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DOI :

10.3791/50363

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16 juin 2013

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1Brain Tumor Research Centre, Hospital for Sick Children, Toronto Medical Discovery Tower, 2Ontario Cancer Institute, Princess Margaret Hospital, 3Neurosurgery, Toronto Western Hospital

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un roman In vivo Technique d'imagerie que les couples de souris chimériques fluorescentes avec des fenêtres intracrâniennes et à haute résolution de la microscopie 2 photons. Cette plate-forme d'imagerie études sur le sida de changements dynamiques dans le tissu cérébral et microvasculaire, au niveau d'une seule cellule, à la suite des insultes pathologiques et est adaptable à évaluer l'administration de médicaments intracrânienne et de distribution.

Résumé

Nous avons intégré avec succès précédemment établi intracrânienne fenêtre (ICW) 1-4 technologie avec intravitale microscopie confocale à 2 photons de développer une nouvelle plate-forme qui permet la visualisation directe à long terme des changements dans la structure des tissus intracrânienne. Imagerie à une résolution de cellule unique dans un mode en temps réel fournit des informations supplémentaires dynamique au-delà de celle fournie par l'analyse histologique point terminal standard, qui est uniquement au niveau de sections transversales "instantané" de tissu.

L'établissement de cette technique d'imagerie intravitale chez les souris chimériques fluorescentes, nous sommes en mesure d'images fluorescentes quatre canaux simultanément. En incorporant les cellules marquées par fluorescence, comme la GFP + de la moelle osseuse, il est possible de suivre le destin de ces cellules qui étudient leur migration à long terme, l'intégration et la différenciation au sein du tissu. Poursuite de l'intégration d'une cellule de rapporteur secondaire, tel qu'une ligne de tumeur mCherry gliome, permet une caractérisationtrage de la cellule: les interactions cellulaires. Les changements structurels dans le microenvironnement tissulaire peuvent être mis en évidence grâce à l'ajout de colorants et d'anticorps intra-vitales, par exemple CD31 des anticorps marqués et molécules de dextran.

En outre, nous décrivons la combinaison de notre modèle d'imagerie ICW avec un animal petit micro-irradiateur qui fournit irradiation stéréotaxique, la création d'une plate-forme à travers laquelle les changements des tissus dynamiques qui se produisent après l'administration de rayonnement ionisant peuvent être évaluées.

Les limites actuelles de notre modèle sont pénétrance du microscope, qui est limitée à une profondeur de 900 um à partir de la surface sous cortical, ce qui limite l'imagerie à l'axe dorsal du cerveau. La présence de l'os du crâne rend la ICW une procédure technique plus difficile, par rapport aux modèles de la chambre plus établies et utilisées actuellement utilisées pour étudier les tissus mammaires et coussinets adipeux 5-7. En outre, la ICW provides de nombreux défis lors de l'optimisation de l'imagerie.

Introduction

Une meilleure compréhension des changements structurels et biologiques qui surviennent dans le cerveau en réponse à différentes pathologies et des interventions thérapeutiques est essentielle pour améliorer les stratégies de traitement. Cependant, l'un des défis actuels dans l'étude de ces changements structurels et biologiques, en particulier en ce qui concerne les pathologies intracrâniennes, est l'inaccessibilité du tissu et de l'incapacité d'étudier l'évolution temporelle et la progression dynamique des changements dans un cadre en vivo. La génération de la technologie «fenêtre» a déjà fait ses preuves dans l'examen des modifications des tissus mous à travers le développement de tumeurs 5-7. Développement de modèles ICW s'avère techniquement plus difficile, en raison de la nécessité de retirer l'os du crâne sans endommager le instigateur infection dans le tissu cérébral sous-jacent. Les articles précédents ont tenté d'éclaircir le crâne de visualiser les 8-10 tissulaires cependant, pour produire de haute im clair de résolutionâges élimination complète de l'os du crâne est nécessaire 11. Répéter à long terme d'imagerie (30 jours +) n'est devenue que récemment une option réalisable grâce à l'imagerie 1,11, des délais plus courts précédemment ont été étudiés 5.

Au cours de la dernière décennie, un objectif majeur a été d'élucider l'origine de la néo-vascularisation stimuli pathologiques suivants, en particulier en réponse à la formation et la progression tumorale, de fournir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des tumeurs. Une grande controverse demeure autour de la source de la nouvelle vasculaire dans le cerveau au cours du développement tumoral ou la radiothérapie suivant. Traditionnellement vascularisation a été considéré à se produire à travers l'angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux se forment à partir de la germination de vaisseaux préexistants 12. Des études plus récentes suggèrent cependant que le processus embryonnaire pris précédemment de vasculogénèse peut jouer un rôle plus important dans la formation du système vasculaire pathologique. Vasculogenesis implique le recrutement des homologues ANGIOBLAST adultes de la moelle osseuse qui à leur tour sont alors directement impliqués dans la formation de nouveaux endothélium des vaisseaux 12-14. L'accumulation des données indique que les cellules précurseurs de cellules endothéliales sont mobilisés à partir de la moelle osseuse pour initier la formation de vaisseaux de novo en réponse à des médiateurs oncogènes 15-17. Cependant, ces études fournissent des preuves contradictoires de la contribution directe de ces cellules dérivées de la moelle osseuse (BMDCs) à l'endothélium des vaisseaux avec la contribution de pourcentage variant selon le type de stimulus pathologique et la réponse au traitement 18-21.

