Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse

Résumé

Détermination de la prise de greffe de cellule donneuse présente un défi dans des modèles de souris moelle osseuse greffe qui n'ont pas bien définis marqueurs phénotypiques. Nous avons décrit une méthodologie pour quantifier les hommes greffe de cellule donneuse dans des souris femelles bénéficiaires de greffes. Cette méthode peut être utilisée dans toutes les souches de souris pour l'étude des fonctions HSC.

Résumé

Modèles murins de greffe de moelle osseuse constituent un outil important pour mesurer de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et les gènes qui déterminent les fonctions / molécules qui régulent la CSH. Dans ces systèmes, le modèle de transplantation, la fonction des cellules souches hématopoïétiques est déterminé par la capacité de ces cellules à des souris greffer et reconstituer bénéficiaires irradiées de façon létale. Communément, la cellule donneuse contribution / prise de greffe est mesurée par des anticorps spécifiques aux bailleurs de protéines de surface cellulaire par cytométrie en flux. Cependant, cette méthode dépend fortement de la spécificité et de la capacité du marqueur de surface cellulaire pour différencier des bailleurs de fonds des cellules dérivées de cellules destinataire-nées, qui peuvent ne pas être disponibles pour toutes les souches de souris. Compte tenu de la diversité des souches de souris génétiquement modifiées sur le marché, cette surface cellulaire / cytométrie de flux basé sur la méthode comporte des limites importantes en particulier dans les souches de souris qui n'ont pas bien définis marqueurs de surface de cellules du donneur séparer congéniques destinataire CElls. Ici, nous avons enregistré une technique basée sur la PCR pour déterminer la prise de greffe de cellule donneuse / contribution à des souris receveuses de transplantation. Nous avons transplanté hommes CSH donneurs de moelle osseuse de souris irradiées de façon létale congéniques femmes. Échantillons de sang périphérique ont été prélevés au moment de post-transplantation différents points. Des échantillons de moelle osseuse ont été obtenus à la fin des expériences. L'ADN génomique a été isolé et le gène du chromosome Y spécifique, Zfy1, a été amplifié par PCR en temps réel quantitative. La prise de greffe des hommes donneurs de cellules dérivées des souris receveuses femelles a été calculé par rapport à la courbe standard avec pourcentage connu des ADN masculins vs femme. Bcl2 a été utilisé comme gène de référence pour normaliser la quantité d'ADN total. Nos données suggèrent que cette approche permet de déterminer de manière fiable la prise de greffe de cellule donneuse et fournit une méthode utile, mais simple dans la mesure de la reconstitution hématopoïétique dans des modèles murins de transplantation de moelle osseuse. Notre méthode peut être effectué systématiquement dans la plupart des laboratoires, car aucunéquipements coûteux comme la cytométrie de flux est nécessaire.

Introduction

Murin moelle osseuse (MO) transplantation modèle a été développé dans les années 1960 ^1. Ce modèle a été largement utilisé pour l'étude des cellules souches donateurs hématopoïétiques (CSH) la biologie dans une souris hôte receveur. Murin modèle de greffe de moelle osseuse nous a fourni de précieuses connaissances sur les fonctions HSC et de leur régulation et est indispensable dans la recherche HSC. Allogénique modèle greffe de moelle osseuse comme C57BL/6J ^H2b-souris Balb / C ^H2d ou d'un modèle de transplantation congéniques ^CD45.2 comme C56Bl/6J-B6.SJL ^CD45.1 sont utilisés dans de nombreux laboratoires....

Protocole

1. Isolement de cellules de moelle osseuse

1. Euthanasier mâles donneurs FVB / NJ souris et femelles FVB / NJ souris utilisant le CO ₂ méthode suivie par dislocation cervicale. Les femelles FVB / NJ cellules de moelle osseuse seront utilisées comme cellules compétitifs.
2. Utilisez de petits ciseaux et des pinces, disséquer les fémurs et tibiaes de souris et de les placer dans une boîte de culture tissulaire de 60 mm contenant 6 ml RPMI1640 glacée avec du FBS inactivé chaleur 5%. Utilisez le tissu Kimwipe pour enlever les muscles et d'autres tissus. Couper les deux extrémités de chaque corps d'os dans le plat.
3. Branchez l....

Résultats

Figures 1 et 2 montrent des exemples de courbes de référence tracées avec des valeurs moyennes de ^2-δCt contre pourcentages d'ADN masculin. Figure 1A montre la température de fusion spécifique pour Bcl2 et Zfy1 amplicons localisés à 78,5 ° C et 88,5 ° C respectivement. Bcl2 est utilisé en tant que gène de référence pour normaliser la quantité totale d'ADN chargé dans chaque réaction de PCR. Bcl2 courbes d'amplification (vue Log) pour chaque échantillon standard fu.......

Discussion

L'objectif de notre étude est de fournir aux spectateurs une technique basée sur la PCR pour quantifier la prise de greffe de cellule donneuse dans un modèle concurrentiel osseuse murine greffe de moelle. Plusieurs études ont été rapportés par RT-PCR pour détecter les cellules du donneur dans des modèles de transplantation ^9-10. Le groupe du Dr Schwarzenberger a d'abord développé un modèle murin de greffe de moelle osseuse en utilisant PCR en temps réel pour amplifier chromosome Y spécifique ^8.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
FBS	Invitrogen	16140-017	Inactivé par la chaleur
Le chlorure d'ammonium	MP Biomedicaals	194806
Bicarbonate de potassium	Pêcheur	P184-500
QIAamp d'ADN de sang minikit	Qiagen	51106
Tamis cellulaire	BD biosciences
iQ SYBR Green Supermix	Biorad	170-8882
iQ5 temps réel machine PCR	Biorad
Spectra photomètre	Nanodrop ND-1000	ND-1000