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Article de méthode

Un modèle de poisson zèbre du diabète sucré et de la mémoire métabolique

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DOI :

10.3791/50232

⸱

28 février 2013

 ,  , 
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Dans cet article

Résumé

Mémoire métabolique est le phénomène par lequel les complications du diabète persistent et progresser sans entrave, même après euglycémie est atteint pharmaceutique. Nous décrivons ici un modèle de poisson zèbre diabète sucré qui est unique en ce qu'elle permet d'examiner des éléments mitotiquement transmissibles épigénétiques de mémoire métabolique In vivo.

Résumé

Le diabète sucré touche actuellement 346 millions personnes et ce nombre devrait passer à 400 millions en 2030. Preuve à la fois de laboratoire et de grands essais cliniques ont montré que les complications diabétiques progrès sans entrave par le phénomène de la mémoire métabolique, même si le contrôle glycémique est pharmaceutiquement atteint. L'expression des gènes peut être modifiée par des modifications de façon stable épigénétiques qui non seulement permettent aux cellules et aux organismes de répondre rapidement à l'évolution des stimuli de l'environnement, mais aussi conférer la capacité de la cellule à «mémoriser» ces rencontres une fois que le stimulus est enlevé. En tant que tel, les rôles que ces mécanismes jouent dans le phénomène de la mémoire métabolique sont actuellement à l'étude.

Nous avons récemment rapporté le développement d'un modèle de poisson zèbre de sucré de type I, diabète et caractérisé ce modèle pour montrer que le poisson-zèbre diabétique non seulement afficher les complications connues secondaires, y compris les changements liésla rétinopathie diabétique, la néphropathie diabétique et la guérison des plaies, mais présentent également une déficience de régénération de la nageoire caudale. Ce modèle est unique en ce que le poisson-zèbre est capable de régénérer son pancréas endommagé et restaurer un état euglycémique similaire à ce qui serait attendu en post-transplantation chez des patients humains. En outre, plusieurs séries d'amputation de la nageoire caudale permet la séparation et l'étude de purs effets épigénétiques dans un système in vivo sans potentiels facteurs de complication de l'état diabétique précédente. Bien que euglycémie est atteint après régénération du pancréas, la complication diabétique secondaire de la régénération des nageoires et cicatrisation de la peau persiste indéfiniment. Dans le cas de la régénération des nageoires avec facultés affaiblies, cette pathologie est conservé même après plusieurs cycles de régénération des nageoires dans les tissus ailettes fille. Ces observations indiquent un processus épigénétique sous-jacente existant dans l'état de la mémoire métabolique. Nous présentons ici les méthodes nécessaires à la réussite genlérer la mémoire des groupes diabétiques et métaboliques des poissons et de discuter des avantages de ce modèle.

Introduction

Le diabète sucré (DM) est un problème de santé grave et croissant que les résultats de l'espérance de vie réduite en raison de complications microvasculaires maladie spécifique (rétinopathie, néphropathie, neuropathie, la guérison des plaies) et macrovasculaires (cardiopathie et accident vasculaire cérébral) des complications 1. Une fois lancés, les complications diabétiques continuer à progresser sans interruption, même lorsque le contrôle glycémique est obtenu 2,3 et ce phénomène a été appelé mémoire métabolique ou l'effet de l'héritage. La présence de ce phénomène a été reconnu cliniquement début des années 1990 que le «Le Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)« progressé depuis et a été soutenu par plusieurs autres études cliniques 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Les modèles animaux de DM ont joué un rôle crucial pour les découvertes liées à la physiopathologie de complications liées au diabète et à la mémoire métabolique. En effet, la persistance des complications du diabète a d'abord été documentés dans un modèle canin de diabèterétinopathie, qui a depuis été appuyé par plusieurs lignes de données expérimentales en utilisant une variété de systèmes de culture in vitro et des modèles animaux 15,16,17,18,19,20,21. Ces études montrent clairement que les premiers résultats une période d'hyperglycémie dans les anomalies stables (y compris l'expression génique aberrante) des organes / cellules cibles et mécaniste suggère l'implication de l'épigénome.

