Cet article détaille les procédures d'analyse d'imagerie optique de la nanoparticule tumeur ciblée, Herdox. En particulier, l'utilisation de détail du dispositif d'imagerie multimode pour détecter le ciblage tumoral et l'évaluation de la pénétration tumeur est décrit ici.
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Article de méthode
Analyse de la protéine virale ciblée nanoparticules administrées à HER2 + Tumeurs
Dans cet article
Résumé
Résumé
La nanoparticule HER2 + tumeur-spécifique, Herdox, présente une accumulation de tumeur préférentiel et l'ablation de tumeurs se développer dans un modèle animal de cancer de HER2 +. Herdox est formée par des non-covalente d'auto-assemblage d'une protéine de pénétration cellulaire ciblé tumeur avec l'agent de chimiothérapie, la doxorubicine, par l'intermédiaire d'un petit segment de liaison d'acide nucléique. Une combinaison de électrophile, intercalation, et les interactions d'oligomérisation faciliter l'auto-assemblage en particules rondes 10-20 nm. Herdox présente une stabilité dans le sang, ainsi que dans un stockage prolongé à des températures différentes. Administration systémique de Herdox chez les souris porteuses de tumeurs résultats dans la mort des cellules tumorales, sans effets néfastes décelables à un tissu non tumoral, y compris le cœur et le foie (qui subissent des dommages marquée par la doxorubicine non ciblée). HER2 facilite élévation de ciblage pour des cellules exprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique humain, d'où les tumeurs présentant des taux élevés de HER2 présentent une plus grande accumulation de Herdox rapport aux cellules expressionchanter des niveaux inférieurs, à la fois in vitro et in vivo. Imagerie de fluorescence associée à l'analyse spectrale confocale et in situ a permis de vérifier dans la tumeur in vivo ciblage et la pénétration des cellules tumorales de Herdox après l'accouchement systémique. Ici, nous détaillons nos méthodes pour évaluer le ciblage tumoral par l'imagerie multimodale après l'accouchement systémique.
Introduction
Ciblage tumoral de la chimiothérapie a le potentiel d'éliminer les cellules cancéreuses à dose plus faible par rapport aux médicaments non ciblées parce que plus de la thérapie livré peut s'accumuler à sa destination plutôt que de distribuer des tissus non tumoraux. Comme cette dernière situation diluerait sur l'efficacité du médicament et donc nécessiter des doses plus élevées pour être efficace, de ciblage tumoral présente des avantages thérapeutiques et de sécurité par rapport au traitement non ciblée standard.
Cibler la chimiothérapie par encapsulation dans des nanoparticules auto-assemblés permet au médicament de rester sans modification chimique contrairement aux médicaments qui sont liés de manière covalente à des molécules de ciblage. Comme tel lien a le potentiel de modifier l'activité à la fois la drogue et la molécule de ciblage, l'assemblage non covalente permet la puissance du médicament doit être conservé.
Nous avons précédemment montré que le roman à trois composants, complexe auto-assemblée, Herdox, cible HER2 + tumeurs In vivo et suscite l'ablation de tumeurs croissance tout en épargnant les tissus normaux, y compris le cœur 1. Herdox est formé par des interactions non covalentes entre la protéine de liaison au récepteur cellulaire pénétration, HerPBK10, et l'agent de chimiothérapie, la doxorubicine (Dox), par l'intermédiaire d'un petit segment de liaison d'acide nucléique. HerPBK10 se lie au récepteur du facteur de croissance épidermique humain (HER) et déclenche l'endocytose médiée par un récepteur 4.2, alors que la pénétration de la membrane de l'endosome est accompli grâce à l'incorporation de l'adénovirus-base du penton dérivé protéine de capside 4-6. Un domaine chargé positivement sur de la protéine permet d'acide nucléique de liaison 4, 5, par lequel l'ADN-Dox intercalaire peut être transportée pour l'administration ciblée. Électrophile, l'intercalation, et, éventuellement, des interactions d'oligomérisation des protéines de faciliter l'auto-assemblage en particules rondes de 10 à 20 nm qui sont stables dans le sang et en cas de stockage prolongé à des températures différentes 1. Préférentiel visant à HER2 + cellules tumorales est facilitée par le renforcement affinité du ligand lorsque HER2 est élevé.
