Imagerie directe du calcium ER avec Targeted-estérase colorant induit Chargement (TED)

Résumé

Targeted-estérase induite colorant chargement (TED) appuie l'analyse de la dynamique intracellulaire des magasins de calcium par imagerie de fluorescence. La méthode se fonde sur le ciblage d'une carboxylestérase recombinant pour le réticulum endoplasmique (RE), où il améliore le démasquage locale de synthétique de faible affinité Ca ^{2 +} Colorants indicateurs dans la lumière du RE.

Résumé

Visualisation de la dynamique de calcium est important de comprendre le rôle du calcium dans la physiologie cellulaire. Pour étudier la dynamique de calcium, Ca ^{2 +} fluorescents indicateurs ^de synthèse sont devenus populaires. Ici, nous démontrons TED (= ciblée estérase induite colorant chargement), une méthode pour améliorer la libération de Ca ^{2 +} colorants indicateurs dans la lumière du RE de différents types de cellules. À ce jour, TED a été utilisé dans des lignées cellulaires, les cellules gliales et les neurones in vitro. Bases TED sur l'efficacité, le ciblage d'une activité à haute carboxylesterase à la lumière du RE en utilisant vecteurs constructions recombinant qui carboxylestérases express (CES). Les derniers vecteurs TED contiennent un élément central de CES2 fusionné à une protéine fluorescente rouge, permettant ainsi à l'imagerie à deux couleurs simultanément. La dynamique du calcium libre dans l'ER sont imagés dans une couleur, tandis que la structure ER correspondant apparaît en rouge. Au début de la procédure, les cellules sont transduites avec un lentivirus. Ensuite, les cellules infectées par unre ensemencées sur des lamelles pour enfin permettre l'imagerie des cellules vivantes. Ensuite, les cellules vivantes sont mises en incubation avec l'ester d'acétoxyméthyle (AM-ester) sous forme de faible affinité de Ca ^{2 +} indicateurs, par exemple Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, ou en alliage d'aluminium-Fura2-AM. L'activité de l'estérase dans les clive ER hors chaînes latérales hydrophobes à partir de la forme AM du Ca ^{2 +} et un indicateur fluorescent ⁺ complexe colorant / Ca ² hydrophile est formé et pris au piège dans la lumière du RE. Après chargement colorant, les cellules sont analysées au microscope à balayage laser confocal inversé. Les cellules sont continuellement perfusées avec des solutions de Ringer-like et la dynamique de calcium ER sont directement visualisés par l'imagerie time-lapse. libération de calcium à partir de l'ER est identifiée par une diminution de l'intensité de fluorescence dans les régions d'intérêt, tandis que le remplissage de la réserve de calcium ER produit une augmentation de l'intensité de fluorescence. Enfin, la variation de l'intensité de fluorescence au cours du temps est déterminée par le calcul de AF / F _0.

Introduction

Afin de résoudre réponses calciques physiologiques de l'ER, nous avons développé une nouvelle stratégie pour améliorer le piégeage des colorants sensibles de calcium synthétiques dans l'ER. La méthode permet à l', non perturbatrice surveillance en temps réel directement sans calcium ER en présence de calcium extracellulaire.

Fonction et signalisation de calcium ER

signaux de calcium se trouvent dans différents types cellulaires, cellules musculaires par exemple, les neurones et les cellules gliales et leur gamme de fonctions de médiation contraction musculaire à une implication dans la transmission synaptique dans l'apprentissage et de la mémoire ^1,2. Les variations de la concentration en calcium libre sont de grand intérêt scientifique parce que le calcium est impliqué dans la régulation de la transcription génique, la prolifération cellulaire, l'excitabilité neuronale, la mort cellulaire et autre signalisation cellulaire événements ^1-7. Tous ces signaux calciques cellulaires sont fonctionnellement liés et contribuent à intracellulaires de calciummagasin ^8-10 Dynamics.

Une caractéristique commune à tous les signaux de calcium est le flux de calcium entre l'espace extracellulaire, le cytosol et organites, principalement l'ER et les mitochondries. Cela provoque des changements dynamiques de la concentration de calcium dans ces organites, qui sont détectées par différents éléments de signalisation. En général, la concentration en calcium dans les intervalles entre ER 100 à 800 pM, dans le cytosol de la concentration de calcium est proche de 100 nm, et dans l'espace extracellulaire de la concentration est de l'ordre de 1 à 2 mM. Par conséquent, il est une force motrice chimique élevée pour le flux de calcium vers le cytosol ^2,9,10.

