Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

Résumé

Ce protocole décrit une procédure d'explantation amélioré qui implique Ex utero Électroporation, la dissection et la culture de tout hémisphères cérébraux de l'embryon de souris. La préparation facilite les études pharmacologiques et des essais de la fonction des gènes au cours du développement cortical précoce.

Résumé

Développement cortical implique des interactions complexes entre les neurones et les non-neuronales, y compris des éléments précurseurs de cellules, des vaisseaux sanguins, les méninges et associé matrice extracellulaire. Parce qu'ils fournissent un environnement propice organotypique, les explants tranches corticales sont souvent utilisées pour étudier ces interactions qui contrôlent la différenciation neuronale et le développement. Bien que bénéfiques, le modèle d'explant tranche peuvent souffrir d'inconvénients, y compris stratification cellulaire aberrante et la migration. Nous rapportons ici l'ensemble du système cérébral explant hémisphère pour les études du développement cortical précoce qui est plus facile à préparer que les tranches de cortex et spectacles cohérente de migration organotypique et le laminage. Dans ce système modèle, la stratification précoce et les schémas de migration se dérouler normalement pour une période de deux jours in vitro, y compris la période de séparation preplate, au cours de laquelle prospective couche corticale six formes. Nous avons ensuite développé une électroporation ex utero (EUEP)approche qui connaît un succès ~ 80% dans le ciblage expression de la GFP pour les neurones en développement dans le cortex dorsal médial.

Le modèle hémisphère explant rend développement précoce corticale accessibles pour l'électroporation, une intervention pharmacologique et des approches d'imagerie en direct. Cette méthode permet d'éviter la chirurgie de survie nécessaire d'électroporation in utero (IUEP) des approches tout en améliorant à la fois la transfection et la cohérence de surface de ciblage. Cette méthode facilitera les études expérimentales de la prolifération, la migration neuronale et de la différenciation.

Introduction

Les formes de mammifères cortex cérébral à travers la prolifération, la migration concertée et la différenciation des neurones générés successivement. Chaque neurone est né dans la zone ventriculaire (VZ) et migre du VZ dans la zone intermédiaire (IZ), la formation de la plaque corticale (CP) ^1. Lors de leur passage à travers les différents domaines corticaux, les neurones migrent afficher de multiples modes de migration ^2,3 qui dépendent de l'environnement extracellulaire et d'autres éléments cellulaires (par exemple, la glie radiale) dans le tissu développement. Les neurones corticaux puis arrêter la migration en haut de la pl....

Protocole

1. Électroporations ex utero avec Expression Green Fluorescent Protein plasmide

1. Plasmide solutions d'injection d'ADN sont préparés avec CAG-eGFP ADN ²⁷ dilué à la concentration de travail finale de 0,33 mg / ml dans ddH ₂ O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sont utilisés pour purifier le plasmide à partir de bactéries transformées. Rapide colorant vert à ~ 0,02% (p / v final) est ajouté à la solution d'ADN en tant que traceur injection.
2. Pour préparer la zone chirurgicale, arroser paillasse et le stade microscope à dissection avec une solution d'éthanol à 70% et essuyez-le. Vaporiser ciseaux chirurgicaux e....

Résultats

Le rongeur embryonnaire cortex présente un gradient de neurogénétique transversale tout au long de la période de développement, tels que le néocortex latéral est d'environ 1 jour plus mature que dorsale médiale néocortex ^28. Le nombre de neurones couche 6 est ainsi généré (c'est à dire présenter leur dernière phase S) sur E12 dans le cortex latéral (également appelé champ 40 ⁵⁾ et à E13 dans le cortex médial dorsale (également appelé champ 1 ^5). Fractionnement Preplate c.......

Discussion

Nous avons amélioré et évalué un modèle expérimental - explants hémisphère entiers - pour l'étude du développement cortical précoce (E13-E15). Le modèle s'est révélé utile pour l'analyse de la migration et de la différenciation de la lignée neurone excitateur qui constitue la couche 6 du cortex cérébral ^25,37. Les principaux avantages du système sont: 1) la croissance organotypique pour 2 DIV, 2) la simplicité de préparation, et 3) l'accès expérimental aux neurones pour l'électroporation, .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
s forts
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Supplément 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Sans Sérum Suppl. 50X	Invitrogen	1504-044
Stylo / Strep Liquide 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
Insert de culture enrobé de collagène	Costar	3492
Gélatine de peau bovine	Sigma	G9382
H– ; chst 33342	Invitrogen	H1399
Sérum bovin Albumine	Sigma	7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Equipment
BTX 830 Électroporateur	Harvard Appareil	450052
Pince à épiler électrodes 10mm	Harvard Apparatus	450166
Incubateur	Billups Rothenberg	MIC-101
Hamilton seringue (5uL)	Hamilton	87930
Hamilton aiguille seringue	Hamilton	7803-04	Spécifiez 1" et style 4
Dumont #5 Forceps	FST	11251-10
Ciseaux fins Tough Cut 9 cm	FST	14058-09