Chromosome Préparation partir des cellules cultivées

Résumé

Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules vivantes telles que des lymphocytes ou des fibroblastes de la peau, et à partir d'organismes, y compris les humains et les souris. Ces préparations de chromosomes peuvent en outre être utilisés pour G-banding routine et les procédures de cytogénétique moléculaire telles que l'hybridation fluorescente in situ (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotype spectral (SKY).

Résumé

Chromosome (cytogénétique) analyse est largement utilisée pour la détection de l'instabilité chromosomique. Lorsque suivi par G-banding et techniques moléculaires tels que l'hybridation fluorescente in situ (FISH), ce test a l'avantage de pouvoir analyser des cellules individuelles pour les aberrations qui impliquent des gains ou des pertes de portions du génome et des réarrangements impliquant un ou plusieurs chromosomes. Chez l'homme, des anomalies chromosomiques surviennent chez environ 1 pour 160 naissances vivantes ^1,2, 60-80% de toutes les fausses couches ^3,4, 10% des mortinaissances ^2,5, 13% des personnes ayant une maladie cardiaque congénitale ^6, 3-6% des cas d'infertilité ^2, et chez de nombreux patients atteints de déficience intellectuelle et des malformations congénitales ^7. L'analyse cytogénétique des tumeurs malignes est couramment utilisé par les chercheurs et les cliniciens, comme il a été démontré observations d'anomalies chromosomiques clonales à avoir à la fois une signification diagnostique et pronostique ^8,9.60, l'isolement de chromosomes est inestimable pour la thérapie génique et les cellules souche d'organismes y compris les primates non humains et les rongeurs ^10-13.

Les chromosomes peuvent être isolés à partir de cellules de tissus vivants, notamment des lymphocytes de sang, les fibroblastes de la peau, les cellules amniotiques, le placenta, la moelle osseuse, et des échantillons de tumeur. Les chromosomes sont analysées au stade de la métaphase de la mitose, quand ils sont les plus condensées et donc plus visible. La première étape de la technique d'isolement du chromosome implique la rupture des fibres du fuseau par incubation avec Colcemid, pour empêcher les cellules de passer à l'étape ultérieure de l'anaphase. Les cellules sont ensuite traitées avec une solution hypotonique et conservés dans leur état gonflé, avec le fixateur de Carnoy. Les cellules sont ensuite déposés sur de diapositives et peuvent ensuite être utilisés pour une variété de procédures. G-banding implique un traitement à la trypsine suivie d'une coloration au Giemsa à créer de la lumière caractéristique et bandes sombres. Le même procedure pour isoler les chromosomes peuvent être utilisés pour la préparation de cellules pour des procédures telles que l'hybridation in situ par fluorescence (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH), et le caryotypage spectral (SKY) ^14,15.

Introduction

L'analyse des chromosomes est une technique classique utilisée dans le monde entier pour diagnostiquer l'instabilité chromosomique et réarrangements conduisant à des troubles génétiques et cancer ^1,2,8,9. En outre, une résolution plus élevée pour le diagnostic et la recherche d'anomalies génétiques constitutionnels et cancer acquis peut être réalisé avec la combinaison des procédures cytogénétique classique et des méthodes de cytogénétique moléculaire telles que l'hybridation fluorescente in situ (FISH), l'hybridation génomique comparative (CGH) , et le caryotype spectral (SKY) ^14,15. Plus récemment, ces tec....

Protocole

Une. Chromosome récolte de cellules adhérentes

1. Protocole standard
   1. Cultiver des cellules selon les conditions particulières de culture cellulaire. Lorsque les cellules ont atteint la phase logarithmique (80% de confluence), ajouter 10 ul / ml de Colcemid dans le ballon de culture de cellules. Un minimum de 2 x 10 ⁶ cellules est recommandée.
   2. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à _CO2 à 5% pendant 45 min. En utilisant une pipette stérile, transférer médias de cellules dans un tube de 15 ml conique. Mettre de côté.
   3. Lavez délicatement les cellules en ajoutant 2 ml de HBSS tampon dan....

Résultats

Métaphase écarts de qualité sont essentiels pour l'analyse des chromosomes. Un test réussi donne chromosomes qui sont bien répartis et de la morphologie des chromosomes approprié. Chromosomes correctement G-bagués contiennent la lumière caractéristique et profils de bandes sombres.

Figure 1. Un é.......

Discussion

Nous avons utilisé la présente procédure pour l'isolement du chromosome à partir de cellules de différents organismes, y compris divers types de cellules obtenues à partir de l'homme, les macaques rhésus, les rats, les souris et les ^11,20-22. Le protocole standard est fourni, mais peut être ajustée pour ces divers types de cellules certaines étapes et variables clés. Plusieurs mesures spécifiques sont indispensables à la fois dans la préparation chromosomique et G-bandes pour assurer la meilleure qual.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS	Tampon Gibco	24020-117
0,5 % Trypsine EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Tampon Comprimés « GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrifugeuse 5810	Eppendorf
Méthanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
Acide acétique glacial	Krackeler Scientific Inc.	Référence 11-9508-05