Les signaux calciques ER dérivés les plus couramment étudiées dépendent de la stimulation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), qui a ensuite activent la phospholipase C (PLC). PLC à son tour produit l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP ₃₎ ^1. Lors de la liaison de _IP3 à son receptor (IP _3-Rec, figure 1) dans le ER-membrane, les ions calcium sont libérés à partir de la lumière du RE. Historiquement, IP libération de calcium ₃ médiation de l'ER est le premier - même si indirectement - mesurée dans les cellules pancréatiques acineuses par Streb et al en 1983. ^11. Cette publication a suggéré pour la première fois une cascade de signalisation impliquant l'acétylcholine, la phospholipase C et IP _3. Cette façon de libération de calcium est généralement appelé IP libération de calcium ₃ induit (IICR) (Figure 1). Activation de kinases dépendant de la phospholipase Cy par récepteurs tyrosines kinases liens à l'action des facteurs de croissance et des facteurs neurotrophiques pour ER signalisation IP après ₃ Altitude ¹² calcium. En plus de IICR, l'élévation du calcium peut être médiée par l'entrée du calcium ionotropique, par exemple via des canaux calciques voltage-dépendants (Ca _V), et après la libération de calcium induite par le calcium (CICR) par ryanodine reprécepteurs (RyR). IICR et CICR sont physiologiquement liés à l'entrée du calcium magasin fonctionnant (SOCE). SOCE comprend l'action de STIM (molécule interagissant stroma), qui est un capteur pour ER libération de calcium. STIM a été montré pour stimuler l'entrée du calcium extracellulaire par les voies de passage des récepteurs potentiels (TRP) ^13, les canaux calciques Orai ¹⁴ et même des canaux calciques voltage-dépendants ¹⁵ (Figure 1). Perte de calcium ER est dynamiquement sauvé par l'action du réticulum sarco-endoplasmique ATPase de calcium (SERCA), qui active les pompes de retour de calcium dans le RE. Blocage de la SERCA avec des médicaments tels que thapsigargine dévoile une perte continue de calcium ER dans le compartiment cytosolique. Ce ER calcium «fuite» est causée par des complexes de pores intramembranaires ER tels que le complexe de protéine Sec61 ^16,17 (figure 1).

En 1998, Berridge a publié un modèle, le «neurone dans un modèle neuronal", which suggère un rôle physiologique de principe de l'ER dans l'intégration de calcium neuronal ^5. Ce modèle estime l'existence d'un système de membrane du RE continue formant une "image" intracellulaire de la membrane plasmique des neurones ^5. Ce système de membrane eucaryote binaire a été prétendu être une condition sine qua non pour l'intégration spatiale et temporelle des signaux calciques lents et rapides dans les neurones. signaux calciques qui se produisent soit concomitamment ou ultérieurement dans différents épines ou dendrites du neurone même sont conférés au soma ou le noyau via l'ER, où ils se résument ^5,18 de la cellule. Ensuite, leur somme peut avoir des effets sur l'excitabilité des neurones, la régulation de la transcription des gènes ou l'intégration des cascades de signalisation. Ainsi, l'ER soutient l'intégration de signaux calciques. Une condition préalable à ce concept est la continuité de l'ER dans une seule cellule, qui a été revendiquée par plusieurs études et qui a été prouvé au moins pour somato-dzones endritic et à courte distance des projections axonales ^19-21. Qu'il y ait continuité ER dans les projections axonales longues est un sujet de débat.

Les stratégies visant à mesurer le flux de calcium libre sur la membrane du RE

signaux calciques sont le plus souvent suivies dans le cytosol ^22,23. Par conséquent, il ne peut pas facilement être distingué s'il Ca ^{2 +} se déverse dans le cytosol de extracellulaire ou des réserves intracellulaires ^6,24. Pour contourner cette limitation, les stratégies méthodologiques pour l'imagerie directe de calcium ER ont été développés. En résumé, les stratégies suivantes sont utilisées: (1) ER-ciblées génétiquement protéines indicateurs ^25-27 faible affinité Ca ^{2 +} indicateurs à base de protéines utilisent la protéine bioluminescente aequorin ou GFP en combinaison avec une protéine de détection de calcium.. Ces Ca ^{2 +} indicateurs génétiquement modifiés (GECIS) peutêtre ciblée à l'urgence à l'aide d'un peptide signal et sont activement conservés à l'urgence en utilisant un motif de rétention et de récupération. Common ER Ca ^{2 +} base des indicateurs sur le principe de Cameleon Cameleon et sont la YC4.3 ^26,28; Cameleon scission YC7.3ER ²⁹ et Cameleon D1 ^30. (2) Direct chargement de colorant à base d'estérase de AM-ester de faible affinité Ca ^{2 + 31,32} indicateurs. Des colorants indicateurs (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM ou Fluo5N-AM) dérivés AM passer l' membranes biologiques dans un état lipophile, calcium insensible. Puis, dans le cytosol, ainsi que dans l'urgence, estérases endogènes cliver du groupe AM-ester et relâchez le Ca ^{2 +} indicateur, laissant derrière lui une certaine quantité de colorant actif dans le cytosol et dans l'urgence. Par conséquent, cette approche est utile dans des conditions d'une forte concentration de calcium dans le RE aussi longtemps que la concentration de calcium cytosolique reste bien en dessous de la deLimite de protection des indicateurs de faible affinité, en particulier pendant signaux calciques caractéristiques (par exemple nM à faible M). (3) chargement AM-ester en association avec la membrane plasmique perméabilisation ^32. Cytosolique de préférence Ca ⁺ indicateur restante est éliminée par ^deux plasma perméabilisation de la membrane avec de petites quantités d'un détergent "doux" (par exemple saponine) dans un tampon intracellulaire artificielle. Ainsi, les membranes intracellulaires peuvent être stimulées, par exemple avec l'IP ₃ dans le tampon intracellulaire, directement par "pores" dans la membrane plasmique. (4) Dialyse du cytosol sous configuration cellule entière et des mesures simultanées de Ca ^{2 +} dans la lumière du RE et le cytosol ^32,33. Une cellule est d'abord chargé avec une faible affinité Ca ^{2 +} indicateur (par exemple Mag-Fura2- AM, quotientométrique, UV). Ensuite, à l'aide d'une pipette de patch, tout reste CYTosolic faible affinité Ca ⁺ indicateur ² est dialysée sur le cytosol avec un tampon contenant un ^{Ca2 +} indicateur de haute affinité (par exemple Fluo-3, de la lumière visible). Cette stratégie permet l'enregistrement simultané de signaux dérivés cytosolique et ER. (5) Targeted-estérase colorant induit chargement ^8,34. Un carboxylestérase (CES) est destiné à la lumière de l'ER et fournit une haute activité de l'estérase de piégeage efficace de la forme AM-ester de faible affinité Ca ^{2 +} indicateurs.

