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La stimulation mécanique induite par le calcium propagation des ondes dans des monocouches de cellules: l'exemple de bovins cellules endothéliales de la cornée

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DOI :

10.3791/50443

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16 juillet 2013

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Dans cet article

Résumé

Ca intercellulaire 2 +-Ondes sont entraînés par des chaînes et hémicanaux de jonction gap. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer intercellulaire Ca 2 +-Ondes dans des monocouches de cellules en réponse à un stimulus mécanique seule cellule locale et son application à l'étude des propriétés et la régulation des canaux et hémicanaux de jonction gap.

Résumé

Communication intercellulaire est essentiel pour la coordination des processus physiologiques entre les cellules dans une variété d'organes et de tissus, y compris le cerveau, le foie, la rétine, la cochlée et le système vasculaire. Dans un cadre expérimental, intercellulaire Ca 2 +-ondes peut être obtenue en appliquant un stimulus mécanique à une seule cellule. Cela conduit à la libération des molécules de signalisation intracellulaire IP 3 et Ca 2 + qui initier la propagation de la Ca 2 +-onde concentrique de la cellule stimulée mécaniquement les cellules voisines. Les principales voies moléculaires qui contrôlent intercellulaire Ca 2 + propagation d'ondes sont fournis par des canaux des jonctions lacunaires par le transfert direct de IP 3 et par hemichannels par la libération d'ATP. Identification et caractérisation des propriétés et la régulation des différents isoformes connexine et pannexine les canaux et les hémicanaux de jonction gap sont autorisés par le quantification de la propagation de la Ca 2 + intracellulaire-ondes, siRNA, et l'utilisation d'inhibiteurs de canaux et hémicanaux de jonction gap. Ici, nous décrivons une méthode pour mesurer intercellulaire Ca 2 +-ondes dans des monocouches de cellules endothéliales de la cornée primaires chargé de Fluo4-AM en réponse à un stimulus mécanique contrôlée et localisée provoquée par une déformation aiguë, de courte durée de la cellule à la suite toucher de la membrane de la cellule avec une micropipette de verre micromanipulateur contrôlé avec un diamètre de pointe de moins de 1 um. Nous décrivons également l'isolement des cellules endothéliales de la cornée bovine primaire et son utilisation comme système modèle pour évaluer l'activité Cx43-hemichannel comme la force entraîné pour intercellulaire Ca 2 +-ondes à travers la libération de l'ATP. Enfin, nous discutons de l'utilisation, les avantages, les limites et les variantes de cette méthode dans le cadre du canal de jonction d'espace et la recherche de hemichannel.

Introduction

Communication intercellulaire et la signalisation sont essentiels pour la coordination des processus physiologiques en réponse à des agonistes extracellulaires au niveau du tissu et de 1,2 niveau entier organe. La façon la plus directe de la communication intercellulaire est créée par la présence de jonctions. Les jonctions lacunaires sont des plaques de canaux de jonctions lacunaires, qui sont des chaînes protéiques formés par l'accueil en tête-à-tête de deux (Cx) hemichannels connexine de cellules adjacentes 3,4 (figure 1). Les jonctions lacunaires permettent le passage de petites molécules de signalisation avec un poids moléculaire de moins de 1,5 kDa, notamment Ca2 + ou IP 3 5, ce qui provoque et de modulation du Ca 2 + de la libération des réserves intracellulaires des cellules voisines 6 (figure 2). canaux des jonctions lacunaires sont strictement réglementées par les interactions entre protéines intra-et intermoléculaires et par des processus de signalisation cellulaire, comme la modification redox etphosphorylation 7. GJ faciliter la réponse coordonnée de cellules connectées, agissant ainsi comme un syncytium chimique et électrique. Par exemple, la propagation du potentiel d'action cardiaque dans les myocytes auriculaires et ventriculaires est médiée par des canaux GJ Cx à base 85. Cx ont non seulement un rôle de canaux de jonctions lacunaires, mais aussi former hemichannels non appariés, fonctionnant ainsi comme des canaux dans les membranes de même pour les canaux ioniques réguliers 8-10 (Figure 1). Hémicanaux participent à la signalisation paracrines entre cellules voisines en contrôlant l'échange d'ions et molécules de signalisation entre l'environnement intra-et extracellulaire.

