé
Résumé
cancer de la vessie est le deuxième cancer le plus fréquent de l'appareil génito-urinaire et de nouvelles approches thérapeutiques qui peuvent réduire la récidive et la progression sont nécessaires. Le micro-environnement de la tumeur peut influencer de manière significative le développement de la tumeur et la réponse thérapeutique. Il est donc souvent souhaitable de cultiver les cellules tumorales dans les organes dont ils sont issus. Ce protocole décrit un modèle orthotopique de cancer de la vessie, dans laquelle les cellules de carcinome de la vessie murin MB49 sont instillées dans la vessie par l'intermédiaire d'un cathétérisme. Implantation réussie de cellules tumorales dans ce modèle nécessite la rupture de la couche de glycosaminoglycane protectrice, qui peut être réalisé par des moyens physiques ou chimiques. Dans notre protocole de la vessie est traitée avec de la trypsine avant l'instillation de la cellule. Le cathétérisme de la vessie peut également être utilisé pour délivrer la thérapeutique une fois que les tumeurs sont établies. Ce protocole décrit la fourniture d'un produit de construction adenoviral qui exprime un gène rapporteur de la luciférase. Alors que our protocole a été optimisé pour les études à court terme et se concentre sur la livraison de gènes, la méthodologie de la souris cathétérisme de la vessie a de larges applications.
Introduction
cancer de la vessie est le deuxième cancer le plus fréquent de l'appareil génito-urinaire, avec près de 75 000 nouveaux cas et 15 000 décès attendus en 2012 1. Les taux élevés de récidive exigent vie suivi, ce qui rend le cancer de la vessie l'un des cancers les plus coûteuses à traiter. Cancer de la vessie qui a envahi la couche musculaire peut se métastaser dans le foie, le poumon ou l'os par l'intermédiaire du système lymphatique. Thérapie multimodale de tumeurs avancées résultats en seulement 20-40% de survie après 5 ans. Par conséquent, les stratégies de traitement efficaces visant à réduire la récidive et de progression du cancer superficiel de la vessie ainsi que l'amélioration des résultats thérapeutiques chez les patients ayant une maladie avancée sont nécessaires d'urgence.
Développement de nouveaux produits thérapeutiques nécessite des modèles précliniques pour évaluer l'efficacité suite à l'évaluation initiale in vitro. Le microenvironnement de la tumeur peut influencer de manière significative le développement du cancer et la réactivité, ce qui souligne la nécessité d'précliniquemodèles al dans lequel les tumeurs surviennent ou peuvent être établis dans l'organe d'origine. Une approche est le développement de modèles transgéniques dans lesquels les tumeurs apparaissent spontanément ou peut être induite de manière spécifique à un organe. Un excellent protocole d'un modèle de cancer de la vessie transgénique a été récemment publiée 2. L'inconvénient de modèles transgéniques est que les tumeurs ont tendance à se développer lentement et avec moins d'uniformité que souhaité. En outre, le coût de l'entretien d'une colonie d'élevage doit être considérée. Une alternative aux modèles transgéniques est implantation orthotopique de cellules tumorales, ce qui a l'avantage de courts délais de mise en place de la tumeur chez des souris disponibles dans le commerce. Alors que certaines lignées de cellules de cancer de la vessie humaines peuvent être cultivées de manière orthotopique (nous avons utilisé avec succès UM-UC-3), il peut être souhaitable d'établir des tumeurs chez des souris immunocompétentes. Deux lignées cellulaires de cancer de la vessie murin orthotopique, qui se développent sont MBT-2 et 3 MB49. Depuis MBT-2 cellules sont contaminés par la réplicationrétrovirus de type C 4, nous avons choisi cellules MB49 pour nos études. Il est important de noter que MB49 cellules ont été isolées à partir d'une souris mâle et orthotopique implantations sont effectuées pour des raisons anatomiques chez des souris femelles. Ceci a l'avantage de faciliter l'identification des cellules implantées par marqueurs du chromosome Y, mais la disparité entre les sexes peut être un inconvénient pour les études immunologiques.
L'épithélium de la vessie est bordée par une (GAG) couche de glycosaminoglycanes, qui fonctionne comme une barrière à l'infection par des microorganismes. Cette barrière peut également interférer avec l'implantation des cellules tumorales et plusieurs méthodes ont été développées pour surmonter cette difficulté (tableau 1). Bistouri électrique a été largement utilisé comme un moyen physique pour perturber la couche de GAG 5-13 et une électrocoagulation démontrant de protocole a été récemment publié dans JoVE 14. Toutefois, si une unité d'électrocoagulation ne pas être disponibles, des moyens chimiques pour détruire le GAG couche tel que le nitrate d'argent ou de poly-L-lysine peut également être utilisé de 15 à 24. Les tumeurs sont établies de manière efficace par une brève exposition de la vessie à un faible volume de nitrate d'argent (10.5 pl, 0,15 à 1,0 M, ~ 10 sec) ou plus en contact avec la poly-L-lysine (100 ul de 0,1 mg / ml pendant 20 min) (Tableau 1). Ici, nous décrivons une méthode qui utilise la trypsine afin de faciliter l'implantation de cellules MB49.