Par conséquent, l'établissement de méthodes expérimentales reproductibles qui permettent l'imagerie intravitale haute résolution pour répéter étude à long terme du processus d'intégration BMDC dans la vascularisation tumorale et la réponse au traitement est inestimable. Techniques histologiques standard ne parviennent pas à fournir l'information dynamiqueinformations nécessaires pour déterminer la survie à long terme, la différenciation et l'intégration des cellules qui donnent lieu à des néovaisseaux et ne peut donc pas démontrer définitivement les mécanismes d'interaction cellulaire.

Nous avons montré par notre approche expérimentale qu'il ya un degré variable de recrutement BMDC après deux rayonnements ionisants intracrânienne et la croissance de la tumeur, un recrutement qui est cependant, le site pathologie spécifique et non une invasion de l'ensemble du tissu intracrânienne 11,22. Nous avons montré que le recrutement suit une tendance sensible à la fois démontrée par l'imagerie répétée d'un seul animal 11,22. De même, l'imagerie in vivo peuvent également fournir des indications précieuses sur le mimétisme des cellules tumorales par lequel les cellules tumorales marquées par fluorescence peuvent être visualisés et suivis avec un anticorps intra-vital CD31 pour les cellules endothéliales de mettre en évidence la possibilité de transdifférenciation des cellules tumorales pour former directement sa propre endothélium.

La polyvalence du modèle est renforcée par la capacité de l'image 4 canaux fluorescents, fournissant un nombre exhaustif de combinaisons pour l'étude des différents processus cellulaires et biologiques. Nous sommes en mesure de intravitally l'image CFP (bleu), la GFP (green), Cerise / DP (rouge), et Alexa647/APC (rouge lointain), simultanément dans un seul champ à plusieurs reprises au fil du temps. Les chercheurs peuvent modifier génétiquement les cellules d'exprimer fluorochromes pour chacun des canaux ainsi que des colorants d'achat et d'anticorps pour mettre en évidence les changements structurels d'un intérêt particulier. À ce jour, les colorants et les anticorps couramment utilisés dans les études comprennent CD31 et le dextran qui soulignent tous deux la microvascularisation et ses changements dans le tissu 1,11,23,24, même si nous avons utilisé le canal rouge lointain à cet effet les deux sont disponibles pour une utilisation dans l'autre canaux mentionnés. De même, d'autres colorants dont Sytox Orange, qui mettra en évidence les domaines de l'apoptose et des marqueurs tels que ceux de la société Visen, ont été spécialementquement conçu pour une utilisation in vivo. Outre les quatre canaux fluorescents couramment utilisés mentionnés, un second canal de génération d'harmoniques (SHG), peut être ajouté et optimisé pour imager les fibres de collagène endogènes du modèle 7, visualisant la membrane basale environnante vasculaire.

Pour démontrer l'adaptabilité de notre modèle, ainsi que les interactions entre cellules mentionnées ci-dessus, nous avons pu étudier les interactions des cellules de la drogue. Nous avons examiné les inhibiteurs de la drogue comme AMD3100, un inhibiteur de SDF-1, et son rôle dans les réseaux de signalisation impliquées dans le recrutement BMDC 11. De même, nous avons modifié génétiquement des cellules de gliome U87 xénogreffes d'exprimer VEGFTrap, un inhibiteur de VEGF 25, conjointement par un IRES à une molécule de GFP. En utilisant DP + BM nous sommes en mesure d'étudier le rôle du VEGF a sur le recrutement de BMDCs au système vasculaire. Plus récemment, nous avons utilisé le modèle pour étudier la cinétique de la drogue en regardant le mechanism derrière le médicament fluorescéine tumeur délimitant 26, au niveau cellulaire. Grâce à l'utilisation d'une mesure construite en petite maison irradiateur animal que nous avons pu intégrer radiation délivrée stéréotaxique pour évaluer la réponse à la fois la tumeur et BMDCs au traitement.

Grâce à l'utilisation de notre méthode de nouveaux chercheurs en imagerie intravitale se faire une idée des changements unicellulaires en temps réel qui se produisent dans diverses pathologies et des systèmes, facilitant l'élucidation de nombreuses caractéristiques fonctionnelles et biologiques des changements dans les tissus.

Protocole

Tous les travaux d'animal a été réalisée sous soins aux animaux et COMITÉ DE L'UTILISATION protocole approuvé et exécuté en CONFORMITÉ AVEC TOUTES LES LIGNES DIRECTRICES, les règlements et les organismes de réglementation.

Pour le dépannage Tableau de référence 2.

1. Reconstitution de moelle osseuse (Facultatif) Figure 1 (30 min de préparation, 5 min par souris)

Toute chirurgie doit être réalisée en utilisant une technique aseptique stricte avec du matériel stérile autoclave.

Une souris donneuse va reconstituer trois souris d'accueil.

  1. Anesthésier destinataire de la souris et de la situation NODscid, avec le plomb pour protéger la tête, à l'intérieur du centre de l'irradiateur Gammacell 40 'exactor ».
  2. Irradier souris NODscid avec 2,5 Gy d'irradiation corporelle totale (TBI).