Nos études antérieures ont montré que l'administration systémique de rendements Herdox accumulation préférentielle dans les tumeurs de plus de tissu non tumoral et par rapport aux non ciblés Dox 1, et la pénétration dans les cellules tumorales in vivo 7. Nous avons observé que les rejets Herdox Dox après l'entrée des cellules tumorales, permettant l'accumulation Dox dans le noyau 1. Tumeur accumulation semble être en corrélation avec le niveau du récepteur, comme relativement faibles tumeurs HER2-exprimant accumulent moins Herdox par rapport à ceux ayant des niveaux relativement élevés de HER2 1. En outre, la concentration de la mort cellulaire efficace présente une corrélation inverse avec HER2 affichage sur des lignées cellulaires tumorales exprimant la surface des cellules différentes HER2 niveaux 1. Herdox présente un avantage thérapeutique et la sécurité sur Dox non ciblé, que l'homicide tumeur survient au cours dose 10 fois inférieure par rapport à la untarstances visées médicament et ne donne aucun effet négatif détectable sur le cœur (détectée par échocardiographie et histologiques tache) ou le foie (détectée par TUNEL tache) tissus, contrairement aux non ciblée Dox 1. En dépit de sa dérivation à partir d'une protéine de capside virale, HerPBK10 présente aucune immunogénicité décelable à des niveaux thérapeutiques 2. Tandis que les anticorps pré-existants à l'ensemble de l'adénovirus peuvent reconnaître HerPBK10, ils sont incapables d'empêcher la liaison cellulaire 2.
Volume tumoral mesuré au fil du temps est une méthode standard d'évaluation de l'efficacité thérapeutique des thérapies ciblées, et a été utilisée pour évaluer l'efficacité thérapeutique de Herdox. Complétant cette approche avec imagerie in vivo et ex vivo de l'intensité de fluorescence nous a permis de mieux évaluer l'efficacité du ciblage 7. Nous avons spécifiquement intégré dans l'imagerie confocale in situ des tumeurs excisées avec l'analyse spectrale de Dox fluorescence pour vérifier que Herdox past seulement accumulé à des tumeurs in vivo, mais pénètre dans les cellules tumorales et Dox livré dans le cytoplasme et le noyau 7. L'analyse spectrale de plus nous a permis de distinguer Dox fluorescence de autofluorescence 7.
Ici, nous démontrons plus en détail notre approche pour évaluer Herdox in vivo après administration systémique, et surtout, pour évaluer le ciblage par des méthodes et des analyses d'imagerie multimodes.
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Protocole
1. Livraison systémique in vivo
- Mélanger assez Herdox avec une solution saline stérile à assimiler 0,2 ml d'une dose de 0,004 mg / kg de Herdox par injection pour un 6-8 semaines d'âge nu / nu souris portant des tumeurs sous-cutanées bilatérales de xénogreffes de flanc.
- Tirer doucement le mélange Herdox dans une seringue à insuline 3/10 cc équipé d'une aiguille 29G, en évitant les bulles.
- L'anesthésie est induite par une brève exposition isoflurane dans une chambre d'induction équipé d'un système d'évacuation des gaz (débit d'oxygène: 0,5-1 L / min, la concentration d'isoflurane: 3-4% (ou moins).
- Injecter la totalité du mélange dans la veine de la queue d'une souris anesthésiée (0,2 ml par injection). Injection IV peut également être effectuée dans un sobre, souris non anesthésiées.
- Répéter les injections sur la même souris pendant six jours plus séquentielles, une fois par jour.
2. Fluorescence Imaging in vivo
L'accumulation de Herdox fluorescence dans les tumeurs peuventêtre détectable par le dernier jour de l'injection (Jour 7) en utilisant un imageur multimode. Les procédures ci-dessous reposent sur l'utilisation d'un système de macro-illumination et de détection personnalisée (Figure 1) 8.
