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Article de méthode

Ex utero électroporation et explants hémisphère: Une méthode simple expérimental pour les études du développement cortical précoce

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DOI :

10.3791/50271

⸱

3 avril 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une procédure d'explantation amélioré qui implique Ex utero Électroporation, la dissection et la culture de tout hémisphères cérébraux de l'embryon de souris. La préparation facilite les études pharmacologiques et des essais de la fonction des gènes au cours du développement cortical précoce.

Résumé

Développement cortical implique des interactions complexes entre les neurones et les non-neuronales, y compris des éléments précurseurs de cellules, des vaisseaux sanguins, les méninges et associé matrice extracellulaire. Parce qu'ils fournissent un environnement propice organotypique, les explants tranches corticales sont souvent utilisées pour étudier ces interactions qui contrôlent la différenciation neuronale et le développement. Bien que bénéfiques, le modèle d'explant tranche peuvent souffrir d'inconvénients, y compris stratification cellulaire aberrante et la migration. Nous rapportons ici l'ensemble du système cérébral explant hémisphère pour les études du développement cortical précoce qui est plus facile à préparer que les tranches de cortex et spectacles cohérente de migration organotypique et le laminage. Dans ce système modèle, la stratification précoce et les schémas de migration se dérouler normalement pour une période de deux jours in vitro, y compris la période de séparation preplate, au cours de laquelle prospective couche corticale six formes. Nous avons ensuite développé une électroporation ex utero (EUEP)approche qui connaît un succès ~ 80% dans le ciblage expression de la GFP pour les neurones en développement dans le cortex dorsal médial.

Le modèle hémisphère explant rend développement précoce corticale accessibles pour l'électroporation, une intervention pharmacologique et des approches d'imagerie en direct. Cette méthode permet d'éviter la chirurgie de survie nécessaire d'électroporation in utero (IUEP) des approches tout en améliorant à la fois la transfection et la cohérence de surface de ciblage. Cette méthode facilitera les études expérimentales de la prolifération, la migration neuronale et de la différenciation.

Introduction

Les formes de mammifères cortex cérébral à travers la prolifération, la migration concertée et la différenciation des neurones générés successivement. Chaque neurone est né dans la zone ventriculaire (VZ) et migre du VZ dans la zone intermédiaire (IZ), la formation de la plaque corticale (CP) 1. Lors de leur passage à travers les différents domaines corticaux, les neurones migrent afficher de multiples modes de migration 2,3 qui dépendent de l'environnement extracellulaire et d'autres éléments cellulaires (par exemple, la glie radiale) dans le tissu développement. Les neurones corticaux puis arrêter la migration en haut de la plaque de formage corticale dans les processus d'arrêt coïncidant migration neuronale et 4 dendritogénèse.

Développement cortical est initiée entre embryonnaires jours 11-13 (E11-13) 5 à travers la couche de mise en place primordiale plexiforme 6 ou preplate (PP), une couche de neurones pionniers qui recouvre le VZ. Éventuelcouche 6 neurones corticaux (c'est à dire les premiers neurones corticaux nés dans le VZ) puis orienter leur corps cellulaire dans un modèle stéréotypé et se fondre en une couche distincte au sein du PP 7. Ces événements diviser le preplate dans une superficielle marginale (future couche corticale 1) et une zone de profondeur, ce dernier composé de cellules sous-plaque (transitoire couche corticale 7). Ce processus, appelé le fractionnement preplate, est un événement fondamental dans la croissance future du cortex cérébral 8.

De nombreuses mutations génétiques ont été identifiés qui perturbent les différents aspects du développement cortical 9. Développement cortical peut également être affectée négativement par l'exposition à des toxines ingérées telles que la cocaïne et l'alcool 10 11. Parce que des malformations corticales qui se posent au cours du développement sont probablement contribué à des troubles neurologiques (autisme, par exemple, la schizophrénie), les enquêtes empiriques de perturbations du développement cortical sont inhérentesment important. Il est donc d'une importance considérable pour établir des approches pour étudier le développement cortical qui permet des tests rapides d'effets génétiques ou de la toxine mais aussi de préserver les interactions possibles entre les neurones de différenciation, d'autres types cellulaires et la matrice extracellulaire (ECM) au cours de cette première période de 12 le développement du cerveau .