CRITIQUE STEP: Optimisation de TBI peut être nécessaire en raison de la variation de la dose requise pour l'hôte suffisante immunitaire CEll épuisement dans différentes souches de souris.

point de Pause: souris d'accueil peuvent être irradiés à l'avance mais doivent être utilisés dans les 24 heures d'irradiation.

  1. Euthanasier souris donneuses selon les directives du comité de protection des animaux. Nettoyez les membres postérieurs et enlever le tibia et le fémur à la fois, en éliminant tous les excès de tissu à partir des os (figures 1ai, 1aii).

ÉTAPE CRITIQUE: os fibulaires sont pas viables pour une utilisation en raison de lumière très étroites.

  1. Retirer les plaques d'extrémité des deux extrémités de quatre os extraites et les rincer à l'aide d'une aiguille de calibre 22 et 1 ml de PBS stérile jusqu'à ce qu'ils soient en apparence blanc (figure 1aiii). Tableau de référence 2.
  2. Mélanger la moelle osseuse suspension extrait (BM) et à prélever 300 pi en trois aiguilles 27 G tuberculine. Extrait BM devrait contenir environ 2 x 10 7 cellules etest suffisant pour 3 souris hôte reconstitutions. Tableau de référence 2.
  3. Injecter la suspension dans la veine caudale latérale de trois souris NODscid précédemment irradiés provenant de l'étape 1.1 (figure 1b). Tableau de référence 2.

ATTENTION: Pour vérifier la stérilité de la BM injecté nous vous recommandons de plaquer le reste de BM et de la culture pendant 24 heures pour vérifier infection. La principale cause de la mort à ce stade est l'infection chez les souris nouvellement reconstitués.

2. Intracrânienne fenêtre Generation - Figure 2 (30 min par souris)

Toute chirurgie doit être réalisée en utilisant une technique aseptique stricte avec du matériel stérile autoclave et sous une lampe chauffante pour garder les animaux au chaud (figure 2A).

  1. Anesthésier bénéficiaires souris NODscid avec IACUC approuvé anesthésie, l'injection IP Avertin à 0,5 mg / g et sa position, avec le plomb pour protéger la tête, à l'intérieur du centre de laGammacell 40 'exactor' irradiateur. Enlever les poils du cuir chevelu. En outre appliquer le gel lacrymogène pour empêcher la déshydratation cornée.
  2. Cuir chevelu propre d'abord avec une solution de Bétadine puis avec de l'alcool, puis réaliser une incision du point milieu de l'oreille au-dessus des yeux. Retirez le cuir chevelu 3 mm de chaque côté de la première incision, ce qui expose le crâne et les monuments de la surface du crâne (Figure 2Bi).
  3. Élever le périoste par injection de lidocaïne 2%: solution d'épinéphrine et de disséquer loin de la surface du crâne (Figure 2bii).
  4. Utilisation de 2,7 mm trépan de forage, d'affaiblir un cercle mm du crâne 2.7 sur le cortex de l'hémisphère droit entre lambda et bregma. NE PAS pénétrer l'os avec le forage (Figure 2biii). Tableau de référence 2.

Étape cruciale: si forage traverse le crâne la surface du cerveau peut être endommagé résultats influencent supplémentaire avec trauma. En outre saignement excessif se produira prévenir une fenêtre claire d'être générée.

  1. Retirez le volet osseux affaibli l'aide de pinces à dissection et crochet dentaire et la force délibérée mais contrôlée (Figure 2biii).
  2. (Facultatif) Si regardant pathologie tumorale, injecter des lignées de cellules tumorales choisies (avec le gène rapporteur fluorescent) dans le centre de la fenêtre générée à l'étape 2.5.
    1. Charger 10 pl 30 G seringue Hamilton avec la suspension de cellules et de l'aiguille de la charge dans un cadre stéréotactique.
      ÉTAPE CRITIQUE: Le nombre de cellules devra être optimisé pour les cellules tumorales dans l'utilisation et la chronologie de la croissance nécessaire. Par U87 cultures, nous utilisons 2 x 10 5 cellules dans 10 ul par souris.
    2. Charger la souris sur le cadre stéréotaxique numérique aligner l'aiguille au point central de la fenêtre générée.
    3. Basse aiguille jusqu'à ce qu'elle touche la surface corticale et réinitialiser les coordonnées du numérique.
    4. Faibleer à l'aiguille de 3,2 mm dans le tissu cortical et injecter à 3 mm de profondeur.
    5. Rétracter l'aiguille lentement puis retirez souris du cadre.
      ÉTAPE CRITIQUE: Injecter la solution sur la durée de 1 min et laisser l'aiguille en suivant l'injection de position pour assurer réduit le reflux.
      ÉTAPE CRITIQUE: Si hémorragie mineure est rencontrée irriguer avec une solution saline stérile pour 1-5 minutes pour arrêter le saignement superficiel. Procéder aux étapes suivantes.
  3. Humecter la surface du cerveau avec une goutte de PBS stérile pour maintenir le tissu cérébral irrigué.
  4. Flotter à 3 mm lamelle sur la surface du cerveau pour sceller complètement autour de la fenêtre de 2,7 mm généré. Tableau de référence 2.
  5. Crâne entourant totalement sec puis appliquer Vetbond à l'ensemble du crâne exposé aux tissus du cuir chevelu refermer le crâne osseux et la lamelle en place. NE PAS appliquer un excès car il fuira sous la vitre et diminuer le potentiel de l'imagerie.
  6. Mix poudre fraîche acrylique dentaire et solution, environ 30% (p / v), et s'appliquent sur le dessus de la Vetbond. Pour assurer une bonne étanchéité chevauche le acrylique légèrement sur ​​le bord lamelle de verre (Figure 2biv). Tableau de référence 2.