Dans de nombreux types de cellules (comme les cellules épithéliales, les cellules ostéoblastiques, les astrocytes, cellules endothéliales, etc) et des organes (comme le cerveau, le foie, la rétine, la cochlée et le système vasculaire), intercellulaire Ca 2 +-ondes sont fondamentales pour la coordination des réponses multicellulaires 11. L'augmentation des niveaux 2 + intracellulaire de Ca dans une certaine cellule ne sont pas limités à cette cellule, mais se propagent aux cellules voisines environnantes, établissant ainsi un intercellulaire Ca 2 +-ondes 12,13. Ces intercellulaire Ca 2 +-ondes sont importants pour la régulation physiologique normal de couches de cellules comme un syncytium et leur dérégulation a été associée à des processus physiopathologiques 11. Dans l'endothélium cornéen et l'épithélium, les différents groupes 14-24, y compris notre propre 25-33, a étudié les mécanismes et les rôles de la communication intercellulaire. Dans les cellules non-excitables, comme les cellules endothéliales de la cornée, deux modes distincts de communication intercellulaire surviennent 28,29, à savoir écart de jonction communication intercellulaire et de la communication intercellulaire paracrine. La communication intercellulaire par jonction implique un échange direct de molécules de signalisation via les jonctions gap 7. Gap jonctioncommunication intercellulaire internationale est essentielle pour le maintien de l'homéostasie tissulaire, contrôle de la prolifération cellulaire, et d'établir une réponse synchronisée au stress extracellulaire 10,34,35. Dans un certain nombre de pathologies, l'écart couplage de jonction est réduite en raison de Cx défectueux, et affectant la présente écart de jonction communication intercellulaire 36. Ceci souligne l'importance et l'influence de la communication intercellulaire par jonction dans les organismes multicellulaires. Contrairement à la communication intercellulaire par jonction, la communication intercellulaire paracrine ne dépend pas de l'apposition de cellule à cellule, car elle implique la libération de messagers extracellulaires diffusables (Figure 2). Différents types de molécules de signalisation sont libérés dans l'espace extracellulaire par les cellules de signalisation. La molécule est alors transporté vers la cellule cible, où elle est détectée par une protéine réceptrice spécifique. Par la suite le complexe du signal du récepteur induit une réponse cellulaire, quiil est mis fin par le retrait du signal, l'inactivation ou une désensibilisation. Lipophiles messagers extracellulaires de signalisation Sortie pénétrer la membrane et agissent sur des récepteurs intracellulaires. En revanche, les messagers hydrophiles ne traversent pas la membrane plasmique de la cellule de réponse, mais agissent comme un ligand qui se lie à-exprimés surface des protéines réceptrices, qui ensuite transmettent le signal vers le milieu intracellulaire. Trois grandes familles de protéines réceptrices de surface cellulaire participent à ce processus: canal ionique lié, lié à une enzyme et la protéine G liés. La molécule de messager libéré peut agir sur les récepteurs de la même cellule (autocrine), sur des cellules cibles à proximité (paracrine), ou sur les cellules cibles lointaines qui nécessitent le système circulatoire (endocrine).

Dans de nombreux types de cellules, y compris endothélium cornéen 28,29, l'ATP est l'un des principaux facteurs hydrophiles, paracrines qui stimulent la propagation des intercellulaire Ca 2 +-ondes 37-40. DurING déformation mécanique, l'hypoxie, l'inflammation ou de la stimulation par divers agents, ATP peuvent être libérés à partir de cellules saines 41-44 en réponse à la contrainte de cisaillement, étirement, ou gonflement osmotique 44,45. Différents mécanismes ATP à libération prolongée ont été avancées, y compris l'exocytose vésiculaire 44 et une pléthore de mécanismes de transport, tels que les cassettes (ABC) transporteurs de liaison ATP, canaux anioniques voltage-dépendants plasmiques 46, P2X7 canaux récepteurs 47,48, ainsi que connexine hemichannels 49-52 et pannexine hémicanaux 43,49,53. ATP extracellulaire peut être rapidement hydrolysé à l'ADP, l'AMP et l'adénosine 54,55 par ectonucléotidases qui sont présents dans le milieu extracellulaire. L'ATP extracellulaire libéré et son métabolite ADP 56 se propage par diffusion. L'interaction ultérieure de ces nucléotides avec des récepteurs purinergiques dans les cellules voisines a été impliquée dans la propagation de intercellulaire Ca 2 +-ondes 28,37,51. Deux classes différentes de récepteurs purinergiques sont présents: l'adénosine est le principal ligand naturel pour P1-purinorécepteurs, alors que les deux purine (ATP, ADP) et pyrimidiques (UTP, UDP) nucléotides agissent sur ​​la plupart P2-purinorécepteurs 57.