Épigénomes compose de tous les modifications de la chromatine pour un type cellulaire donné et sont responsables de cellule unique d'un profil d'expression génique. Les modifications chromosomiques sont dynamiques au cours du développement, la différenciation des cellules de soutien, sont sensibles à des stimuli externes, sont mitotiquement stabilité héréditaire 22,23 et peuvent être modifiées dans la maladie 24,25,26. Ces mécanismes épigénétiques comprennent: poster traductionnelles des histones, modifications non canonique d'inclusion variant d'histone dans octomers, les changements d'accès grâce à la chromatine, méthylation de l'ADN et des gènescontrôle de l'expression par ARN non codants micro 27,28,29,30. Au total, les processus épigénétiques permettent aux cellules / organismes de réagir rapidement à l'évolution des stimuli environnementaux 31,32,33, ils confèrent également la capacité de la cellule à «mémoriser» ces rencontres une fois que le stimulus est enlevé 23,22. Par conséquent, comme altérées profils d'expression génique résultant de processus épigénétiques sont stables en l'absence du signal (s) qui les a initiées et sont héréditaires par division cellulaire, ils ont acquis un grand intérêt en tant que sous-tendent les mécanismes moléculaires de pathologies humaines comme la mémoire métabolique. Les résultats qui émergent dans le contexte du DM et de l'épigénétique avancées parallèles dans d'autres maladies en ce qu'une pléthore de modifications épigénétiques induites par l'hyperglycémie provoquent remarquables changements persistants dans les réseaux transcriptionnels des cellules (revue en 34,35,36,37,38).

Le poisson-zèbre a longtemps été un organisme modèle pour étudiants de premierdy vertébrés développement mais les 15 dernières années ont vu une croissance exponentielle dans l'utilisation de cet organisme pour l'étude des maladies humaines. 39. Modèles de maladies humaines poisson zèbre ont été mis en place couvrant un large éventail de pathologies humaines, y compris les maladies génétiques et les maladies acquises 40,41,42. Les nombreux avantages du poisson zèbre par rapport aux autres organismes modèles vertébrés comprennent une fécondité élevée, le temps de génération court, la transparence grâce à l'âge adulte, les coûts du logement réduit et une gamme d'outils pour la manipulation génétique. En outre, en raison de l'étendue de la conservation des voies génétiques et physiologie cellulaire chez les vertébrés et la capacité d'effectuer des dépistages de drogue débit élevé, le poisson zèbre a été utilisé avec succès pour la découverte pharmaceutique.

Nous avons développé un modèle de poisson zèbre adulte du diabète de type I en utilisant le médicament diabétogène, streptozocine. Nous avons caractérisé ce modèle pour montrer que le poisson-zèbre diabétique net n'afficher que les plus connus de l'homme de complications secondaires, mais en plus, présentent des troubles de la régénération des membres (régénération de la nageoire caudale) à la suite de l'environnement hyperglycémique. En outre, nous avons signalé que le poisson-zèbre hyperglycémique revenir à une glycémie normale dans les 2 semaines suivant le retrait du médicament en raison de la régénération des cellules bêta pancréatiques endogènes résultant dans un état glycémique physiologiquement normal. Toutefois, en revanche, la régénération des membres chez ces poissons reste compromise dans la même mesure que dans l'état diabétique aiguë indiquant cette complication persiste et est sensible à la mémoire métabolique. Le principal moteur de la génération de ce modèle est de fournir un système pour étudier les composantes mitotiquement stables épigénétiques qui prennent en charge le phénomène de la mémoire métabolique en l'absence du bruit de fond de l'environnement hyperglycémique précédente. À la conclusion du protocole prévu ici les tissus de poisson zèbre et ou sélectives peuvent être traitées par un essai approprié pour la recherrchers besoin. Nous avons utilisé avec succès cette procédure pour identifier les changements à l'échelle du génome persistantes dans méthylation de l'ADN induites par l'hyperglycémie qui sont maintenus dans l'état de la mémoire métabolique 21.