ATTENTION: dentaire acrylique est extrêmement dangereux si nous recommandons l'utilisation de gants et masque tout au long des procédures.

ÉTAPE CRITIQUE: acrylique dentaire doit rester souple lors du moulage pour garantir une bonne étanchéité et de réduire les excès. Construire des acryliques sur la fenêtre seront floues les images.

  1. Permettre aux souris de récupérer dans une cage chaud.

3. rayonnement stéréotaxique (Facultatif) - Figure 3 (25 min par souris)

Des variations existent dans les différents irradiateurs utilisés et que cette optimisation sera nécessaire. Nous avons utilisé un irradiateur conçu sur mesure.

  1. Anesthésier les sourisà l'isoflurane à 4% pour l'induction suivie de 1,5-2% tout au long de la procédure avec 0,5-1 litres O 2 a min, et le lieu sur limiteur de tête coutume à l'intérieur du dispositif d'irradiation stéréotaxique (Figure 3AI).
  2. Obtenir un 360 ° à faisceau conique CT scan avec le tube à rayons X fonctionnant à 40 kV et 0,05 mA à travers un filtre en aluminium de 2 mm. Utiliser l'image pour guider le mouvement de la scène, diriger le rayonnement isocentre à l'hémisphère droit en s'assurant qu'il est central dans la direction ventrale dorsale.
  3. Insérez le collimateur hémisphérique mm x bloc 8 de 11 mm.

ÉTAPE CRITIQUE: collimateurs peuvent être conçus pour de nombreuses configurations différentes et peuvent donc être améliorées afin d'inclure et d'exclure les différentes parties du cerveau. 8 mm x 11 mm définit une zone hémisphérique du cerveau.

  1. Obtenir simples images orthogonales CT fois de haut (AP) et en bas (PA) à travers le collimateur pour améliorer encore la mise en place du cerveau, anatstructures osseuses omical peuvent être utilisés pour la reproductibilité.
  2. Remplacez le filtre en aluminium pour un traitement 0.93 mm en cuivre filtrer et d'administrer la moitié de la dose de rayonnement désiré avec le tube à rayons X fonctionnant à 225 kV et 13 mA par le haut dans une direction AP.
  3. Retour portique à la position inférieure et à administrer la seconde moitié de la dose de rayonnement à nouveau avec le tube à rayons X fonctionnant à 225 kV et 13 mA forme le fond dans une direction AP.

ÉTAPE CRITIQUE: Il est essentiel pour irradier à la fois le haut et le bas pour réduire le gradient RT à travers le tissu du cerveau, elle contribue également à l'alignement de l'isocentre au centre du cerveau.

4 In vivo à deux photons microscopie laser -. Figure 3 (1-3 heures par session)

Des variations existent dans les différents microscopes utilisés et que cette optimisation sera nécessaire. Nous avons utilisé un Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning ConfocMicroscope al.

  1. Anesthésier les souris avec IACUC approuvé anesthésie, l'injection IP Avertin à fenêtre 0,5 mg / g et propre à l'aide de pulvérisation d'alcool.
    1. (Facultatif) Injecter marqués vasculaire 5-10 min colorant avant l'imagerie, dans la veine de la queue avant l'imagerie. Alexa647-Dextran utilisé à 0,35 pg / g ou APC-CD31 utilisé à 0,2 pg / g. Voir le tableau 2.
    2. (Facultatif) Injecter fluorescéine via la veine de la queue à la dose de 7,7 mg / kg, 5 min avant de l'imagerie, pour délimiter une tumeur. Tableau de référence 2.
  3. canaux de configuration sur le microscope confocal tel que déterminé par le fluorochrome utilisé chez la souris chimérique généré. Tableau 1 illustre les canaux décrits dans ce modèle.
  4. Inverser la souris sur la platine du microscope mobile et stabiliser la tête en position de mouler la pâte à modeler. (Figure 3Aii) Tableau de référence 2.

étape critique: La ICW doit être perpendiculaire au point du laser et en tant que tels doivent être positionnés horizontalement pour assurer la formation d'image est optimale.

  1. Allumez le premier laser de canal et utiliser pour positionner au centre de l'ICW.
  2. Utilisez l'objectif 5x et de prendre une image de la fenêtre entière à utiliser comme une carte pour des images de résolution plus élevées.
  3. L'imagerie doit être réalisée en utilisant des lentilles 20X «longue portée» 10X et d'obtenir la meilleure qualité d'image.

CRITIQUE STEP: Canaux et objectifs sur le 2PLM devrait être mis en place en utilisant des cellules manipulées in vitro avant l'imagerie des modèles murins de veiller à ce qu'ils mettent en évidence la bonne fluorochrome.