Communication intercellulaire peut être étudiée par différentes méthodes telles que gratter chargement, transfert de colorant, uncaging locale d'agonistes comme IP3 et Ca 2 +, la stimulation mécanique, etc. Nous décrivons ici l'étude de Ca 2 + propagation d'onde provoquée par une stimulation mécanique d'une seule cellule. L'avantage d'étudier Ca 2 + propagation d'ondes par une stimulation mécanique est qu'il fournit un outil facile à quantifier la propagation de la Ca 2 +-onde au fil du temps et il permet de comparer quantitativement différents prétraitements des cellules. Dans l'endothélium cornéen, les intercellulaire Ca 2 +-ondes permettent une coréponse coordonnée à partir de la monocouche, agissant par les présentes en tant que mécanisme de défense possible de l'endothélium cornéen non régénératif aider l'endothélium pour résister aux contraintes extracellulaire lors de la chirurgie intra-oculaire, ou par exposition à des médiateurs inflammatoires pendant rejet immunitaire ou uvéite 58,59.

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Protocole

1. Isolement des cellules endothéliales de la cornée

Avant de commencer: isoler les cellules des yeux neufs, provenant d'un abattoir local, dès que possible après énucléation de l'œil. Assurez-vous que l'œil a été énucléé d'une vache du maximales de 18 mois, à cinq minutes post mortem et conservées dans une solution saline équilibrée de Earle - solution d'iode de 1% à 4 ° C pour le transport au laboratoire.

  1. Prenez l'œil de la solution saline équilibrée de Earle - solution d'iode à 1% et le placer dans une boîte de Pétri (100 x 20 mm).
  2. Stériliser les yeux avec une solution contenant 70% d'éthanol et rincer avec une solution saline équilibrée de Earle contenant 1% d'iode.
  3. A partir de cette étape, le travail sur une hotte stérile. Disséquer soigneusement la cornée de l'œil et le placer dans une boîte de Pétri (35 x 10 mm) contenant une solution saline équilibrée de Earle, avec la couche de cellules épithéliales vers le haut. Retirez soigneusement sti de tissu restant irisll attachée à la cornée, si nécessaire.
  4. Transférer la cornée à la solution saline équilibrée de Earle autre boîte de Pétri contenant de la couche de cellules endothéliales vers le haut et rincer deux fois avec une solution saline équilibrée de Earle.
  5. Transférer la cornée avec la couche endothéliale vers le haut à un sablier, qui est un plat en forme de coupe, et le couvrir avec un milieu de croissance. Le milieu de croissance est constitué du milieu de Eagle modifié par Dulbecco contenant 25 mM de glucose, 10% de sérum de veau fœtal, 6,6% de L-glutamine, 2,5 pg / ml d'amphotéricine-B et 1% mélange d'antibiotiques antimycosiques contenant 10.000 unités / ml de pénicilline, 10.000 mg / ml de streptomycine et 25 pg / ml d'amphotéricine B.
  6. Retirer le support avec une pipette d'aspiration.
  7. Appliquer 300 ul d'une solution de trypsine (0,5 g / L) à la couche endothéliale de la cornée (toutes les étapes qui comprennent la trypsine sont effectuées en utilisant la même concentration).
  8. Placer le sablier contenant la cornée dans un plat de Petri couvert et le mettre dans le incubator pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO 2.
  9. Grattez délicatement les cellules endothéliales loin de la cornée avec un feu poli en forme de crochet pipette Pasteur en verre dans une hotte stérile.
  10. Sucer la solution contenant les cellules endothéliales et l'ajouter à des flacons de culture (25 cm 2) contenant 4 ml de milieu de culture.
  11. Appliquer 300 ul de milieu de croissance de la cornée et de répéter le raclage et ajouter la solution contenant les cellules endothéliales dans le flacon de culture.
  12. Répétez cette dernière étape (1.11) une fois de plus.
  13. Placer les flacons de culture contenant les cellules endothéliales de la cornée dans le milieu de culture à l'étuve à 37 ° C et 5% de CO 2.
  14. Après deux jours, ajouter 6 ml de milieu de culture.
  15. Rafraîchir le milieu de croissance tous les deux jours.