- Allumez le Multimode En imageur optique in vivo.
- Sélectionnez un filtre passe-bande d'émission (590 nm ± 30 nm) adapté à la détection par fluorescence doxorubicine.
- Activer le laser argon-krypton et de placer un filtre passe-bande d'excitation (488 nm ± 10 nm) dans le chemin optique du laser.
- Allumez le système d'anesthésie et ensuite placer une souris dans la chambre anesthésiant (débits d'oxygène: 0,5-1 L / min, la concentration d'isoflurane: 3-4% (ou moins) équipés d'un système d'évacuation des gaz.
- Transférer la souris de la chambre anesthésiant à la chambre de l'imagerie de la Multimode In vivo imageur optique lorsque la souris est anesthésiée.
- Placer un cône de nez sur le nez de la souris et ouvrir le flux d'administrer anesthésie continuesia cours acquisition d'images (débits d'oxygène: 0,5-1 L / min, la concentration d'isoflurane: 2-3% (ou moins).
- Acquérir les images de fluorescence en utilisant un temps d'exposition de 5-15 sec.
- Procéder à l'analyse d'image et de traitement, y compris la correction de fond ou de réglage du contraste.
3. Fluorescence Imaging Ex vivo
Herdox fluorescence peut être visualisé dans les tumeurs et des organes spécifiques (y compris le foie, les reins, la rate, le cœur et les muscles squelettiques) récoltées à partir des souris euthanasiés à 24 heures après la dernière injection (Jour 7) de Herdox.
- Allumez le Multimode En imageur optique in vivo.
- Sélectionnez un filtre passe-bande d'émission (580 nm ± 20 nm) pour la détection par fluorescence doxorubicine.
- Activer le laser argon-krypton et de placer un filtre passe-bande d'excitation (488 nm ± 10 nm) dans le chemin optique du laser.
- Placer les tumeurs et les organes spécifiques disposés sur une boîte de Petri dans la chambre d'imagerie of le Multimode En imageur optique in vivo.
- Acquérir les images de fluorescence de tissus en utilisant un temps d'exposition de 5-15 sec. Un exemple de première acquisition d'image par fluorescence est représenté en figure 2a. Répétez la même chose en utilisant une boîte de Petri vide, qui servira de toile de fond (Figure 2b).
- Procéder à l'analyse d'image et de traitement, y compris la correction de fond ou de réglage du contraste. Un exemple d'une image corrigée est illustré à la figure 2c, résultant de la soustraction de la figure 2b de la figure 2a.
4. Dans l'imagerie confocale in situ des tumeurs
Dans l'imagerie confocale in situ permet la détection et l'analyse de l'accumulation de tumeur Herdox au niveau cellulaire.
- Tourner sur un Leica SPE microscope confocal.
- Sélectionner une lumière laser 488 nm pour l'excitation de la doxorubicine et l'émission des longueurs d'onde (560 à 620 nm) pour la doxorubicinela détection de fluorescence.
- Sélectionnez un objectif 40X ou 63X et l'huile d'immersion goutte sur l'objectif.
- Extrait tumeurs fraîches de souris euthanasiés qui ont déjà reçu des traitements Herdox et se moquent comme décrit dans la procédure 2.
- Placer les tumeurs sur une boîte de Pétri sur la glace pour éviter la dégradation du tissu, puis transférer les tumeurs à une chambre Delta T pour l'imagerie confocale.
- Acquérir les images confocale des tumeurs à des profondeurs focales séquentiels (taille d'étape: 1 pm, épaisseur: 20 pm). Un exemple d'images successivement acquises le long de l'axe z est illustré à la figure 3, panneau de gauche.
- Effectuer intensité maximale z-projection des images. Une projection d'intensité maximum de z-stack images est illustré à la figure 3, panneau de droite.
- Calcul des intensités de fluorescence moyenne de l'intensité maximale. Z - images de projection moyenne des intensités de fluorescence des images sur le champ de vue global était calculerd utiliser ImageJ.
5. Imagerie spectrale et radiométrique Analyse
Imagerie spectrale et radiométrique analyse permet la discrimination entre Dox fluorescence et autofluorescence.