Fluorochrome PCP GFP / fluorescéine / FITC mCherry / DP / DsRED APC / Alexa647 SHG Autofluorescence
laser d'excitation 458 nm 488 nm 543 nm 633 nm Chameleon laser 820 nm
Collection Filter 480-520 nm 500-550 nm 565-615 nm 650-710 nm 390-465 nm

Tableau 1. Guides de configuration Fluorochrome. Pour l'utilisateur de voir le laser d'excitation et collecteur de spectres d'émission utilisés pour chacun des canaux disponibles dans le modèle.

Résultats

L'étape facultative de la reconstitution de la BM de souris NODscid devrait se traduire par une absorption de 80% de la fluorescence «donneur» BM dans 100% des souris du NODscid «d'accueil», cependant optimisation du TBI sera nécessaire pour améliorer la reconstitution dans d'autres non souches-immunocompromsed. Si les souris sont reconstitués en vain, ils tombent malades et meurent rapidement après la procédure, les souris affaiblis peuvent nécessiter des suppléments de nourriture et d'eau.

L'ICW une fois terminé devrait ressembler à celle observée dans la figure 2biv. Il est idéal d'avoir une crête de l'acrylique entourant la lamelle de verre car cela donne de la force à la jointure avec le crâne. Fenêtres parfaites sont reproductibles et permettent l'imagerie répétée jusqu'à 8 semaines après leur génération (figure 2C). Images produites par ces fenêtres optimales vont regarder que ceux observés dans la figure 3Bi. Imperfections dans la génération de fenêtre de produire des images de mauvaisela qualité par exemple, des bulles d'air sous la fenêtre empêcher des champs entiers de vue étant imagé, zones apparaîtront plus sombres que l'air empêche l'imagerie laser (Figure 3bii). Grâce à l'excès de colle et acrylique sur la lamelle, il y aura un haut niveau de fond fluorescence et zones du champ étant effacé comme on le voit dans la figure 3Biii, même s'il ya de la saleté sur la petite fenêtre des points de fluorescence de fond seront visibles sur le terrain (Figure 3Biv).

Le succès de l'imagerie ICW est prédéterminé par l'intégrité de la technique chirurgicale, cependant, même ICWS optimales peuvent rencontrer des problèmes lors de la session d'imagerie. En tant que tel, un éventail et le degré de clarté existe dans les images générées comme on le voit sur ​​la figure 3. L'image de la qualité des publications illustrées dans la figure 3C se produit lorsque tout est optimal. Même s'il n'est pas possible pour toutes les souris, il est possible de s'attendre à 80% de l'images généré à ressembler à ceci. L'un des défauts majeurs dans la configuration de la microscopie actuelle est l'utilisation de lasers inversées. Les souris doivent être positionnés sur le dos et cela se traduit par un stress excessif et l'inconfort qui peut conduire à des difficultés respiratoires au cours de l'imagerie. Cela produit une image «bordée», comme la respiration interfère avec la moyenne qui se produit au cours de l'imagerie, de sorte que, chaque rangée de pixels est représenté quatre fois et la moyenne des quatre est affichée dans l'image finale. Tout mouvement au cours de la moyenne, comme celle causée par une respiration difficile, va créer un artefact qui apparaît comme une ligne sur l'image, comme on le voit dans la figure 3D. Les souris qui sont insuffisamment anesthésiés pendant l'imagerie peuvent rencontrer ce problème également. L'effet «doublé» peut être réduite en limitant l'image moyenne de sur, mais ce sera à son tour de réduire la qualité de l'image et ne peut pas éliminer le problème. Sinon souris peuvent être repositionnés ou rejugés lors de la respiration s'est normalisée. L'utilisation of un 2PLM verticaux annulerait ce problème que les souris pourraient être imagées »dans la position couchée. Un autre problème avec l'imagerie sur une 2PLM inversé comprend l'accessibilité limitée pour le positionnement de la ICW une fois que la souris est sur ​​le microscope, et cela conduit à des images «segmentés» comme ceux vus à la figure 3E. Ici, le laser et la lamelle ne sont pas positionnées perpendiculairement les unes aux autres et en tant que tel se produit la formation d'image à un angle. Cela se traduit par la génération d'une image «segmenté» où les côtés du champ de vision ne sont pas imagés. Le problème se résout facilement avec le repositionnement de la souris afin d'assurer la lamelle est complètement à l'horizontale une fois sur la tête de montage comme le montre la figure 3Aii.

Le modèle présenté ici a été spécifiquement utilisé pour examiner le rôle des BMDCs dans la vascularisation du tissu tumoral et démontre la capacité d'utiliser trois canaux différents simultanément (Cherry, la GFP, l'Extrême-rouge - Alexa647 et APC) making la PCP et redondant SHG pour cette histoire particulière. Nous avons pu souris d'image longitudinalement pour jusqu'à 8 semaines, en étudiant le recrutement et l'intégration des cellules de BM dans le système vasculaire au niveau de la cellule unique, sans effets néfastes causés par la fenêtre. Ce modèle démontre la facilité de collecte des informations dynamiques sur la source et la formation de la vascularisation et l'interaction des différents types de cellules d'intérêt, précédemment perdus par le point analyse histologique final.

