Article de méthode

Néonatale électroporation zone sous-ventriculaire

DOI :

10.3791/50197

⸱

11 février 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Nous démontrons une technique peu invasive appelée électroporation zone sous-ventriculaire néonatal. La technique consiste à injecter de l'ADN plasmidique dans les ventricules latéraux de chiots nouveau-nés et application d'un courant électrique à fournir et manipuler génétiquement des cellules souches neurales

Résumé

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Les cellules souches neurales (NSC) en ligne les ventricules latéraux et postnatales donner lieu à plusieurs types de cellules qui comprennent les neurones, les astrocytes et les cellules épendymaires 1. Comprendre les mécanismes moléculaires responsables de la NSC auto-renouvellement, l'engagement et la différenciation est essentielle pour exploiter leur potentiel unique pour réparer le cerveau et de mieux comprendre les troubles du système nerveux. Les méthodes précédentes pour la manipulation des systèmes de mammifères nécessaire l'effort long et coûteux du génie génétique au niveau de l'animal entier 2. Ainsi, la grande majorité des études ont exploré les fonctions des molécules NSC in vitro ou chez les invertébrés.

Ici, nous démontrons la technique simple et rapide à manipuler PNJ néonatales qui est désigné comme zone sous-ventriculaire néonatal (SVZ) électroporation. Des techniques similaires ont été mis au point il ya une décennie à étudier NSCs embryonnaires et ont aidé des études sur cortical le développement 3,4. Plus récemment, elle a été appliquée pour étudier le cerveau antérieur des rongeurs postnatale 5-7. Cette technique conduit à l'étiquetage robuste de SVZ NSC et de leur progéniture. Ainsi, après la naissance SVZ électroporation offre un coût de remplacement et du temps efficace pour NSC ingénierie génétique chez les mammifères.

Protocole

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Cette procédure est conforme aux exigences du IACUC Yale. Les scientifiques devraient veiller à ce que les lignes directrices du IACUC sont approuvés et suivis en fonction de leurs exigences institutionnelles.

1. Section 1. Préparation de pipettes ADN, Solutions et verre

  1. Générer une grande pureté (DO 260/280> 1,80) forte concentration (ug / ul> 2,5) sans endotoxine ADN.
  2. Préparer 0,9% de solution saline stérile et le filtre à travers un filtre 22 um.
  3. Placer les 10 cm polies au feu des tubes en verre borosilicate capillaires (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) dans un modèle PP-830 Narishige PC-10 en verre pipette extracteur avec un fil kanthal. Set extracteur pour un pull un peu pondérée à 70,5 ° C. Briser avec une pince circulaire conseils et inspecter sous un microscope à dissection pour les bords en escalier. Conseils coniques et les placer sous une lampe UV pendant 15 min. Pipettes tirés devraient être marqués à 2 mm du bord de la pointe.
  4. Préparer 0,1% en poids / volume vert rapide solutipar mélange une solution stérile de sérum physiologique à 0,9% filtrée avec du vert à séchage rapide.

2. Section 2. Préparation des animaux, verre Pipette Chargement en cours et l'injection de plasmide

  1. Retirer jour postnatal 0-1 chiots individuellement dans les cages, placez-les sur un plat en verre de Pétri pré-réfrigérés à 4 ° C, puis les placer sur la glace mouillée.
  2. Après environ 5 min, de déterminer l'état de l'anesthésie, en utilisant la réponse de pincement pied. Si aucun mouvement n'est détecté, chiots soumis à l'injection intraventriculaire.
  3. Il est important de noter que la combinaison de vert rapide de l'ADN, et la solution saline peut entraîner une évaporation rapide, la cristallisation et le blocage des pipettes en verre. Par conséquent, générer une solution mère et aliquote de 2.1 ul sur du parafilm immédiatement avant les injections.
  4. Aspirer la totalité du volume poolées avec la pipette en verre tiré.
  5. Maintenir la tête du chiot entre le pouce et l'index de votre main moins dominante.
  6. Allumez la lampe d'und tenir la tête du chiot à l'extérieur du faisceau lumineux. Si nécessaire, placez une solution saline sur la tête afin de réduire la quantité de lumière réfléchie par chiot. Les ventricules devrait maintenant être allumé.
  7. Avec votre main dominante, insérer l'aiguille dans le ventricule latéral le plus proche (Figure 1A et 1B). Le site d'injection doit être approximativement égale distance de la suture lambdoïde et des yeux et 2 mm en dehors de la suture sagittale. Insérez tiré pipette pour la marque de 2 mm pour un chiot P0, ce qui devrait assurer une pénétration dans le ventricule latéral. Par coïncidence, il se peut que le remblayage du LCR dans la pipette de la libération de la pression intracrânienne. Pour réduire la pression intracrânienne, ce qui aide à l'injection de plasmide, desserrez votre emprise sur la tête de la pup.Step 2.8. Injecter environ 0,5 ul de plasmide dans le ventricule latéral à l'aide d'un injecteur d'air sous pression (Picospritzer, Parker).