2. Culture cellulaire

  1. Retirez le milieu de culture et laver les cellules deux fois avec une solution saline équilibrée de Earle, lorsque la confluence est atteinte (au sein about 10 jours après isolement).
  2. Ajouter une solution de trypsine de 1,5 ml aux cellules pour les détacher et placer le ballon dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 3 à 4 min.
  3. Ajouter 12 ml de milieu de croissance. Introduire à la pipette du milieu à trois fois dans et hors de disperser les cellules et compter les cellules.
  4. Ensemencer les cellules avec une fraction variable selon la densité cellulaire et les mettre dans l'incubateur. Préparer deux lames bien cloisonnées (avec une surface de 4,2 cm 2) avec un nombre de cellules de cellules 165 000 (densité de cellule de 39 286 par cm 2). Préparer 80 cm 2 flacons de culture pour un nouveau passage à une densité de 6.250 par cm 2, et ajouter du milieu de culture frais jusqu'à un volume total de 25 ml.
  5. Actualisez la moyenne tous les deux jours.
  6. Confluence de la couche de cellules est atteinte après 3 à 4 jours. Utiliser des cellules pour les expériences.
  7. Lorsque la confluence de la couche de cellules dans les flacons est atteint, répétez les étapes 2.1 à 2.6. Cultures cellule à passage 2 peut être utilisé fou expériences.

3. La stimulation mécanique pour induire Calcium onde

  1. Chargez les cellules dans la diapositive chambré avec 10 uM Fluo-quatre heures dans une solution saline pendant 30 min tampon phosphate à 37 ° C en agitant doucement.
  2. Retirez le Fluo-quatre heures solution, se laver les cellules cinq fois avec un tampon phosphate salin, incuber les cellules avec un tampon phosphate salin et laisser les cellules pendant au moins 5 min à température ambiante avant la mesure.
  3. Excite à 488 nm avec laser argon et de l'utilisation diviseur de faisceau HFT 488, collecter l'émission de fluorescence à 530 nm en utilisant un filtre passe-haut émission LP 505, réglez le sténopé au minimum. Utilisez une immersion objectif 40X de pétrole (Air, 1,2 NA). Dans les expériences avec ARL-67156, utilisez un objectif 10X (Air, 0,3 NA).
  4. Rechercher un domaine dans lequel les cellules sont confluentes sur le microscope confocal.
  5. Position de la pipette de sorte qu'il est à 45 ° par rapport à la glissière et chambré toucher la membrane cellulaire.Provoquer un court stimulation mécanique (≈ 1 seconde) à une seule cellule. La stimulation mécanique se compose d'une déformation aiguë, de courte durée de la cellule de toucher moins de 1% de la membrane de la cellule avec une micropipette en verre (diamètre pointe <1 um) couplé à un nanopositionneur de cristal piézo-électrique, actionné par un amplificateur qui est monté sur un micro-manipulateur. Les pipettes en verre sont fabriqués avec un extracteur de microélectrodes. Assurez-vous que le nanopositionneur est exploité par une tension comprise entre 0,2 et 1,5 V au cours de la stimulation mécanique. Une tension supérieure à 1,5 V peut entraîner des dommages cellulaires. Pour chaque type et état de la cellule, la tension optimale pour la stimulation mécanique sans endommager la cellule doit être soigneusement déterminé en appliquant une série de tensions d'amorçage de faible (0,2 V) à grande (1,5 V) de tension. La tension est une mesure de la force de l'excitation depuis cette tension détermine la contrainte mécanique et la tension qui sont appliqués à la membrane cellulaire. Lela force de la stimulation mécanique peut être calculée en multipliant la contrainte mécanique avec la surface. Depuis la fois la zone (<3,14 um 2) et la contrainte mécanique est très faible, la force de l'excitation mécanique est faible. (Notez que quand une cellule est endommagé, les fuites de fluorescence de la cellule et la cellule devient sombre.)
  6. Mesurer les variations spatiales de la [Ca 2 +] i suite à une stimulation mécanique avec le microscope confocal.
  7. Collecter et stocker des images.
  8. Dessiner une région polygonale d'intérêt pour définir la zone de surface totale de cellules sensibles (zone active, AA) en utilisant le logiciel du microscope confocal.