Targeted-estérase induite colorant chargement (TED)

Pour améliorer le ciblage de faible affinité Ca ^{2 +} indicateurs à la lumière du RE, TED a été développé. TED nécessite la surexpression d'une carboxylestérase ER ciblée de la souris (CES2) (figure 2), ce qui est réalisé par l'intermédiaire d'assemblage d'expression. Les cellules exprimant un CES-construction recombinante sont incubés avec la forme AM-ester d'un calcium dansdicateur colorant (Fluo5N-AM, figure 2). Puis, dans l'urgence, le colorant est converti en Ca ^{2 +} sensibles, membrane imperméable Ca ^{2 +} complexe indicateur (Fluo5N/Ca ^{2 +)} par la forte activité de l'estérase, piégeant ainsi le colorant à une concentration élevée dans la lumière du RE ^{8 , 34.} La méthode est particulièrement utile pour étudier ER calcium-release via les IICR-voies, par exemple via des récepteurs métabotropiques, purinergiques ou glutamate ^8,34 et de visualiser ER épuisement de calcium via "canaux de fuite" directement, par exemple après le blocage de la SERCA ^{17 , 34.} Pour notre expérience, la faible affinité Ca ^{2 +} indicateur Fluo5N-AM est actuellement le meilleur indicateur disponible pour une utilisation avec la stratégie de chargement colorant TED. Fluo5N-AM a une faible affinité pour le Ca ^{2 +} (constante de dissociation K _D ~ 90 um, figure 2), est presque non-fluorescent dans sa AM-forme, mais fournit une grande émission de fluorescence sur Calciucontraignant m ^8,34. Le complexe Fluo5N/Ca ^{+ 2} peut être excité par une source de lumière standard de ~ 490 nm, ce qui correspond à des colorants standards tels que le FITC, Alexa 488, ou EGFP. Signaux calciques cytosoliques guère atteindre une concentration dans la gamme des basses pM et sont donc à peine détectés par Fluo5N dans le cytosol ^35.

Pour améliorer les performances de TED, plusieurs constructions de vecteurs recombinants ont été développés (Figure 3). A l'origine, les vecteurs TED basé sur la séquence codante du CES2 (RefSeq numéro d'accession NM_145603, CES2c) et meilleure performance TED est observée avec une expression stable de constructions CES. Nouveaux vecteurs TED expriment un élément central de CES2 fusionnée à la protéine de fluorescence rouge TagRFP-T2 ^36. Ces vecteurs ont l'avantage qu'ils peuvent être utilisés pour identifier les cellules transduites et d'utiliser la fluorescence rouge comme un contrôle interne pour la normalisation des changements dans Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescence. La fluorescence rouge offre également la possibilité de visualiser la répartition structurelle de l'ER et des changements dans la dynamique ER dans des conditions de stimulation.

Protocole

Ce protocole introduit TED appliqué aux lignes de cellules, les neurones hippocampiques et les cellules gliales corticales. Performances TED est meilleur quand vecteurs TED sont exprimé de façon stable, par exemple par des vecteurs lentiviraux. Un aperçu schématique de la méthode TED est montré dans la figure 4.

1. Préparation des solutions

Les solutions suivantes doivent être préparés avant de commencer et peuvent être stockés comme indiqué. Nous utilisons généralement en verre stérilisé et de matière plastique et de l'eau autoclave.