3. Section 3. Électroporation et récupération

  1. Set la tension du générateur d'impulsions d'électroporation de 5 carrés, 50 ms / impulsion à 100 volts, avec des intervalles de 950 ms. La spécificité de l'espace électroporation plasmide est dictée par la directivité de transfert de charge. Une attention particulière devrait être accordée à la mise en place compte tenu de l'hétérogénéité des populations de cellules souches le long de la SVZ 8. Les différences dans les taux de prolifération et destin cellulaire ont été identifiés pour les emplacements ventro-dorsale et caudale 9,10 rostro-.
  2. Une fois que le plasmide est injecté, plonger les électrodes brucelles dans le PBS. Cette étape consiste à maximiser le transfert de charge et pour éviter les brûlures causées par la résistivité.
  3. Placer l'électrode positive sur la paroi latérale de la dorsale petits près de l'oreille ipsilatérale au site d'injection de plasmide (Figure 1C et 1D). Placez l'électrode négative sur la partie latérale hémisphère controlatéral ventrale du chiot museau.
  4. Initier le transfert en cours en appuyant sur les foots impulsionssorcière pédale et balayer les électrodes de dorsale à l'aide latéral ~ 25 ° d'angle intervalles.
  5. Lieu électroporation chiots sur un coussin chauffant pendant 5 min. Tournez doucement chiots toutes les 30 secondes avec une légère stimulation.

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Résultats

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Néonatales ventriculaire résultats d'électroporation de zone dans l'étiquetage de la quasi-totalité glie radiale contiguë à la dorsale, zone sous-ventriculaire latéral dorsal, latéral et à la suite de la "balayage" déplacement de l'électrode pince (figure 1E). Cependant, l'électroporation peut être adapté à l'exigence de l'expérience respective, mais pas balayer l'électrode et l'utilisation de l'emplacement spécifique et l'orientation comme détaillé dans la vidéo. Par exemple, depuis dorsalement localis...

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Discussion

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Ici, nous détaillons la technique de la SVZ électroporation néonatale, une technique permettant de rapidement et vigoureusement étiqueter et de manipuler les cellules souches SVZ et de leur progéniture. Il ya plusieurs avantages que l'électroporation a par rapport à d'autres techniques. Premièrement, étant donné l'étiquetage focale des cellules, on est capable de discerner des cellules autonomes et non-autonomes cellule effets. Deuxièmement, la manipulation génétique en utilisant des systèmes inductibles per...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont aucune divulgation à faire.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère de la Défense (prix de développement d'idées, W81XWH-10-1-0041, AB), CT cellules souches subvention (AB), et un Institut national de la santé NRSA 10668225 (DMF). Le matériel actuel est basé sur le travail soutenu en partie par l'État du Connecticut Connecticut sous la tige subventions Cellulaire Programme de recherche. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l'État du Connecticut, le ministère de la Santé publique de l'État du Connecticut ou CT Innovations, Inc Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte de données et l'analyse, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires (optionnel)
Tube lourd poli borosilicaté Instrument Sutter BF150-110-10
À deux phases côtés verre Micropipette Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Square Wave Générateur d'impulsions Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Source de lumière à fibre optique Fisher Scientific 12-562-36
Halogène Tungstènelampe USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instruments 052-0312-900

Références

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  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883(2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517(2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13(2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380(2012).

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Mots-clés

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