Explants tranche 13 ont fourni un tel système et ont été largement utilisés pour analyser neurone développement cortical 14-16. Toutefois, les essais de tranche peuvent souffrir de l'inconvénient que la migration neuronale et de stratification peut être anormale 17 probablement en raison de dommages aux cellules méningées qui entourent le cerveau en développement et l'ancrage du gliales radiales échafaud. Comme radiales fibres gliales sont un substrat important pour la migration des neurones corticaux 18 rupture de la membrane basale par tranchage peut perturber localement radiale l'architecture des cellules gliales et conduire à la migration corticale altérée. En outre, le sliced surfaces d'explants fournit une région de cellules mortes qui peuvent modifier la composition normale de l'ECM dans ces domaines.

Des approches plus récentes ont concentré leur analyse sur les cellules situées au fond de la tranche qui sont entourés par des types de cellules appropriées sains et ECM. Toutefois, dans certains cas, ces nouvelles approches peuvent exiger que l'original tranche épaisse culture cryo-être sectionné ou de la paraffine après fixation de section afin que l'intérieur relativement normal de la tranche est mis à disposition pour l'analyse de 19-21. À la fois l'origine vibratome sectionnement pour préparer les tranches en direct pour la culture, ainsi que la découpe au cryostat ultérieur de tranches fixes pour l'analyse nécessitent des soins et de l'effort de ces dosages à travailler.

Pour assurer une approche simple et complémentaires pour les études du développement cortical début, nous avons modifié l'approche d'une tranche existante de 13 à faciliter les études du développement cortical précoce. Nous avons développé un whmodèle ole explant hémisphère semblable à un modèle existant E14 hémisphère qui a impliqué cultures secousses à 65 rotations par minute et permet la croissance organotypique pour 16-18 heures 22,23. Dans notre approche, les explants hémisphère entières sont placées sur membrane semi-perméable 13 avec la culture, dans une atmosphère d'oxygène à haute 21,24 organotypique de prolonger la croissance corticale pendant 48 heures. Cette approche permet également d'électroporation cohérente de développement des neurones corticaux. Les embryons sont retirés de l'utérus et une électroporation pour introduire l'ADN plasmidique et le télencéphale est ensuite découpé. Chaque hémisphère est isolé et placé côté médial vers le bas sur un filtre revêtu de collagène. L'explant est ensuite mis en culture pour une période de 48 heures, une période qui englobe 8 fractionnement preplate. Au cours de la période de culture, les neurones L6 développer à partir de précurseur de neurone différencié 25, correctement positionnée à l'intérieur de la plaque corticale. Tout au long de cette période, le développement deneurone est entouré par l'ECM approprié et des types de cellules qui face la cellule correspondant in vivo. Ce système a déjà avéré utile pour déchiffrer les événements cellulaires qui sous-tendent toxicité de l'éthanol 26, couche 6 formation et diviser preplate 7,25.

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Protocole

1. Électroporations ex utero avec Expression Green Fluorescent Protein plasmide

  1. Plasmide solutions d'injection d'ADN sont préparés avec CAG-eGFP ADN 27 dilué à la concentration de travail finale de 0,33 mg / ml dans ddH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sont utilisés pour purifier le plasmide à partir de bactéries transformées. Rapide colorant vert à ~ 0,02% (p / v final) est ajouté à la solution d'ADN en tant que traceur injection.
  2. Pour préparer la zone chirurgicale, arroser paillasse et le stade microscope à dissection avec une solution d'éthanol à 70% et essuyez-le. Vaporiser ciseaux chirurgicaux et des pinces d'éthanol à 70% avant la dissection et essuyez-le.
  3. Timed enceintes suisses / Webster barrages sont sacrifiés sur E13 par transfert dans une chambre remplie de CO 2 d'un cylindre pressurisé et le barrage est surveillé jusqu'à ce que tout mouvement a cessé pendant au moins 1 min. Après sacrifice par inhalation de CO 2 les embryons sont retirés de l'utérus et mis enune boîte de Pétri de 10 cm de glace contenant Hanks froide solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
  4. Disséquer soigneusement chaque embryon à partir des membranes extra-embryonnaires environnantes et garder à l'glacées HBSS.
  5. Transférer chaque embryon individuellement à un deuxième plat de 10 cm de Petri contenant HBSS froid. Utiliser une seringue pour injecter Hamilton 2-3 pl de l'ADN mélange vert rapide dans le ventricule de l'hémisphère cérébral gauche, en prenant soin d'injecter dans une zone corticale spatialement séparée de la zone corticale pour une analyse ultérieure.
  6. Pour électroporation, maintenez l'embryon délicatement avec une pince et placez la pagaie légère positive de l'électrode pince sur la ligne médiane dorsale de la tête et légèrement négative placez la pagaie sous le menton embryon. Électroporations sont atteints avec un électroporateur BTX830 programmé pour livrer cinq 30 impulsions V de 50 ms de durée, séparées par des intervalles ms 950. Ces réglages sont pour le modèle BTX830. D'autres systèmes peuvent être utilisés selon les instructio fabricantns.