Dans une tentative pour améliorer les approches thérapeutiques pour le cancer de la vessie, la thérapie génique a attiré une attention considérable. D'un point de vue clinique, le cancer de la vessie est une cible idéale pour la thérapie génique grâce à l'accessibilité facile de l'organe et la capacité à fournir localement la charge utile. Les vecteurs viraux qui ont été explorées pour la thérapie génique du cancer de la vessie comprennent un virus de l'herpès simplex oncolytique 25, 26 retrovirus, le virus de la variole du canari 27, le virus de la vaccine, AAV, et adenovirus 28. Dans la seconde partie de notre protocole, nous décrivons un procédé pour la livraison virale qui est pratiquement identique à l'instillation de cellules tumorales. D'intérêt dans notre laboratoire est le développement de nouvelles approches en matière de délivrance de gènes, dont nous évaluons par bioluminescence en utilisant un vecteur adénovirus exprimant un transgène luciférase. Cependant, la méthodologie de cathétérisme de la vessie peut être utilisé pour la livraison de divers agents et a une large applicabilité donc.
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été examinés et approuvés par la institutionnel de protection et d'utilisation des animaux Comité à l'Université médicale de Caroline du Sud. Le protocole a été approuvé en vertu de l'USDA catégorie D pour la douleur.
Une. Cellule Implantation
- Deux jours avant d'effectuer la procédure, la plaque 1 x 10 6 cellules MB49 en flacons T-25. Utilisation du DMEM élevé en glucose supplémenté avec 10% de FBS et des antibiotiques (si on le souhaite). Un ballon est suffisante pour chacun des groupes de cinq souris à qui sera anesthésié et implanté en parallèle.
- Le jour de l'intervention, pour préparer la trypsine instillation en diluant stérile à 0,25% de la culture tissulaire de qualité de la trypsine à 0,125% avec un milieu de base DMEM stérile (dilution 1:2). 1,2 ml suffit pour 10 souris. Placer dans un bain-marie à 37 ° C à l'équilibre.
- Préchauffer un coussin chauffant et le positionner sous les pointes coniques du système d'anesthésie qui seront utilisés pour fournir isoflurane. Placer un tampon absorbant propre sur le coussin chauffant.
- Placez la souris dans la chambre de l'induction du système d'anesthésie et induire une anesthésie avec 3% d'isoflurane. Lorsque les souris ont perdu connaissance, ce qui est vérifié par la perte du réflexe orteil-pincement, les transférer aux coiffes. Assurez-vous que chaque animal est en décubitus dorsal et correctement placé sur le bloc de chauffage pour maintenir la température du corps.
- Réduire la concentration d'isoflurane à 2% pour maintenir l'anesthésie.
- Appliquer une pommade ophtalmique à deux yeux pour éviter le dessèchement.
- Étape facultative: Enlever les poils abdominale. Cheveux sur le bas de l'abdomen doit être retiré si vivo bioluminescence imagerie sera effectué.
- Appliquer une généreuse couche de crème dépilatoire, comme Veet, au plus bas dans 1 carré de fourrure sur le ventre, en prenant soin de ne pas communiquer avec les organes génitaux externes. Attendre 3 min.
- Enlever les poils en frottant la surface avec une éponge sèche, et ensuite utiliser une éponge humide pour nettoyer la peau. Répéter une fois, si nécessaire.
- Cathétériser la vessie
- Lubrifier une nouvelle stérile 24 G cathéter veineux, pédiatrique avec un gel lubrifiant non irritant tel que KY. Retirez et jetez l'aiguille. En cas de fuite de liquide autour du cathéter est un problème commun, c'est à dire. il se produit plus souvent que dans l'un des dix souris, des cathéters plus larges de l'alésage (20 g) peuvent être utilisées. Cela peut être une considération importante chez les souris âgées de 8 semaines.
- Tenir le moyeu du cathéter, utiliser le pouce et l'index de votre main opposée à répartir les pattes postérieures de la souris et exposer le méat urétral. Insérez délicatement le cathéter dans l'urètre à un angle de 45 °, de changer l'angle de l'un parallèle avec le banc d'insérer pleinement.