- Puissance sur un microscope confocal à balayage laser fluorescence.
- L'acquisition de 15 images des tumeurs traitées par Herdox et non traitée, à une profondeur spécifiée dans la plage spectrale de 510 à 650 nm, avec une taille de pas de 10 nm, et la lumière d'excitation à 488 nm en utilisant un microscope confocal Leica SPE.
- Préparer une solution à 100 uM de la doxorubicine.
- Effectuer imagerie spectrale de la solution de doxorubicine de 100 pm pour obtenir la signature spectrale pure de Dox fluorescence (gamme spectrale: 510 à 650 nm, une taille de pas: 10 nm). Les résultats typiques de l'acquisition d'images à partir de l'imagerie spectrale et résultant spectre de fluorescence représentées sous forme de graphique sont présentés dans la figure 4.
- Acquérir la signature spectrale autofluorescence d'une image cube (gamme spectrale: 510 à 650 nm, une taille de pas: 10 nm) obtenue par l'imagerie spectrale des tumeurs non traitées. Les résultats typiques de l'acquisition d'images à partir de l'imagerie spectrale et résultant spectre de fluorescence représentées sous forme de graphique sont présentés dans la figure 5.
- Générer quatre signatures spectrales de référence (autofluorescence pure, 0.1.doxorubin +0,9. Autofluorescence, 0,2. Doxorubicine +0,8. Autofluorescence, 0.3.doxorubin +0,7. Autofluorescence) en utilisant le programme que nous avons mis au point 9. Une courbe typique montrant quatre signatures spectrales de référence est montré dans la figure 6.
- Effectuer classification spectrale des images tel que défini par la référence signatures spectrales par mesure de distance euclidienne en utilisant le programme que nous avons précédemment développé 9.
- Effectuer déconvolution spectrale linéaire de ces images en utilisant un programme spectrale de démixage (plug-in dans ImageJ), nous avons développé 7, 10, par rapport à l'imagerie spectrale quotientométrique et d'analyse. Exemple de séparer fluorescence Herdox de autofluorescence par déconvolution spectrale linéaire est illustré à la figure 7.
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Résultats
La figure 1 montre le prototype d'imageur optique in vivo, qui a été construit dans le but d'acquisition d'image en de multiples modalités, y compris l'intensité de fluorescence, spectrale, durée de vie, 2-photon, confocale intra-vital, et l'imagerie par bioluminescence in. En outre, la caméra haute sensibilité refroidie et lignes laser haute puissance intégrée dans ce système rendements contraste des images de fluorescence élevés par rapport aux systèmes d'imag...
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Discussion
Dox fluorescence peut être détectable in vivo en utilisant l'imageur multimode lorsque les tumeurs sont sous-cutanée. Cependant, la dose thérapeutiquement efficace d'Herdox (0,004 mg / kg) est inférieur au seuil de détection après une seule dose. En revanche, après 7 injections quotidiennes (1x/jour pendant 7 jours), l'accumulation tumorale et la rétention de la particule est suffisante pour permettre la visualisation de Dox fluorescence.
Il est essentiel quand on travai...
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Déclarations de divulgation
L'auteur, Daniel Farkas, est président du Molecular Imaging Spectral. Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts.
Remerciements
Ce travail a été financé par des subventions à LKM-K de la National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 et R01CA140995) national. Dr Medina-Kauwe remercie C. Rey, M. M-Kauwe et D. Revetto d'un soutien continu.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Microscope confocal à balayage laser à fluorescence | Leica | SPE | |
| em>In Vivo Imageur optique | Imagerie moléculaire spectrale | multimode In Vivo Imageur | |
| Doxorubicine-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Souris nue (NU/NU), femelle, 6-8 semaines | Charles River | Code de souche 088 | |
| MDA-MB-435 cellules tumorales humaines HER2+ | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| seringue à insuline 3/10 cc U-100 avec 29G x 1/2" Ultra-FineIV aiguille fixée en permanence | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
Références
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Réimpressions et autorisations