2. Préparation des explants hémisphère entier

  1. Après électroporation les embryons sont replacés dans glacées HBSS. Le cerveau est prélevé au moyen de deux pinces de bijoutier n ° 5 pour enlever la peau et le crâne cartilagineux de la tête de l'embryon. Une pince est ensuite glissé sous le cerveau pour retirer le cerveau intact du crâne. L'hémisphère électroporation (à gauche) est ensuite disséqué loin du cerveau et attaché mi-tissu cérébral est retiré. Tout au long de la prise en charge technique de dissection est prise de ne pas endommager les méninges recouvrant l'hémisphère gauche corticale.
  2. Une fois disséqué chaque embryon est transféré dans HBSS l'aide d'une pipette avec une pointe de coupe 1 ml pipette. L'hémisphère est ensuite expulsé doucement sur un insert de culture revêtus de collagène. Jusqu'à six explants hémisphère sont disposés côté médial vers le bas sur chaque insert de 24 mm. Une fois disposées, HBSS en excès est éliminé de l'insert et l'insert est ensuite placé dans une 35 mm et d'une boîte à 6 puits. Le bien contient exacte 2,7 ml de médias: DMEM-F12 supports contenant Glutamax et additionné de 2% B-27, 1% et 1% G5 pénicilline-Strep. Quelques gouttes des médias du puits peut être introduit à la pipette au-dessus de chaque explant, mais ne pas ajouter des médias au-delà de l'original 2,7 ml par puits.
  3. Une fois les explants ont été placés sur des filtres de collagène le plat à 6 puits contenant les explants sont placés dans un Billups Rothenberg (BR) chambre (qui contient également un plat d'humidification de l'eau). A 95% / 5% d'oxygène / CO 2 du mélange gazeux est injecté dans la chambre pendant au moins 1 min avant de sceller la chambre fermée et la déconnexion 95% / 5% d'oxygène / CO 2 du tube d'alimentation en gaz. La chambre de BR est ensuite placé dans un 37 ° C incubateur de culture tissulaire pour le reste de la période de culture, 1-2 DIV.

3. Fixation des tissus explantation pour histologie

  1. Dans une hotte préparer la solution de fixation Pagano en commençant par solubilisation 8 g de paraformaldéhyde dans 100 ml d'préchauffé (~ 80 & deg, C) ddH 2 O. Ajouter 1-3 gouttes de NaOH concentrée pour favoriser la solubilisation et remuer doucement. Une fois solubilisé mélanger la solution de paraformaldéhyde 8% de 1:1 avec une solution qui est de 500 mM de saccharose, Hepes 100 mM, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM de KCl pour une concentration finale de paraformaldéhyde 4% de saccharose dans 250 Hepes mm 50 mm , 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
  2. Pour fixer les explants réchauffer la solution fix Pagano à 37 ° C. Supprimer rapidement la plupart des DMEM/F12 médias de chaque puits de culture et ajoutez 5 ml de Fix Pagano dans chaque puits d'explants. Assurez-vous de couvrir chaque explant complètement en solution. Fixer pendant 1 heure à température ambiante. Ne retirez pas explants de filtre avant 1 h de fixation.
  3. Après fixation éliminer la solution de correction Pagano et la remplacer par une solution Pagano sans correction (250 mM HEPES 50 mM de saccharose, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de KCl, pH 7,4). Ajouter quelques gouttes d'azoture de sodium à 10% et conserver à 4 ° C jusqu'à incorporer.