1. Préparer HEPES-Ringer (en mm): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 2 _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O.. Sans calcium HEPES-Ringer se compose de (en mM): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O et 0,1 EGTA.. Sans glucose ces solutions d'imagerie peuvent be stockées à 4 ° C. La quantité nécessaire de D-glucose est fraîchement ajouté avant emploi.
2. Pour une analyse de TED dans les neurones hippocampiques, liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) est recommandé. ACSF est composé de (en mM): 127 NaCl, 23 NaHCO _{3, 3} KCl, 2,5 NaHPO ₄ H ₂ O, 25 D-glucose.H ₂ O, 2 _{CaCl2, MgCl2} 2 .7 H ₂ 0 dans le trou DDH. ₂ 0.
3. Préparer Fluo5N-AM à une concentration de 5 mM. Pour aider à la solubilisation ajouter 8,9 ul de 20% de Pluronic F-127 (dans le DMSO, conservé à la température ambiante, à l'abri de l'humidité et de la lumière) à 50 pg de lyophilisé Fluo5N-AM. Puis solubiliser Fluo5N-AM au moyen d'un appareil à ultrasons à bain-marie pendant au moins 2 min. Entreposer des portions à 0,5 pi à -20 ° C, à l'abri de la lumière et de l'humidité.
4. Préparer antagoniste et les stocks d'agoniste selon les besoins. Par exemple: a) 10 mM ATP ou ADP (en H ₂ O, l'activation des récepteurs métabotropiques purinergiques), b) 10 mM carbachol dans H ₂ O (agonistedes récepteurs muscariniques de l'acétylcholine), c) l'acide 30 mM cyclopiazonique (CPA) dans le DMSO (bloqueur de la SERCA), d) DHPG 50 mM dans du PBS (métabotropique agoniste des récepteurs du glutamate de mGluR _I et mGluR _5), e) 10 Glutamate mM dans H ₂ S, f) une ionomycine mM dans du DMSO (ionophore), g) 5 thapsigargine mM dans du DMSO (bloqueur à haute affinité de la SERCA). Entreposer des portions à -20 ° C.
5. Les vecteurs lentiviraux: Ce protocole comprend l'utilisation de TED particules de vecteur d'expression lentiviral. Leur production et leur stockage ne fait pas partie de ce protocole. Nous utilisons des vecteurs lentiviraux de la deuxième génération pour le transfert de carboxylestérases recombinantes à des lignées cellulaires, les cellules gliales et les neurones. Nos bases du système lentiviraux sur le vecteur d'expression FUGW ^37, et les plasmides d'emballage pCMVΔR8.91 ou psPAX2 et le pseudotypage plasmide pMD2.G ^38,39. ATTENTION: considérer que le travail avec l'auto-inactivant les vecteurs lentiviraux recombinants nécessite l'attentionl'examen des lignes directrices en matière de biosécurité. Dans de nombreux pays, ces vecteurs sont considérés comme groupe à risque Biohazard 2. Pour plus d'informations, consultez http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Préparation et infection virale des souris neurones de l'hippocampe

1. Lavez lamelles de verre dans une boîte de Pétri en verre de 20 cm de diamètre (100 lamelles par boîte) 1x dans l'éthanol à 70% pour environ 30 min. Enfin, ajouter de l'éthanol à 100% (par an) pendant 2 min. Éliminer l'éthanol résiduel et sécher les lamelles sous une hotte stérile.
2. Préparer deux différents types de médias pour des cultures de neurones hippocampiques: (a) à moyen neurobasal avec B27 01h50; (b) complète: milieu neurobasal avec B27 1:50 Glutamax 1:100, 1:100 et N2 supplément. Filtrat stérile les médias et les stocker dans l'incubateur de cellules jusqu'à leur utilisation.
3. Un jour avant la dissection, les lamelles sont préparés en plaçant d'abord une stérile 10 mm lamelle dans chaquepuits d'une boîte de culture cellulaire quatre puits. Ensuite, bien enrober chaque lamelle avec 80-100 ul 0,1% de poly-L-lysine et de stocker les plats dans un incubateur pendant la nuit.
4. Au jour de la dissection et la culture de cellules, commencez par laver les lamelles trois fois avec 100 ul de HBSS et transférer 100 pi de milieu neurobasal à chaque lamelle. Placez les plats dans un incubateur pour atteindre l'équilibre (par exemple lors de la dissection de souris).

Dissection

Nous effectuons nos expériences avec des souris, conformément aux directives de l'Union européenne, approuvé par nos soins des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation.

5. Retirez le cerveau totale et disséquer les hippocampes bilatérale.
6. Retirez délicatement les méninges et les tissus autres que l'hippocampe et le lieu d'un hippocampe chacun dans un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de HBSS. Stocker le tissu sur la glace jusqu'à ce qu'un nombre suffisant d'hippocampes a été isolé.