- Après insertion complète, soulevez délicatement le cathéter, gardant parallèle au banc, et vérifier visuellement qu'il est placé dans l'urètre et non le vagin, ce qui est en dessous. Si elle est correctement placé, le cathéter pourra être enentièrement insérée depuis le vagin est plus courte que l'urètre.
- Réduire la concentration de l'isoflurane à 1%.
- Fixer un embout à une pipette P200 et enlever l'urine de la vessie en appliquant une aspiration à l'extrémité externe du cathéter. Retirer l'urine restant dans le moyeu du cathéter. Jeter l'urine et laisser le cathéter en place.
- Pipeter avec soin 80 ul de solution de trypsine à 0,125% dans le moyeu du cathéter, en évitant les bulles d'air. Attacher une seringue remplie d'air 1 ml de l'embout de cathéter et enfoncer lentement le piston de 0,1 au 0,2 ml de livrer la trypsine dans la vessie.
- Laissez la seringue et l'assemblage de cathéter en place pendant 15 min. Répéter les étapes 1.8 à 1.11 pour l'un des souris anesthésiées restants (jusqu'à quatre). Passez à l'étape suivante au cours de la période d'attente. ASTUCE: Initialement, il peut être utile d'avoir quelqu'un d'autre à préparer les cellules (étape 1.12).
- Préparer des cellules pour implantation MB49. Les cellules ont été étalées à 1 x 10 6 par T-25 ballon 48 heures avant l'implantation (étape 1.1).
- Retirez le support et ajouter 500 ul de trypsine à 0,25% dans le ballon. Lorsque les cellules se détachent ajouter 5 ml de DMEM complet à remettre les cellules. Supprimer une aliquote de 50 ul à compter, et centrifuger le reste à 1000 rpm pendant 5 min. Au cours de l'étape de centrifugation à continuer les étapes 1.12.2 et 1.12.3.
- Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Calculer les cellules / ml. Ensuite, on calcule le volume nécessaire pour amener le culot de cellules à 4 x 10 6 cellules / ml (2 x 10 5 cellules par 50 pi).
- Décanter le surnageant de cellules centrifugées et remettre en suspension le culot dans du milieu de base DMEM en utilisant le volume nécessaire de suspendre les cellules à 4 x 10 6 cellules / ml (tel que calculé à l'étape 1.12.2). Maintenir les cellules à température ambiante.
- Lorsque le point de temps de 15 min pour le traitement à la trypsine des vessies est atteinte, retirer la seringue remplie d'air à partir du cathéter en laissant le cathéter en place. Trypsine passé sera normalement refluer à travers le cathéter. Retirez toute la trypsine restant de la vessie par aspiration avec la pipette P200 comme dans l'étape 1.9 ci-dessus et le jeter.
- Pipeter immédiatement 50 pi de suspension cellulaire MB49 dans le moyeu du cathéter. Fixer la seringue de 1 ml rempli d'air sur le moyeu du cathéter et délivrer les cellules de la vessie en appuyant doucement sur le piston de 0,1 à 0,2 ml. Répéter cette étape jusqu'à quatre fois supplémentaires pour implanter l'ensemble des cinq souris. Jeter les cellules inutilisées.
- Sortant de l'ensemble cathéter-seringue en place, permettent aux cellules de demeurer dans la vessie pendant 50 min.
- Retirer délicatement le cathéter seringue de l'urètre. Tournez la concentration de l'isoflurane à zéro et déplacer chaque souris d'un pouce ou deux de la coiffe de récupérer sur le coussin chauffant.
- Quand une souris a retrouvé son réflexe de redressement, retourner dans sa cage.
2. Livraison intravésicale d'adénovirus (8 jours après l'implantation de cellules)
ATTENTION: Cette partie du protocole utilise adénovirus, qui est un agent infectieux et doit être manipulé conformément aux directives BSL2 strictes (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).
Toutes les procédures effectuées par des agents infectieux ont été approuvés par le comité institutionnel de biosécurité de l'Université médicale de Caroline du Sud.
- Huit jours après l'implantation des souris avec des cellules MB49, vérifiez hématurie. Ramassez les animaux individuels sur un morceau de papier blanc absorbant et appuyez doucement sur l'abdomen pour effacer gouttes d'urine sur le papier. Urine qui est rose à rouge indique une hématurie et est un signe que les tumeurs ont établi. taux d'utilisation de la tumeur est d'au moins 80% et avec une excellente technique peut être aussi élevé que 100%.