4. Intégration et Sectioning pour histologie

  1. Préparer une solution de veau à 10% la gélatine de peau en solubilisant 10 g de gélatine de peau de veau dans 100 ml d'eau tiède (55-60 ° C). Placez une solution de gélatine sur une plaque chauffante réglée à 60 ° C et agiter périodiquement jusqu'à solubilisé.
  2. Verser environ 10 ml de la solution de gélatine à 10% dans le fond d'une boîte de Petri de 10 cm et 30 min permettre de se solidifier. Cela formera un "pad" pour l'intégration des explants. Ces tampons peuvent être des jours préparés à l'avance et stocké à 4 ° C. Utilisez une règle pour tracer une grille sur le fond de la boîte de Pétri et le transfert des explants individuels dans chaque case de la grille. Enlever les résidus solution Pagano et à l'aide d'une pipette, couvrir chaque explant avec une solution de gélatine chaude 10% et laisser se solidifier. Reprendre l'addition lente d'une solution de gélatine jusqu'à ce que chaque explant est complètement entourée par la gélatine, en prenant soin de ne pas faire fondre le tampon par addition de trop chauffer la gélatine à la fois. Permettre la gélatine à durcir pendant ~ 1 heure. Une fois durci le particulierexplants UAL peut être découpée en petits blocs de gélatine. Les blocs sont ensuite post-fixée dans Pagano fixer pendant 24-48 heures avant la coupe avec un vibratome.
  3. Explants dans les blocs de gélatine sont positionnés bulbe olfactif et en coupe dans le plan frontal à 100 pm d'épaisseur. Les coupes sont recueillies et stockées dans du PBS + 0,1% d'azoture de sodium à 4 ° C jusqu'à leur traitement immunohistochimique.
  4. Détection immunohistochimique est réalisée par le transfert de sections dans une plaque à 24 puits (2-3 sections par puits). Premier bloc non spécifique de liaison d'anticorps en ajoutant 0,5 ml de PBST + B (PBS + 0,5% de Triton X 100 et 2% de BSA) à chaque puits, incuber 1 h sous agitation douce. L'anticorps primaire appropriée est ensuite dilué dans du PBST + B et de 0,4 ml par puits est ajouté pour une nuit d'incubation à température ambiante. Le premier est lavé avec du PBS 3X lave pendant au moins 10 minutes chacune. L'anticorps secondaire et 2 pg / ml Hoechst 33342 colorant nucléaire sont ensuite diluées dans du PBST + B et les échantillons sont incubés pendant 2 heures à la température ambianteen agitant doucement. Trois lavages PBS (10 min chacun) sont effectués, puis les coupes sont montées sur des lames à l'aide de 90% de glycérol Tris 50 mM, pH 7,4, milieu de montage.

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Résultats

Le rongeur embryonnaire cortex présente un gradient de neurogénétique transversale tout au long de la période de développement, tels que le néocortex latéral est d'environ 1 jour plus mature que dorsale médiale néocortex 28. Le nombre de neurones couche 6 est ainsi généré (c'est à dire présenter leur dernière phase S) sur E12 dans le cortex latéral (également appelé champ 40 5) et à E13 dans le cortex médial dorsale (également appelé champ 1 5). Fractionnement Preplate c...

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Discussion

Nous avons amélioré et évalué un modèle expérimental - explants hémisphère entiers - pour l'étude du développement cortical précoce (E13-E15). Le modèle s'est révélé utile pour l'analyse de la migration et de la différenciation de la lignée neurone excitateur qui constitue la couche 6 du cortex cérébral 25,37. Les principaux avantages du système sont: 1) la croissance organotypique pour 2 DIV, 2) la simplicité de préparation, et 3) l'accès expérimental aux neurones pour l'électroporation, ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.

Remerciements

Ce travail a été soutenu subventions du NINDS (NS066071) et le NIAAA. (P50AA017823) à NML. Les auteurs remercient le Dr Robert Quinn et le personnel du ministère des Ressources animales de laboratoire pour le soin des animaux. Nous remercions Judson Belmont pour le support technique, Nicole Belletier de l'aide en tant que chercheur d'été de premier cycle (SURF). Nous remercions également le Dr David Cameron pour les commentaires et les modifications sur une version antérieure du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
s forts
DMEM/F12 + GlutaMAXGIBCO10565
G5 Supplément 100XInvitrogen17503-012
B27 Sans Sérum Suppl. 50XInvitrogen1504-044
Stylo / Strep Liquide 100XInvitrogen15140-122
HBSS 500 mlGIBCO14025
Insert de culture enrobé de collagène Costar3492
Gélatine de peau bovine SigmaG9382
H– ; chst 33342InvitrogenH1399
Sérum bovin AlbumineSigma7906
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
Equipment
BTX 830 ÉlectroporateurHarvard Appareil450052
Pince à épiler électrodes 10mmHarvard Apparatus450166
IncubateurBillups RothenbergMIC-101
Hamilton seringue (5uL)Hamilton87930
Hamilton aiguille seringueHamilton7803-04Spécifiez 1" et style 4
Dumont #5 ForcepsFST11251-10
Ciseaux fins Tough Cut 9 cmFST14058-09

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