A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Méthode de la culture pour le embryonnaire Souris Coeur

Résumé

Des études de développement chez la souris sont entravés par l'inaccessibilité de l'embryon pendant la gestation. Afin de promouvoir la culture à long terme du cœur embryonnaire à un stade avancé de gestation, nous avons développé un protocole dans lequel le cœur excisé est cultivé dans un semi-solide, Matrigel dilué.

Résumé

Des études de développement chez la souris sont entravés par l'inaccessibilité de l'embryon pendant la gestation. Ainsi, les protocoles d'isoler et de culture différents organes d'intérêt sont indispensables pour fournir une méthode de deux stratégies de traitement novatrices visualisation changements dans le développement et permettant. Afin de promouvoir la culture à long terme du cœur embryonnaire à un stade avancé de gestation, nous avons développé un protocole dans lequel le cœur excisé est cultivé dans un semi-solide, Matrigel dilué. Ce substrat fournit une aide suffisante pour maintenir la structure en trois dimensions, mais est suffisamment souple pour permettre la contraction continue. En bref, les coeurs sont excisés de l'embryon et placés dans un mélange de Matrigel froid dilué 1:1 avec le milieu de croissance. Après le Matrigel dilué se solidifie, le milieu de croissance est ajouté à la boîte de culture. Coeurs excisées aussi tard que jour embryonnaire 16,5 étaient viables pendant quatre jours après dissection. Analyse du plexus coronaire montre que cette méthode ne tient pasperturber le développement vasculaire coronaire. Ainsi, nous présentons une nouvelle méthode de culture à long terme des cœurs embryonnaires.

Introduction

Ces dernières années, la souris transgénique a été le système de modèle prédominant pour l'étude des malformations cardiaques de développement. Toutefois, d'autres organismes modèles tels que le poisson-zèbre, se sont avérés avoir des avantages significatifs par rapport à la souris. Trois avantages majeurs du poisson zèbre sont la pose externe des œufs, pour faciliter l'accès à des embryons; la transparence optique des embryons, ce qui permet une visualisation facile du développement cardiaque, et la facilité d'application de petites traitements moléculaires pour moduler le développement de l'embryon ^1. Ainsi, le développement d'une....

Protocole

1. Exciser les coeurs embryonnaires

1. Euthanasier une souris timed-enceinte au jour embryonnaire désirée à l'aide d'une technique d'euthanasie approuvé. Toutes les expériences ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.
2. Généreusement pulvériser la femelle avec de l'éthanol à 70% avant la dissection. Ouvrez la cavité abdominale de la femelle pour récupérer et exciser la corne utérine.
3. Placez la corne utérine dans une boîte de Pétri contenant froid 1x saline tamponnée au phosphate (PBS) et rincer si nécessaire. Couper la corne ....

Résultats

Grâce à cette technique, le cœur conserve sa morphologie tridimensionnelle et reste viable, comme indiqué par les contractions continues (Film 1). Ces contractions sont toujours plus importante dans les oreillettes que dans les ventricules. Après la culture, coeurs peuvent être fixés et traités soit pour l'immunohistochimie ou histologie pour examiner l'expression de marqueurs spécifiques ou des structures. Figure 1A montre la base des ventricules et les grandes artères d'un.......

Discussion

Le système de culture actuelle pose des avantages significatifs pour les études cardiaques embryonnaires de souris. Ce système de culture préserve la contractilité du myocarde et le plexus coronaire, avec des signes limités de nécrose, même après quatre jours de culture. En outre, la matrice semi-solide fournit un soutien suffisant pour maintenir la morphologie tridimensionnelle du coeur en développement, tout en permettant une flexibilité de contrat et également pour maintenir des perles revêtues en place au cours de l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS
Souris			À disséquer au stade embryonnaire d’intérêt
PBS (1x)
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Matrigel BD	Bioscience	356231
Syto-16	Invitrogen	S7578	Utilisé comme indiqué dans 13
plaque de culture à 24 puits	Fisher Scientific	07-200-84
EQUIPMENT
Microscope stéréoscopique	Nikon	SMZ645
Incubateur de culture cellulaire	Thermo	3110

enceintes à retarder