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Résultats

Toutes les expériences sont réalisées en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation et le protocole en démonstration est effectuée sous la direction et l'approbation du soin des animaux et le comité de l'utilisation de la KU Leuven.

Dans les cellules endothéliales de la cornée bovine (BCEC), les jonctions fonctionnels sont exprimés et à la fois espace de jonction communication intercellulaire et de la communication intercellulaire paracr...

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Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode simple pour mesurer intercellulaire Ca 2 + propagation d'ondes dans des monocouches de cellules endothéliales de la cornée bovine primaire en fournissant une stimulation mécanique localisée et contrôlée à l'aide d'une micropipette. Cellules stimulées mécaniquement réagissent avec une augmentation locale IP intracellulaire 3 et Ca 2 +, qui sont tous deux molécules de signalisation intracellulaires essentielles qui animent intercell...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les travaux de recherche effectués dans le laboratoire a été financé par des subventions de la Fondation de la recherche - Flandre (FWO, les numéros de subvention G.0545.08 et G.0298.11), le Programme des pôles d'activité interuniversitaire (Politique scientifique fédérale, numéro de subvention P6/28 et P7/13) et est intégré dans une communauté de recherche FWO-prise en charge. CDH est un chercheur post-doctoral de la Fondation de la recherche - Flandre (FWO). Les auteurs sont très reconnaissants à tous les membres actuels et anciens du Laboratoire de génétique moléculaire et de la signalisation cellulaire (KU Leuven), le Dr SP Srinivas (Indiana University School of Optometry, USA), le laboratoire du Dr Leybaert (Université de Gand) et de Dr. Vinken (VUB) qui a fourni discussions utiles, optimisé procédures ou ont été impliqués dans le développement d'outils pour l'étude des hemichannels connexine.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution saline équilibrée d’Earle (EBSS)Sondes moléculaires Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Allemagne)14155-048
IodeSigma-Aldrich (Deisenhofen, Allemagne)38060-1EA
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)Sondes moléculaires Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Allemagne)11960-044
L-glutamine (Glutamax)Sondes moléculaires Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Allemagne)35050-038
Amphotéricine-BSigma-Aldrich (Deisenhofen, Allemagne)A2942
Mélange d’antibiotiques et d’antimycosiquesSondes moléculaires Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Allemagne)15240-096
Sondesmoléculaires Trypsine Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Allemagne)25300-054
Dulbeccosondes moléculaires PBSInvitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Allemagne)14190-091
Fluo-4 AMSondes Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Allemagne)F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Allemagne)A265
Apyrase VISigma-Aldrich (Deisenhofen, Allemagne)A6410
Apyrase VIISigma-Aldrich (Deisenhofen, Allemagne)A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)Synthèse
Gap27 (SRPTEKTIFII)Synthèse
Peptide de contrôle (SRGGEKNVFIV)Synthèse
siRNA1 Cx43 (sens : 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Le siRNA recuit a été acheté à Eurogentec (Luik, Belgique)
siRNA2 Cx43 (sens : 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Le siRNA recuit a été acheté chez Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble : séquence brouillée de siCx43-1 (sens : 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Le siRNA recuit a été acheté chez Eurogentec (Luik, Belgique)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)Thermo Electron (Ulm, Allemagne)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Allemagne)
Deux lames de verre à chambreLaboratory-Tek Nunc (Roskilde, Danemark)155380
Microscope confocal Carl Zeiss Meditec (Iéna, Allemagne)LSM510
Piez– ; nanopositionneur de cristal électrique (Piezo Flexure NanoPositioner)PI Polytech (Karlsruhe, Allemagne)P-280
HVPZT-amplifierPI Polytech (Karlsruhe, Allemagne)E463 HVPZT-amplifier
Tubes en verre (remplacement du verre 3,5 nanolitres)World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Floride, États-Unis4878
Micr– ; extracteur de lectrode Zeitz Instrumente (München, Allemagne)WZ DMZ-Universal Puller
peptidique personnaliséepeptidique personnaliséepeptidique personnalisée

Références

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