Culture cellulaire

7. Ajouter 50 pi 1% de trypsine (Worthington) à chaque tube et incuber à 37 ° C au bain-marie pendant 15 min. Agiter les tubes de temps en temps. Pour arrêter la réaction de digestion, ajouter 50 ul d'inhibiteur de trypsine de 1% à chaque tube et inverser le tube plusieurs fois.
8. Transférer tous les tissus d'un maximum de 5 hippocampes à un tube Falcon 15 ml en évitant le transfert de liquide. Ajouter B27-moyen (a) pour un volume final de 5 ml.
9. Triturer le tissu à l'aide d'une pipette Pasteur en verre poli de feu par pipetage soigneusement de haut en bas. ATTENTION: Éviter les bulles d'air!
10. Spin avec 400 g pendant 3 min, aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 5 ml B27-moyen (a).
11. Triturer le tissu une nouvelle fois avec la pipette en verre, puis deux fois à l'aide d'un embout de filtre en matière plastique pl 1000. Effectuez ce que décrit dans les étapes 2.9 et 2.10.
12. Après la dernière centrifugation, remettre le culot cellulaire dans 2 ml plein medium (b) et triturer les cellules avec un pl bout filtre en plastique 200. Pour séparer les amas de cellules restantes de la suspension à cellule unique, laissez amas de cellules s'installent pendant 1-2 min.
13. Compter les cellules et calculer le nombre total de cellules nécessaires pour l'infection virale. Pour l'imagerie TED utiliser 25.000 cellules par 10 mm lamelle.
14. Placage 25.000 cellules supplémentaires non transduites comme un contrôle est recommandé à ce stade.

Infection virale

15. Transférer la suspension cellulaire de l'infection virale dans un nouveau tube Falcon de 15 ml et centrifuger 3 min à 400 x g.
16. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 300 pi de milieu (b)
17. Ajouter une quantité appropriée de TED particules de vecteur d'expression lentiviral infectieuses et laisser le tube Falcon reposer à température ambiante pendant 10 min.
18. Remplissez le tube avec plein milieu (b) au volume final nécessaire pour placage (100 pi pour chaque mm lamelle 10), aspirer le milieu du coverslip, et placer immédiatement 100 suspension cellulaire pi sur chaque lamelle.
19. Placez les plats dans l'incubateur jusqu'à ce que toutes les cellules sont installés (env. 2 h) et de remplir soigneusement les plats jusqu'à ce qu'ils contiennent 2 ml de milieu (b).
20. Laissez neurones se développent pendant au moins une semaine. Remplacer 50% de la moyenne chaque semaine.

3. Culture et viral infection des souris des cellules gliales corticales

Préparation

1. Commencez par préparer moyen de cellules gliales basal (1:1 mélange de DMEM/F12 avec 10% de FCS, 5% HS, 1% de pénicilline / streptomycine, 0,45% de glucose) et le revêtement d'un flacon de culture de cellules T75 avec 4 ml à 0,5 ng / ml Poly -DL-ornithine bromhydrate (PORN) (dilué dans une solution d'acide borique 150 mM, pH 8,35). Après incubation à 37 ° C pendant 2 heures ou pendant la nuit, de laver le flacon de culture de cellules trois fois avec HBSS et ajouter du milieu de la glie basal de 18 ml contenant B27 1:50 et 10 ng / ml d'EGF. Amener le flacon de culture de cellules dans l'incubateur (jusqu'à 3 heures).

Dissection

1. Nous effectuons nos expériences avec des souris, conformément aux directives de l'Union européenne, approuvé par nos soins des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation.
2. Disséquer le cerveau d'une souris P5-P7 et retirer l'hippocampe et les méninges des deux hémisphères comme décrit au point 2.5.
3. Disséquer le cortex frontal, le couper en plusieurs petits morceaux et les rassembler dans un tube de 1,5 ml contenant HBSS. Stocker le tube sur la glace et procéder à la partie de la culture cellulaire.

La culture cellulaire

4. Transférez tous les tissus du tube dans un tube Falcon de 15 ml à l'aide d'une pipette en verre poli de feu.
5. Ajoutez milieu de base à un volume final de 5 ml et triturer le tissu à la pipette plusieurs fois de haut en bas avec une pipette en verre poli de feu. Après centrifugation à 300 g pendant 3 min, aspirer le milieu, et remettre le culot cellulaire dans 5 ml de milieu basal.
6. Répétez l'étape 3.5 deux fois.
7. Après le thie centrifugation, remettre en suspension le culot cellulaire dans ml de milieu de base contenant les cellules gliales 2 B27 (1:50) et 10 ng / ml d'EGF.
8. Titruate une fois de plus et transférer la suspension de cellules dans le flacon de culture cellulaire préparée T75 et laisser les cellules se développent pendant 3-4 jours.

Lavage des cellules gliales (après 3-4 jours de culture):

9. Laver les cellules une fois avec 10 ml de PBS et frappez vigoureusement ou frapper le ballon à quelques reprises avec la main doucement, tout en la tenant serrée dans l'autre main. Par ces débris de cellules de l'étape et de groupes de cellules sont retirées de la culture.
10. Aspirer le PBS et ajouter du milieu de la glie basal frais contenant B27 (1:50) et 10 ng / ml d'EGF. Cultiver davantage la culture pendant 5-7 jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.