Étape Problème Raisonnement Solution
1.4 Os briser Outils émoussés Recueillir la moelle osseuse former une souris fraîche avec des ciseaux pointus ou lame de scalpel frais, des fragments d'os vont inhiber injection de télévision
1.5 Basse extraction (faible viscosity) plateaux d'os coupés trop distale, une mauvaise méthode de collecte Bones doivent être coupés comme proximale que possible et prélevés avec l'os à l'intérieur de tube de prélèvement pour éviter dosseret
Temps devrait être consacré à extraire la BM au maximum et avec soin
Si nécessaire piscine plus d'une souris dans 1 ml
Haute Extraction (haute viscosité) Tampon de basse collection Diluer la solution avec supplémentaire de 0,1% de BSA, split de trois souris receveuses jusqu'à 500 pi par maximale de la souris
1.6 L'injection intraveineuse Bad Mauvais vasodilatation et la visibilité de la cuve Améliorer la dilatation avec lampe chauffante. Placez la souris dans la veine caudale restrainer avec construit dans la source de lumière pour faciliter l'accès
1 Souris malades Infection Sacrifier les souris selon les règles de l'institution. Assurez-queues sont nettoyés avant l'injection et vérifier la stérilitéextrait du BM dans la culture
Les souris meurent Mauvais BM absorption Vérifiez% de l'absorption BM fluorescent de souris morte.
Optimiser TBI pour la souche de souris utilisées
Augmenter quantité d'injection BM (par exemple l'utilisation d'une souris des bailleurs de fonds pour deux destinataires)
2.4 Hémorragie mineure Dura a manqué pendant le forage Pression avec coussinets de gel et de lavage et une solution saline stérile continue
Major hémorragie Cerveau endommagé par forage Sacrifiez souris selon les directives de l'institution
2.8 Les bulles d'air sous la lamelle Mauvais contact avec la surface corticale empêche bon placement Retirer la lamelle et ajouter supplémentaire PBS flotter la lamelle sur la fenêtre pour enlever les bulles
2.10 Le glissement de la lamelle lors du collage Acrmasse ylic est lourd, exerce une pression sur la lamelle et déplace la lamelle sur la manière Pince à épiler doit être utilisé pour maintenir la lamelle vers le bas tout Vetbond et acrylique est appliquée
4.2 L'injection intraveineuse Bad Mauvais vasodilatation et la visibilité de la cuve Améliorer la dilatation avec lampe chauffante. Placez la souris dans la veine caudale restrainer avec construit dans la source de lumière pour faciliter l'accès
4.4
Figure 3C 		Images «doublés» Travaillé ou respiration irrégulière Retirer souris à partir de châssis et permettre de récupérer
Augmenter le niveau d'anesthésique administré et ajuster la position pour assurer cou n'est pas trop fléchi ou étendu à empêcher la respiration
Figure 3C Image »sectorielle» Cerveau n'est pas parallèle aux objectifs Ajustez la position de la lamelle afin de s'assurer qu'elle est plate
Navire pas visualisé injection intravasculaire pas vu Refaire l'injection dans la veine caudale de remplacement, la queue chaud pour assurer une bonne vasodilatation
Bruit de fond élevé Sale lamelle,
bulles d'air, Acrylique 		Essuyer avec un chiffon humide lamelle d'éthanol à 70%, ne pas tremper comme on peut pénétrer sous acrylique et endommager le tissu cérébral

Tableau 2. Dépannage. Un guide pour les étapes correctives nécessaires pour les zones problématiques des procédures.

figure-results-1
Les schémas 1. Diagramme expérimental. Cela démontre la chronologie des événements à travers les étapes expérimentales 1-4. Des modèles murins sont configurés sur une semaine, àassurer la BM reconstitue correctement, et ne sont pas traités avec le médicament jusqu'au jour 7 de la tumeur pour s'assurer que les greffes tumorales. Cliquez ici pour agrandir la figure .

figure-results-2
Figure 1. Reconstitution BM. (A) Procédure d'extraction BM i. Dissection des os des membres postérieurs. Ii. Fémur disséqué et le tibia des membres postérieurs, nettoyé et prêt pour l'extraction. Iii. Bones avec plaque d'extrémité enlevé et rincé à travers, ce qui démontre l'aspect blanc des os vides. (B) Les schémas montrant où nervures latérales pour injection sont positionnés dans la queue.

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Figure 2. Génération ICW. (A) est configuré aseptique recommandé (B) i. Surface du crâne exposé révèle les repères nécessaires pour la chirurgie, ICW doit être placé sur l'hémisphère droit à égale distance du bregma et lambda. Ii. Periostieum levé avec une solution de lidocaïne, prêt pour l'enlèvement . iii. crochet dentaire requis pour le retrait du fragment d'os généré avec la perceuse. iv. Fini ICW à l'acrylique dentaire. (C) Trois fenêtres par exemple démontrer la reproductibilité de la méthode.

