De cellules vivantes analyse du cycle de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissus en utilisant le Attune acoustique Cytometer Concentrer et Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain

Résumé

Un protocole pour l'analyse du cycle cellulaire de vivants Drosophila Tissus en utilisant le Attune acoustique Cytometer mise au point est décrit. Ce protocole fournit simultanément des informations sur la taille relative de la cellule, le nombre de cellules, la teneur en ADN et le type de cellule via lignée de traçage ou de l'expression tissulaire spécifique des protéines fluorescentes In vivo.

Résumé

La cytométrie en flux a été largement utilisé pour obtenir des informations sur le contenu de l'ADN dans une population de cellules, de déduire pourcentages relatifs aux différentes phases du cycle cellulaire. Cette technique a été étendu avec succès aux tissus de la mitose de l'organisme modèle Drosophila melanogaster pour les études génétiques de la régulation du cycle cellulaire in vivo. Lorsqu'il est couplé avec l'expression de la protéine fluorescente spécifique de type cellulaire et les manipulations génétiques, on peut obtenir des informations détaillées sur les effets sur le nombre de cellules, la taille des cellules et cycle cellulaire élimination in vivo. Cependant, cette méthode cellules vivantes a misé sur l'utilisation de la cellule perméable Hoechst 33342 DNA-intercalant, limitant les utilisateurs à cytomètres équipé d'un laser UV. Nous avons modifié ce protocole à utiliser un colorant plus récent ADN des cellules vivantes, Vybrant DyeCycle Violet, compatible avec le laser violet 405nm plus commun. Le protocole présenté ici permet une analyse du cycle cellulaire efficace couplé avec cellulele type, la taille relative de la cellule et des informations de nombre de cellules, dans une variété de tissus de Drosophila. Ce protocole étend la technique utile du cycle cellulaire d'analyse des tissus vivants drosophile à un petit analyseur de paillasse, le Attune acoustique Cytometer mise au point, qui peut être exécuté et maintenu sur une échelle unique laboratoire.

Introduction

La cytométrie en flux est utilisée pour les mesures de viabilité des cellules, la taille des cellules par rapport, le contenu de ADN et l'expression de la protéine fluorescente dans les populations de cellules vivantes. En raison de la réplication de l'ADN nucléaire au cours de la phase S, des informations sur la teneur en ADN dans une population de cellules peuvent être utilisées pour déduire pourcentages relatifs aux différentes phases du cycle cellulaire ^1-3. Cette méthode est devenue une pierre angulaire de l'analyse du cycle cellulaire dans des systèmes modèles de la levure aux mammifères.

La mouche Drosoph....

Protocole

1. Fly élevage

1. Cross vole de génotypes désirés dans des flacons en plastique étroites avec 10 ml de levure Glucose Moyen ³ ou d'autres médias riches en protéines de votre choix. Les nombreux outils transgéniques Drosophila disponibles pour l'expression spécifique du tissu et de la lignée de traçage avec l'expression de la protéine fluorescente in vivo sont décrits en détail ailleurs ^4,5. Transfert aux parents de flacons frais quotidiens d'obtenir des séries de 24 h collections de la descendance, ou pour la stadification plus précise, recueillir des embryons sur des plaques d'agar-agar et ....

Résultats

La figure 2 montre des résultats représentatifs d'un échantillon d'aile larvaire, exprimant la GFP dans la moitié postérieure du tissu, en utilisant le modèle de GFP fourni. Des résultats similaires sont obtenus avec le même type de tissu et le modèle d'expression pour DP en utilisant le modèle DP fourni (figure 3A). Les modèles et les tensions fournies (tableau 2) sont adaptés à l'analyse des yeux larvaires (figure 3B), la cervelle et les ailes, ainsi q.......

Discussion

Le protocole décrit ici permet une analyse de cycle cellulaire, la taille relative de la cellule et le nombre relatif de cellules dans les tissus vivants drosophile à différents stades de développement. Lorsque cette analyse est couplée avec l'expression de la protéine fluorescente spécifique du type de cellule ou lignée de traçage, des informations détaillées peuvent être obtenues sur les réponses cellulaires au cycle cellulaire discrète ou perturbations de croissance. Comme preuve de principe, nous avons .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12x75 mm Polystyrène à fond rond 5 ml Tube à essai	BD Falcon 352058		tubes de 5 ml
Attune Acoustic Focusing Cytometer	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	configuration Bleu / Violet
Logiciel de cytomètre Attune (version 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC uniquement
Perles de suivi de performance Attune (5 x 106 billes/ ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	Pour le test de performance quotidien
Dumont #5 Pince en inox	Outils de science fine	11251-20
Boîtes d’embryons 30 mm x 12 mm	Microscopie électronique Sciences	70543-30	Boîtes de dissection en verre
Eppendorf Thermomixeur	Eppendorf	022670051
Trypsine-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tü ; bingen Ciseaux à ressort	Outils scientifiques fins	15003-08	Tranchant droit 5mm
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Life Technologies/ Invitrogen	V35003
Table 1. Réactifs et instruments requis.
Solution de coloration d’ADN vivant (10 ml) : 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ PBS libre (pH7.2) 9 ml 10X Trypsine-EDTA (Sigma) 5 &mu ; l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (notez qu’il s’agit de 0,25 fois la concentration recommandée pour les cellules de mammifères. Nous constatons que des concentrations plus élevées sont toxiques pour les cellules drosophile.) 10X Ca2+ Mg2+ PBS libre (pH7.2) : 1,37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasique), 20mM KH2PO4 (monobasique) ajusté au pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1 Threshold (x1000) 100 10 10 10 Tension (mV) 2950 4250 1800 1150 Table 2. Réglage du seuil et de la tension pour l’analyse de la figure 2.