Fractionnement, la transduction et l'ensemencement finale des cellules gliales:

11. Manteau 10 mm lamelles avec 100 pi Poly-D-lysine (solution stock: 0,1%, dilué 1/50 AD 20 pg / ml dans PBS ou HBSS) et incuberdans un incubateur pendant la nuit. Lavez lamelles trois fois avec HBSS et ajouter 100 pi de milieu de cellules gliales basal. Equilibrer lamelles dans l'incubateur (3 h).
12. Laver les cellules gliales deux fois avec 10 ml de PBS, aspirer le PBS et ajouter 3 ml de trypsine (TrypLE, non dilué). Trypsiniser cellules pendant 1 min. ATTENTION: Évitez de traitement à la trypsine. Normalement, plus de 80% de toutes les cellules sont détachées après 1 min et cela est suffisant pour avoir plusieurs millions de cellules saines.
13. Arrêter la réaction en ajoutant 10 ml de milieu de cellules gliales basal, transférer la suspension cellulaire à un Falcon de 15 ml tube centrifuger à 300 g pendant 3 min. Aspirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 5 support de la glie basal ml.
14. Encore une fois, tourner et aspirer comme décrit à l'étape 3.15, puis remettre en suspension les cellules dans 5 ml de milieu de cellules gliales basal.
15. Transférer le nombre requis de cellules dans un tube de 1,5 ml. 10 ^{4-2x10 4} cellules gliales sont suffisantes pour un 10 mm lamelle. Habituellement, la suspension volume pour la transduction de cellules pour un 4-bien-plat est inférieure à 200 pi. Ajouter une quantité appropriée de lentiviraux TED particules de vecteur d'expression pour les cellules et incuber à température ambiante pendant 10 min. Puis remplissez la suspension avec le milieu de la glie base du volume de semis (100 pi par lamelle).
16. Seed 100 pi de cellules infectées par lamelle et incuber pendant environ 2 heures, puis ajouter du milieu de la glie base contenant B27 1:50 et 10 ng / ml d'EGF pour un volume final de 2 ml.
17. Pour les conditions de culture idéales utiliser des cellules pour les expériences le jour 3-7 après placage.

4. Génération et de la Culture de Reporter Cell Line

Des lignées de cellules rapporteur TED ont été établis sur la base des cellules HeLa, BHK21, Hek293 et ​​SH-SY5Y. Ici, nous fournissons le protocole pour les cellules HeLa, mais le protocole pourra être transféré à une autre lignée cellulaire ainsi.

Génération de la lignée cellulaire HeLa stable

1. Diviser une lignée de cellules HeLa de type sauvage et le transfert 100.000 cElls dans un volume de 200 pi à un tube de 1,5 ml.
2. Ajouter une quantité appropriée de lentiviraux TED particules de vecteur d'expression pour le tube et incuber la suspension cellule-virus pendant 10 min à température ambiante. Puis ensemencer les cellules dans un volume total de 2 ml de milieu (DMEM, 10% SVF, 1% de pénicilline / streptomycine) dans un plat de 30 mm et incuber pendant 3 jours.
3. Après avoir lavé une fois avec PBS, aspirer à moyen et ajouter 500 ul de trypsine (TrypLE, 2:3 dans PBS). Incuber pendant env. 3 min, puis arrêt de la réaction par addition de milieu de 3 ml. Transférer la suspension dans un tube Falcon de 15 ml et centrifuger à 400 g pendant 3 min.
4. Reprendre le culot cellulaire dans 200 pi de milieu et encore infecter les cellules avec des particules lentiviraux que décrite au point 4.2. Ensuite, les cellules de semence dans un flacon de culture de cellules T25 dans 10 ml de milieu.
5. Cultiver les cellules jusqu'à une confluence de 60-80% est atteint. Puis diviser la culture.

Des lignées de cellules rapporteur TED

6. Des lignées de cellules rapporteuses peuvent être TED maintiennented dans un milieu standard, par exemple DMEM contenant 5% ou 10% de SVF et 1% de pénicilline / streptomycine est utilisée.
7. Plate un nombre approprié de cellules dans un plat à 4 puits contenant des lamelles stériles mm 10 (voir ci-dessus), par exemple 10.000 à 20.000 cellules par lamelle.
8. Cultiver des cellules pour au moins deux jours avant de les utiliser pour l'imagerie TED.

5. Préparation de la procédure d'imagerie en direct à un microscope inversé

1. 1. Préchauffer HEPES-Ringer à température ambiante et ajouter D-glucose.
   2. Préchauffer le ACSF (sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +)} à température ambiante et ajouter D-glucose. Aérer le ACSF avec carbogène pendant 5 minutes. Puis ajouter 1 M solutions mères de _CaCl2 et _MgCl2 à des concentrations finales de 2 mm chacune.
2. Démarrez les microscopes d'imagerie en direct et tous les programmes informatiques.
3. Lancer perfusion sur une chambre d'imagerie "factice" et équilibrer le système de tubes.
4. Préchauffer le dispositif de chauffage de la solution en ligne, et la chambre d'imagerie dans la platine du microscope. Fixer la chambre d'imagerie dans un insert de chauffage.
5. Équilibrer le système à 32-37 ° C avant de commencer la procédure de chargement colorant. ATTENTION: Pour éviter l'écoulement accidentel de la solution de perfusion dans le système de microscope, nous utilisons des liens de cheveux autour des objectifs et des feuilles de silicone élastomère (1mm) pour protéger la platine du microscope.