Nous pensons que ce modèle de poisson zèbre de type I diabète présente plusieurs avantages par rapport aux systèmes innovants d'autres modèles pour l'examen de la mémoire métabolique. 1) Tous nos études peuvent être menées in vivo et que le poisson hyperglycémique précédent retour à une glycémie normale grâce à la régénération de la production d'insuline endogène, ils n'ont pas besoin d'injections d'insuline exogène. Par conséquent, ce qui évite les pics et les vallées de complication dans le contrôle glycémique qui peuvent survenir chez les animaux ayant besoin d'insuline exogène. 2) Comme décrit ci-dessus, la stimulation de fond de l'état diabétique précédente (à savoir la présence continue de glycation avancée des produits et réactifs marqueurs des espèces d'oxygène) sont éliminées et par conséquent on peut examiner l'aspect purement EPIGfacteurs enetic de mémoire métabolique. 3) Les expériences peuvent être réalisées rapidement que cela prend environ 80 jours à compter de l'induction du diabète jusqu'à l'examen mémoire métabolique. 4) la régénération caudale est expérimentalement très accessible et permet la manipulation génétique et expérimentale facile pour lesquels il existe une vaste gamme d'outils. 5) la régénération caudale fournit une méthode très simple et quantifiables pour évaluer la mémoire métabolique et donc permettra de découverte de médicaments avenir.

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Protocole

Toutes les procédures sont exécutées suivant les directives décrites dans les «Principes de protection des animaux de laboratoire» (National Institutes of Health publication no. 85-23, révisée en 1985) et l'a approuvé Rosalind Franklin University soins aux animaux et l'utilisation des animaux Comité protocole de 08-19.

Il ya 2 abréviations importantes qui sont utilisées dans ce manuscrit. 1) DM: se réfère aux poissons qui sont dans un état d'hyperglycémie (300 mg / dl) aiguë et ont été pendant au moins 3 semaines. 2) MM: désigne les poissons qui étaient de 21 jours (voir protocole) poissons DM et a permis de rétablir le contrôle glycémique grâce à la régénération du pancréas. Ceci est réalisé à l'intérieur (14) jours de la suppression de drogue. Les poissons sont considérés comme des poissons MM partir de ce point. Il est également important de noter que les poissons qui sont désignés sous le contrôle sont traitées de manière identique que le poisson DM ou MM en termes de nombre d'injections (solution saline), les temps d'incubation à différentes températures et le nombre et le calendrierdes amputations de la nageoire caudale.

1. Génération de poisson zèbre avec le diabète sucré, le poisson DM

  1. Préparer à la fois la récupération et réservoirs d'eau anesthésiques. Eau de récupération de l'eau du poisson normal. Pour l'eau anesthésie ajouter suffisamment de 2-phénoxyéthanol sorte que la dilution 1:1000 dans les poissons d'eau normal est atteint.
  2. Préparer une solution à 0,3% (sous une hotte) de streptozocine (STZ) par addition de 6 mg de STZ à 2 ml de chlorure de sodium 0,09% et placer immédiatement la solution sur de la glace. Cette solution fournit suffisamment d'injection pour l'injection d'environ 20 à 20 min poisson. Si vous dépassez le seuil des 20 minutes, arrêter et faire une nouvelle solution STZ avant de poursuivre. Dans un tube séparé aliquote solution saline assez pour les poissons témoins. Une fois que la STZ est solubilisé toutes les étapes ultérieures ne nécessitent pas l'utilisation hotte.
  3. Remplir une seringue ½ cc équipé d'une aiguille de calibre 27 1/2 avec les solutions STZ ou de contrôle assurant qu'aucune bulle d'air emprisonnées.
  4. AnesthésieTize chaque poisson individuellement en plaçant le poisson dans l'eau anesthésie, et d'attendre jusqu'à ce que leur mouvement de nage cesse (1-2 min).
  5. Une fois brièvement anesthésiés placer le poisson sur une serviette en papier pour absorber l'excès d'eau, placer le poisson dans pèsent bateau et mesurer la masse du poisson.
  6. Placer le poisson sur une surface solide (couvercle boîte de Pétri) pour l'injection.
  7. Injecter la solution de contrôle STZ ou dans la cavité péritonéale du poisson en insérant l'aiguille passée dans le biseau de la face postérieure du péritoine ventrale.
  8. 0,35 mg / g (350 mg / kg) de STZ devrait être remis à chaque poisson et le volume de la solution à 0,3% requise peut être calculée de la manière suivante.
    1. Multiplier la masse de poisson (g) par 0,35 pour obtenir la quantité de STZ en mg nécessaire.
    2. diviser le produit généré au-dessus de 3 pour donner le volume de la solution à 0,3% nécessaires à l'injection en pi.
      Exemple: Pour un poisson 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 pi.
      Le même volume sans le STZ serait injecté pour un poisson de commande. Une feuille pour des volumes à injecter par masse de poissons doit être généré et utilisé pour une référence rapide.
  9. Après l'injection de placer le poisson dans le réservoir d'eau de récupération et de les surveiller toute activité nager normalement. Une fois ce qui a été réalisé le poisson est transféré à un réservoir de vie normale est maintenue dans la plage de température réduite de 22 ° C - 24 ° C. Cette température réduite est essentielle pour l'induction efficace de l'hyperglycémie (diabète sucré, DM).
  10. Bien que l'hyperglycémie est détecté dans les 24 heures de la première injection, afin d'induire un état prolongé de l'hyperglycémie très élevé, le poisson-zèbre nécessitent une phase d'injection fréquente d'induction suivie d'injections hebdomadaires d'entretien, comme indiqué ci-dessous.