- Décongeler actions adénoviral sur la glace et diluer à 10 9 PFU/50 pi (2 x 10 10 PFU / ml) dans stérile, la température ambiante PBS.
- Anesthésier les souris comme décrit dans les étapes 1.3 à 1.6 ci-dessus.
- Sonder les souris comme décrit dans les étapes 1,8 et enlever l'urine comme dans l'étape 1.9
- Après urine est enlevé, pipeter immédiatement 50 pi de suspension de virus dans le moyeu du cathéter. Fixer la seringue de 1 ml rempli d'air sur le moyeu du cathéter et de fournir le virus de la vessie en appuyant doucement sur le piston de 0,1 à 0,2 ml.
- Sortant de l'ensemble cathéter-seringue en place, permet le virus de demeurer dans la vessie pendant 40 min.
- Retirer délicatement le cathéter seringue de l'urètre, et jeter dans une solution d'eau de Javel à 10% pour inactiver tout virus restant.
- Tournez la concentration de l'isoflurane à zéro et déplacer chaque souris d'un pouce ou deux de la coiffe de récupérer sur le coussin chauffant.
- Quand une souris a retrouvé son réflexe de redressement, retourner dans sa cage.
- Marquer les cages pour indiquer que les souris ont été inculqué par l'adénovirus. Virus sera versé dans la litière de la cage pendant plusieurs jours et toutes les cages et de la literie doit êtremanipulés et désinfectés de façon appropriée.
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Résultats
Hématurie est observée dans presque toutes les souris dans les 8 jours après l'implantation de 200.000 MB49 cellules. Comme le montre la figure 1, le poids de la vessie a plus que doublé, passant de 34,7 ± 3,3 mg (gamme 31-37 mg, n = 4) non tumorales chez des souris porteuses de 87,5 ± 19,2 mg (gamme de 77 à 120 mg, n = 10) chez des souris ont été implantés avec des cellules MB49. En termes de délivrance de gènes, nous avons constaté que l'imagerie souris 24 heures après l'instillation viral...
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Discussion
La principale méthode décrite dans ce protocole est cathétérisme de vessies de souris, qui a de larges applications pour instillation de cellules ou un agent destiné à la distribution locale de l'épithélium de la vessie. Le protocole spécifique décrite ci-dessus a été optimisé pour les études à court terme (~ 10 jours). Implanter le nombre exact de cellules est critique, car un certain nombre de cellules plus élevée entraîne une croissance plus rapide de la tumeur et, éventuellement, la perte de l'animal en rais...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le NIH R21 CA143505 à Christina Voelkel-Johnson.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Souris femelles âgées de 6 à 8 semaines | Jackson Laboratories | Nom de la souche : C57BL/6J Numéro de stock : 000664 | |
| Trypsine* | MediaTech | MT25-053-CI | Obtenu par l’intermédiaire de Fisher |
| DMEM* | MediaTech | MT10-017-CV | Obtenu par Fisher |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | Inactivé par la chaleur |
| T25 flacons* | Corning Costar | Corning N° : 3056 Fisher : 07-200-63 | > Obtenu par Fisher |
| MB49 cells | N/A | N/A | Obtenu auprès du Dr Boehle (voir référence11) |
| Puralube Vet Ointement* | Pharmaderm | Henry Schein Company No. :036090-6050059 Fisher : NC9676869 | Obtenu par l’intermédiaire de Fisher |
| Crème dépilatoire : Veet | Pharmacie locale | ||
| Lubrifiant : K-Y Jelly | pharmacie locale | ||
| Cathéters* | Exel International | Exel International No. :26751 ; Fisher : 14-841-21 | Obtenu par Fisher |
| Isoflurane | Terrell | NDC 66794-011-25 | Obtenu par pharmacie hospitalière |
| 1 ml de seringues TB | Becton Dickinson | BD309659 Fisher :14-823-434 | |
| D-Luciférine | Gold Biotechnologies | L-123-1 | |
| Ad-CMV-Luc | VectorBiolabs | 1000 ; Demander une amplification à grande échelle et une purification CsCl pour une utilisation in vivo | Agent infectieux nécessitant un confinement BSL2 |
| Steady-Glo ; Système de dosage de la luciférase | Promega | E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) ou E2550 (10 x 100 ml) | |
*disponible auprès de plusieurs fournisseurs | |||
EQUIPMENT | |||
| Système d’anesthésie | E-Z Systems, Euthanex Corporation | Système d’anesthésie : EZ7000 Appareil de respirabilité de souris à 5 ports : EZ109 | Obtenu par l’intermédiaire de Fisher |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm | |
| FLUOstar Optima | BMG Labtech | http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |
Références
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Réimpressions et autorisations