6. Dye Chargement de chaque type cellulaire

1. Reprendre 1 aliquote de Fluo5N-AM (voir 1.3) dans une solution d'imagerie préchauffé 100 pi (HEPES-Ringer ou ACSF).
2. Solubiliser Fluo5N-AM dans la solution d'imagerie (HEPES-Ringer ou ACSF) dans un appareil à ultrasons bain-marie pendant 90 sec.
3. Utilisez un nouveau 4 - ou ul solution de 24 puits plaque et le transfert de 400 préchauffé imagerie pour un bien. Ajouter la solution de colorant à la même bien fait de venir à 500 pi d'une solution à 5 um.
4. Placez délicatement une lamelle de cellules (par exemple10-18 mm de diamètre) dans le puits, les cellules vers le haut.
5. Incuber pendant un laps de temps approprié dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C (au stade de microscope pendant ce temps préparer les paramètres d'imagerie). Fois colorant chargement typiques sont pour les neurones et les cellules gliales 7-15 min et pour les lignées cellulaires 10-20 min.

CRUCIAL: Dye temps de chargement et la concentration de colorant dépendent du type cellulaire, la densité cellulaire, et les besoins spécifiques de l'expérience! Temps d'incubation en présence du colorant peuvent nuire aux cellules, les neurones en particulier primaires et les cellules gliales primaires, ce qui est essentiel pour la réactivité aux stimuli physiologiques. Fois longue incubation (par exemple 30 min) ne seront utiles que pour ER expériences de localisation de calcium pour étudier la distribution de calcium ER dans les petites structures intracellulaires, par exemple neurites fines ou des épines. Dans certaines expériences, un mélange de 1/3 du milieu de croissance avec une solution d'imagerie peut aider à protéger les cellules pendant Fluo5N-AMchargement.

6. Instantanément, transférer la lamelle couvre-objet pour une autre culture cellulaire et contenant une solution de formation d'image (HEPES-ras ou ACSF) et commencer à monter les cellules dans la chambre d'imagerie.

7. Imagerie de cellules vivantes ER-calcium avec un laser inversé microscope confocal à balayage

1. Utilisation d'un pinceau pour appliquer de la graisse à vide poussé à une chambre d'imagerie. La graisse est nécessaire pour fixer la lamelle couvre-objet sur le fond de la chambre de perfusion. Nous utilisons chambres d'imagerie self-made pour les 10-12 lamelles mm avec un faible volume, ce qui permet de grandes vitesses de perfusion jusqu'à l'échange de tampon de 15 fois par minute. Une chambre de perfusion disponibles dans le commerce pour 18 mm lamelles, peut être acheté auprès instruments Warner (RC-49FS). Cette chambre permet également une stimulation de champ de neurones.
2. Ramassez la lamelle avec les cellules Fluo5N-chargés et d'ajouter une petite goutte de solution d'imagerie (50-100 ul) sur les cellules pour garder les cellules couvertes de solution d'imagerie.Tourner la lamelle couvre-tête en bas et monter les cellules dans la chambre d'imagerie. Pour appuyer sur la lamelle dans le silicium-colle, utilisez un coton-tige (par exemple Q-tips).
3. Essuyez tampon résiduel du fond de la lamelle de verre avec des cotons-tiges. ATTENTION: essuyez soigneusement l'humidité résiduelle lorsque vous utilisez une huile-objectif avec une ouverture numérique élevée pour l'imagerie à haute résolution. Sel résiduel est préférable d'enlever l'eau. Frottis accidentelle de graisse peut être enlevée avec de l'acétone ou de l'éthanol pur.
4. Change la chambre d'imagerie "factice" avec la chambre d'imagerie expérimentale. Laver les cellules pendant 5-10 min en perfusion continue.
5. Laver les cellules pendant 5 - 10 min en perfusion continue.
6. Pour la sélection de cellules utiliser une quantité minimale d'illumination laser, des taux élevés de balayage (2-4 Hz), une petite taille d'image, et un gain élevé.
7. ATTENTION: Pour la sélection des cellules Fluo5N marqués ne pas utiliser l'excès d'éclairage de lumière ou direct avec epifluorescenlumière t. Éclairage lumineux de Fluo5N/Ca ^{2 +} complexes entraîne la perte complète de la fluorescence ER-spécifique dans 2-4 sec (Figure 5).
8. Mettre en place le microscope selon l'expérience prévue. Pour l'orientation, les paramètres représentatifs de l'imagerie avec différents vecteurs TED sont donnés dans le tableau 1. Pour laser inversé microscopie confocale à balayage, nous utilisons un microscope Olympus IX81 combiné avec un système confocal 1000 Fluoview qui est équipé de diodes lasers (473 nm, 15 mW; 559 nm, 20 mW) et un système de détection spectrale.
9. Au début du document d'expérience, les cellules d'intérêt par haute résolution x, y, z images des piles.
10. Effectuez x, yt imagerie pour suivre la dynamique de calcium ER dans les conditions expérimentales spécifiques. Les réglages typiques pour notre système sont listés dans le Tableau 2.
11. Suivre l'évolution de calcium ER sous perfusion continue avec une solution d'imagerie. Taux de change tampons typiques sont exemplarily: (a) le lavage de la cellule et stocker-épuisement par bloc SERCA: 1,5 ml / min, (b) ATP / DHPG stimulation: 3 ml / min.
12. Acquérir des images numériques de préférence avec 12 bits (4096 niveaux de gris). Pour l'imagerie parallèle de Fluo5N/Ca ^{2 +} et DP, des images 8 bits (256 niveaux de gris) peuvent sauver le système de trop-plein de données.
13. Stocker des images en direct des cellules de séries chronologiques (x, yt) ou des piles d'images 3D (x, y, z) (pour la distribution cellulaire de Fluo5N/Ca ^{2 +} complexes) dans un format compatible ImageJ (ex.: TIFF).