Semaine 1: 3 injections (jours 1, 3, 5), Semaine 2: 1 injection (jour 12), Semaine 3: 1 injection (jour 19),
Semaine 4: (Jour 21) Effectuerdosage d'intérêt.

A ce stade, le poisson zèbre est considéré comme ayant été dans un état prolongé de l'hyperglycémie et les complications diabétiques présentent de la rétinopathie, la néphropathie et la régénération des nageoires également altérée. Ceux-ci sont considérés comme des poissons DM. De plus, si désiré, le poisson peut être maintenu à l'état hyperglycémique avec des injections hebdomadaires d'entretien. Environ 5% de décès au cours de ce processus devrait être prévu.

2. Collecte de sang et la glycémie à jeun (FBGL) Détermination

  1. Chaque groupe de poissons DM et de contrôle doit inclure suffisamment de poisson pour déterminer avec précision la FBGL moyenne du groupe dans ce test nécessite ces poissons à être sacrifié.
  2. Préparer un tube étiqueté PCR pour chaque échantillon de sang contenant 5 pi de solution saline normale stérile.
  3. Pour la collecte de sang, anesthésier les poissons comme ci-dessus, enlevez toute l'eau, placer le poisson sur une lame de microscope et à l'aide d'un scalpel, enlever la tête du poissonà la base de l'opercule.
  4. Prélever le sang (jusqu'à 2 pi) qui est libérée par le poisson sur la lame rapidement et l'ajouter à la ul 5 de solution saline normale stérile pipetage haut et bas pour faire en sorte que le sang ne se bouchent pas. Immédiatement placer l'échantillon sur la glace.
  5. Déterminer le volume de l'échantillon de sang en mesurant le volume total du liquide (solution saline + sang) et en soustrayant ensuite la pi 5 de solution saline.
  6. Transférer 5 ul du sang dilué dans chaque tube PCR dans un tube de 1,5 ml et déterminer la concentration de glucose sanguin à l'aide du kit de dosage du glucose QuantiChrome. Ceci est réalisé en suivant le protocole du fabricant, sans exception. Résultats attendus: normal poisson de commande / 60 mg / dl et le poisson DM 310 mg / dl.

3. Nageoire caudale études de régénération

  1. Anesthésier les poissons comme décrit dans 1.0 à 1.4.
  2. Placer le poisson sur un couvercle de boîte de Pétri et l'amputation de la nageoire caudale en ligne droite en utilisant une taille stérile10 scalpel à proximité du premier point de ramification lepidotrichia tout en regardant la fin grâce à un microscope à dissection.
  3. Permettre aux poissons de se rétablir comme en 1.10, mais placer le poisson à 33 ° C pendant la phase de croissance régénérative de l'essai. Il s'agit d'une analyse de température établi pour fin régénération accélérée.
  4. Les ailettes peuvent être visualisés à tout moment après l'amputation mais nous examiner systématiquement la croissance régénérative à 24, 28 et 72 heures après trans-section.
  5. Anesthésier les poissons comme avant (voir 1.0 à 1.4), placer le poisson sous un microscope de dissection équipé d'une caméra (nous utilisons un Nikon SMZ-1500 équipé d'une caméra Q-imagerie) et de recueillir toutes les images à un grossissement de 1X à ailettes avec NIS éléments logiciels . La nageoire devraient être répartis pour l'imagerie de sorte qu'il est complètement sorti sans étirement ou endommager le tissu et doivent être exempts de toute gouttelettes d'eau. Par souci de cohérence, placez toujours le côté dorsal vers la droite.
  6. Imprimez des images et mesurer le gro régénérativewth zone en utilisant le logiciel Image J et l'utilisation d'une feuille de travail. Tracez le contour de la surface totale de la nouvelle croissance et de déterminer la région. Chaque mesure doit être effectuée cinq fois en moyenne et pour assurer l'exactitude du tracé. Il est important que les images utilisées n'ont pas les ombres ou les gouttelettes d'eau que ceux-ci contribuent à des erreurs dans la mesure de la zone de prolongement.
  7. Mesurer la longueur de l'emplacement amputation long de l'axe dorsal-ventral et diviser la superficie déterminée en 3,6 par cette mesure. Cela permet poissons de différentes tailles pour être comparés directement.