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Figure 3. 2PLM résultats escomptés. Toutes les images montrent vert BM, tumeur rouge, bleu (pseudo couleur rouge lointain) vascularisation. (A) i. Démontre le cadre de la tête qui retient flux isoflurane à l'intérieur de la petite irradiateur animal. Le 8 x 11 mm collimateur peut aussi être vu se déplacer à travers le portique. Ii. La souris dans le inversé positionné dans le cadre de la tête requis pour l'imagerie, plastercine malléable assure toutes les fenêtres peuvent être accueillis. (B) Photos démonstratifs des résultats de problèmes avec la génération de la fenêtre à partir de i. une fenêtre optimale, ii. une fenêtre avec des bulles d'air emprisonnées sous, déversement acrylique iii sur la lamelle et iv. saleté sur la fenêtre elle-même. (C) souligne les problèmes qui surviennent avec l'imagerie après génération réussie d'un ICW i. optimal imagerie ii artefacts. respiratoirescréer une image «doublé» iii. lamelle pas perpendiculaire au laser génère une image «segmenté». Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 4. Emplois fonctionnels et les adaptations du modèle. (A) le traitement d'imagerie poste CFP par lequel l'image GFP est soustraite de l'image CFP pour révéler l'image de la PCP vrai que peuvent être superposées les trois autres canaux en blanc. Vert BM, tumeur rouge, blanc CSC, Bleu (pseudo couleur rouge lointain) vasculaire (B) la démonstration des fibres de collagène qui peuvent être imagées avec SHG. cellules VEGFTrap dans vitr vert Dextran, rouge BM, Cyan collagène (C) i.o démontrer le signal de GFP produite avec le VEGFtrap. ii. imagerie in vivo démontre les cellules VEGFtrap clairement et en plus met en lumière la facilité de changer de canal pour démontrer le système que vous regardez. VEGFTRap vert + tumorale, Red BM, Bleu (pseudo couleur rouge lointain) vascularisation. (D) montre la collection de fluorescéine dans le stroma de la tumeur et non dans les cellules directement, illustré par l'absence de signal vert superposition avec une tumeur rouge. Vert fluorescéine, une tumeur rouge. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Les trois canaux décrits dans toutes les images jusqu'ici sont interchangeables pour les trois marqueurs de l'intérêt dans d'autres modèles et les feuilles des chercheurs avec un ensemble d'outils précieux à chercher un nombreux types de cellules et les interactions. La planification est nécessaire pour s'assurer que tous les marqueurs et les types cellulaires ont réussi à intégrer une molécule de fluorescence de journaliste dans un canal distinct.

En plus des trois canaux standard utilisés ici, nous avons également pu intégrer un quatrième canal PCP (figure 4A) et une base de collagène SHG canal 7 (figure 4B). Cela étend la possibilité de regarder les interactions cellulaires in vivo et permet en outre l' utilisateur de procéder à mélanger pour étudier les interactions cellules-cellules spécifiques tout en conservant deux canaux pour d'autres marqueurs population. Par exemple, nous avons examiné les cellules tumorales (DP) et les cellules souches du cancer (PCP) dans un rapport de 1:3 avec un intérêt de comparer leur intratuminteractions orales (figure 4A). Nous avons observé que sept jours après l'implantation de la population mixte, le rapport a été confirmée et les deux populations cellulaires pourrait encore être vu.

Le canal PCP offre problèmes techniques en raison du chevauchement avec le canal de la GFP dans les deux spectres d'excitation et d'émission et en tant que tels nécessite un traitement post-imagerie pour définir le vrai PCP + cellules de ceux qui sont réellement GFP +. Le traitement post imagerie peut être effectuée sur les microscopes à 2 photons construits dans le logiciel Zeiss LSM directement par lequel, l'image GFP est soustraite de l'image PCP entraîne les véritables cellules de la PCP étant laissés (figure 4A). La prémisse pour le rapport soustraction dépend également des images lumineuses et est dû au laser CFP (458 nm) fluorescent à la fois de la PCP et cellules GFP tandis que le laser GFP (488 nm) est trop élevé pour fluorescence des cellules de la PCP. En plus de la PCP, nous avons également été en mesure d'utiliser les configurations précédemment publiés pour regarder la SHGniveaux et ainsi dépeindre les fibres de collagène qui forment la membrane basale entourant vasculaire (figure 4B).

Une autre adaptation de ce modèle a profité d'un petit irradiateur animale construite sur mesure qui a la capacité d'utiliser un rayonnement stéréotaxique guidée pour irradier des coupes de tissu aussi petit que 2 mm de diamètre. En ciblant la fenêtre avec l'irradiation, il est possible de regarder le rayonnement de l'effet a sur le tissu sous-jacent. Nous avons récemment publié une étude sur le rayonnement de l'effet a sur le tissu cérébral normal en ce qui concerne le recrutement de BMDCs au système vasculaire, portant spécifiquement sur leur rôle dans les changements de tissus post-irradiation. Nous avons constaté que le recrutement des BMDCs était à la fois du temps et dose-dépendante dans les tissus normaux 11.