8. Traitement de l'image et de l'analyse des données

1. Ouvrir la pile d'image dans le programme ImageJ. Dans le cas de l'imagerie multicolore, diviser les canaux RVB quand on lui demande par ImageJ.
2. Identifiez votre région (s) d'intérêt (ROI) par un examen attentif des piles d'images (par exemple à l'aide d'une intensité vs complot temps)
3. Utiliser le plugin Analyzer Time-Series de lire l'intensité de pixel moyenne dans une ROI (F _brut). Depending sur le but, tirer ROI autour de l'ER soit complète ou petites régions de l'ER ER par exemple des dendrites des régions périphériques portables. Également inclure 1-3 ROI dans les zones sans cellules de soustraction de fond.
4. Calculer la fluorescence de fond moyenne (F _b) en calculant la valeur moyenne de fluorescence de la ROI de fond et soustraire le fond valeur F _b à partir des valeurs _brutes F pour obtenir la valeur _{de roi} de F.
5. Calculer F _0, ce qui est la fluorescence de base des cellules, en calculant la valeur moyenne de dix à 30 valeurs fluorescentes pour chaque ROI dans un état ​​de repos.
6. Calculer les variations relatives de fond corrigée en fonction de la fluorescence par AF / F ₀ selon la formule suivante:

7. Les changements relatifs présents dans fluorescencence comme trace avec AF / F ₀ pour l'axe Y et l'heure de l'axe des abscisses.

Résultats

Ce protocole prévoit une approche non perturbatrice pour l'imagerie directe de libre calcium ER. Faible affinité synthétique Ca ^{2 +} indicateurs sont libérés et piégés dans la lumière du RE à l'aide d'une ER ciblée, l'activité de l'enzyme estérase recombinante. Amélioration de chargement des Ca ^{2 +} colorants indicateurs à la lumière du RE permet une imagerie directe et rapide des urgences dynamique de magasins de calcium.

Les types de cellules pour TED

Discussion

Les avantages et les inconvénients de la méthode TED ont été largement débattues dans les publications récentes ^34,35. Comparé à d'autres méthodes décrites ci-dessus, TED contourne le problème de la perturbation et la perfusion des cellules. En outre, deux aspects méritent d'être soulignés. Le principe de TED pour ER imagerie de calcium nécessite (1.) L'expression ciblée d'une carboxylestérase actif dans la lumière du RE à l'aide de vecteurs construits TED et (2.) La libération efficace et...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphénylglycine)	Tocris	0805
5' ;-ATP-Na2, ATP sel disodique hydraté	Sigma	A26209-1G
B-27 supplément,50x	Invitrogen	17504-044
Chlorure de carbamoylcholine (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Acide cyclopiazonique (CPA)	Ascent scientifique	Asc-300
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM avec Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS sans Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Sérum de veau fœtal	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 &mu ; g	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Mélange de nutriments Ham’s F12	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) sans Ca, sans Mg, avec Rouge de Phénol, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Sérum de cheval	SHD3250YK	Linearis
Ionomycine Ca2+ sel	Ascent scientific	Asc-116
murin EGF	PreproTech	315-09
N2 supplément 100x	Invitrogen	17502-048
Milieu neurobasal	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, faible absorbance UV, 2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromure PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromure	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsine	Worthington	LS-003707
Inhibiteur de trypsine de Glycine MAX (soja)	Sigma	T6522
Materials
Système confocal : microscope à balayage laser inversé : FV1000 avec IX81	spécifique à l’utilisateur	Olympus
Système confocal : combineur laser FV10 et lasers à diodes (405, 473, 559, 635)	Olympus		Configuration spécifique à l’utilisateur
Système confocal : tête de balayage FV10-SPD avec détecteur spectral	spécifique à l’utilisateur	Olympus
Contrôleur de chauffage TC-344B	Warner Instruments	64-0101	pour contrôler le chauffage en solution en ligne
Logiciel	NIH ImageJWS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objectif : UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objectif : UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objectif : UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Chambre de perfusion, chambre de	sur
, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Tube de perfusion : PT-49	Warner Instruments	64-1730	pour perfusion
Pompe péristaltique MiniPlus 3 (4 canaux)	Pompe de perfusion	Gilson	n.a.
Chauffage de solution unique en ligne SH-27B	Warner Instruments	64-0102	contrôlé par un contrôleur de chauffage
Tubes d’aspiration : ST3R	Warner Instruments	64-1407	pour la perfusion
Insert chauffant : Tempocontrol 37-2 numérique 2 canaux	Pecon	n.a.