4. Génération de la mémoire métabolique (MM) Zebrafish

  1. Initier un groupe de poissons DM et leurs contrôles appropriés tels que décrits à l'article 1.
  2. A 21 jours de déterminer la FBGL pour un sous-ensemble du groupe et de diviser le poisson DM en 2 sous-groupes. Continuer hebdomadaire STZ injections pour l'un des groupes que les commandes DM pour la durée de l'expérience. Cessez injection de STZ pour le deuxième groupe et Incubate le poisson à une température normale. Dans les 14 jours ce sera le poisson-zèbre restaurer l'insuline et de glucose sanguin normal de contrôle grâce à la régénération du pancréas. Ces poissons sont maintenant appelés MM (poisson mémoire métabolique).
  3. Au jour 30 après élimination du médicament amputer les nageoires caudales de contrôle, le SM et MM poissons via la méthode décrite au point 3.2.
  4. Retour du poisson aux conditions hydrologiques normales pour la régénération des nageoires pendant 30 jours. Cela permet à la croissance de ce que nous appelons, tissus mémoire métabolique.
  5. Au 60 e jour d'effectuer une deuxième amputation (tel que décrit à la section 3.2) dans le tissu qui a été régénéré dans la période comprise entre 30-60 jours et effectuer le test de la nageoire caudale de régénération (3.1 à 3.7) Figure 1.
  6. Isoler les tissus et d'effectuer le dosage de l'intérêt. Voir le tableau 1 pour un résumé du protocole.

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Résultats

Type I zèbre diabétique non seulement afficher les complications connues secondaires de la rétinopathie et de la néphropathie, mais aussi, présentent une complication supplémentaire: altération de régénération de la nageoire caudale. Cette complication plus tard persiste en raison de la mémoire métabolique chez les poissons qui ont rétabli le contrôle du glucose normale après une période d'hyperglycémie. Dans la figure 2A (contrôle) et la figure 2B (mémoire métabolique) des images r...

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Discussion

Le diabète sucré est une maladie de la dysrégulation métabolique, initialement diagnostiquée comme l'hyperglycémie, qui aboutit finalement à des dommages des vaisseaux sanguins conduisant à de nombreuses complications qui persistent même après tout euglycémie est atteint si l'intervention pharmaceutique. Cette persistance de complications est appelée mémoire métabolique et plusieurs études récentes ont examiné le rôle que jouent les mécanismes épigénétiques dans ce phénomène. Ici, nous avons détaillé un protocol...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche de la Fondation de la famille Iacocca, Rosalind Franklin University fonds de démarrage et les National Institutes of Health Grant DK092721 (à RVI). Les auteurs tiennent à remercier Nikki intine de l'aide dans la préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires (optionnel)
Streptozocine Sigma Aldrich S0130
2-phénoxyéthanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (taille 10) Fisher Scientific 089275A
Boîtes de Pétri Fisher Scientific 08-757-13
½ cc seringue, 27 1/2 aiguille de la jauge Fisher Scientific 305620
QuantiChrome gluckit de dosage ose. Systèmes d'essais biologiques Digl-100
Chlorure de sodium Sigma Aldrich S3014
Microscope à dissection Nikon TMZ-1500 Toute microscope à dissection est très bien.
Caméra d'imagerie Nikon Q imagerie N'importe quelle caméra est approprié.
Image J logiciels National Institutes of Health NIH Image
Éléments NIS Nikon N'importe quel logiciel d'imagerie est approprié.

Références

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