Il est possible d'étudier les mécanismes de prestation et l'intégration de produits thérapeutiques qui fournissent la drogue est marqué avec un marqueur fluorescent. Au cours denotre recherche, nous avons été en mesure de suivre la production de VEGFTrap, un médicament anti-angiogénique qui bloque toute la signalisation du VEGF dans la région de production 25. En modifiant génétiquement les cellules tumorales pour exprimer le gène de VEGFtrap couplé avec un IRES à EGFP (Figure 4CI) et l'utilisation de DP «donneur» BM nous avons réussi à l'image de la EGFP: production de VEGFtrap, interaction BMDC et vasculaire simultanément (Figure 4Cii). Cela a démontré la polyvalence du modèle et de canaux disponibles. Il est également possible de regarder la cinétique de la drogue en raison de la promesse d'une seule cellule de résolution. Fluorescéine (GFP +) est utilisée pour délimiter les tumeurs pendant une intervention chirurgicale afin d'assurer la résection maximale est atteinte 26. En injectant par voie intraveineuse imagerie alors qu'il est possible de démontrer que la délimitation se produit pas par l'absorption active de la fluorescéine dans les cellules tumorales elles-mêmes, mais plutôt grâce à la collecte de la drogue dans le domaine du stroma avec time, vu le manque de co-localisation 10 min après l'injection de la fluorescéine (figure 4D).

Dans l'ensemble notre stratégie combine des techniques nouvelles et existantes pour atteindre une plate-forme expérimentale unique, ce qui est avantageux pour l'étude des interactions cellulaires dynamiques. Cette stratégie s'est avérée être une approche précieuse pour l'examen haute résolution évolution dynamique unicellulaire de BMDC, la vascularisation de la tumeur cérébrale normale et en réponse à la thérapie, intracrânienne. Imagerie intravitale peut fournir une meilleure compréhension des régulateurs moléculaires de recrutement BMDC, la migration et la différenciation dans intracrânienne cerveau vascularisation de la tumeur ainsi que de nombreux autres processus dynamiques adaptables à d'autres domaines de recherche. Présumés facteurs inhibiteurs qui régulent BMDC en combinaison avec d'autres stratégies thérapeutiques peuvent aider à l'identification de la synchronisation précise des thérapies combinatoires. En outre, cette stratégie peut être adaptée à de nombreux avenir projets en utilisant non seulement in vivo colorants coloration vitale, mais aussi de petits inhibiteurs et des nanoparticules qui sont marqués par fluorescence permettant aux chercheurs de retracer la répartition et la migration des thérapeutiques plus ciblées ainsi que regarder longitudinalement à leur cinétique moléculaire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Fonds de microscopie optique avancée à l'Hôpital Princess Margaret, en particulier James Jonkman pour leur aide dans la configuration initiale de canaux sur le microscope 2Photon. Les auteurs tiennent à remercier le ciblage spatio-temporelle et l'amplification du programme de rayonnement de réponse (STTARR) et ses organismes de financement affiliées. Nous remercions le Dr Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael Nagy et Dr.Andras pour alimenter les plasmides VEGFTrap et de leurs corrections manuscrites et des commentaires. Le soutien continu et la discussion du personnel de la BTRC a été précieux et nous tenons à commémorer Dr.Abhijit Guha pour son apport scientifique. Le travail a été financé par les IRSC et subventions du NIH.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Reagent
NODSCIDJackson Lab0013038 semaines
B5/EGFPJackson Lab003516
ACTB/DsRED sourisJackson Lab005441
Tear GelNovartisT296/2
2 % Lidocaïne-ÉpinéphrineBimeda MTC25SPUtilisation
Vetbond3M1469SB
acrylique autopolymérisableBosworth166260Utilisation ~30 % (w/v)
10K MW Dextran-Alexa647InvitrogenD22914Utilisation @ 0,6 mg/kg dans la solution saline
CD31-APCBDPharmingen551262Utilisation @ 0,3 mg/kg dans la solution saline
AK-fluor (Fluorescéine) 10 %AKORN inc.NDC 17478-253-10Utiliser @ 7,7 mg/kg dans une solution saline
de bétadinePurdue ProductsNDC 67618-150
Equipment
Fine TweezersVWR82027-402
Ciseaux de dissection fineVWR25870-002
22G NeedleBD305156
27G 0.5 ml TB seringueBD305620
Micro-perceuse à mainOutils de sciences fines18000-17
Foret trépan trépan de 2,7 mmOutils de sciences fines18004-27
10 μ ; l 30G Seringue HamiltonSigma Aldrich20909-U
Lamelle en verre 3 mmWarner Instruments64-0720 CS-3R
Lunettes de fluorescenceBLSFHS/T01Casque de base
Cadre stéréotaxiquestoelting51950
Souris de contention pour injection IVBrain Tree LifescienceMTI
souris souris Kit

Références

  1. Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
  2. Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
  3. Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
  4. Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74(2008).
  5. Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
  6. Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
  7. Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
  8. Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059(2010).
  9. Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
  10. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
  11. Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366(2012).
  12. Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
  13. Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
  14. Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641(2010).
  15. Zhang, H. -r Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
  16. Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
  17. Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
  18. Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
  19. Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
  20. Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
  21. Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).
  22. Burrell, K., Zadeh, G. Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , InTech. (2012).
  23. Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
  24. Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
  25. Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
  26. Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).

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Mots-clés

Fen tre intracr nienneMicroscopie deux photonsCellules prog nitrices de la moelle osseuseIrradiation st r otaxiqueSouris chim riques fluorescentesImagerie en temps r elR solution l chelle de la cellule uniqueDynamique de vascularisationMigration des cellules tumoralesMarquage au dextrane

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