Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

Résumé

La culture de la cellule primaire est une technique utile pour l'analyse de populations spécifiques de cellules, en particulier à partir d'embryons de souris transgéniques à des stades spécifiques du développement. Ici, ventricules embryonnaires sont disséqués et dissociées, et des perles anticorps conjugués à reconnaître et séparer les cellules endothéliales pour une analyse ultérieure.

Résumé

La culture cellulaire a grandement amélioré notre capacité à évaluer les différentes populations de cellules dans des conditions de culture innombrables. Alors que des lignées cellulaires immortalisées offrent des avantages significatifs pour leur facilité d'utilisation, ces lignées cellulaires ne sont pas disponibles pour tous les types cellulaires potentiels. En isolant les cellules primaires à partir d'une région d'intérêt, en particulier à partir d'une souris transgénique, des études plus nuancées peuvent être effectuées. La technique de base consiste à disséquer l'organe ou partielle d'intérêt (par exemple le cœur ou une région spécifique du cœur) et dissocier l'organe de cellules individuelles. Ces cellules sont ensuite incubées avec des billes magnétiques conjuguées avec un anticorps qui reconnaît le type de cellule d'intérêt. Les cellules d'intérêt peuvent alors être isolées à l'aide d'un aimant, par une courte incubation de la trypsine dissocier les cellules à partir des perles. Ces cellules isolées peuvent alors être cultivées et analysées comme vous le souhaitez. Cette technique a été conçu à l'origine pour orgue de souris adultes, mais peut être facilement réduite pour une utilisation avec les organes embryonnaires, comme le démontre le présent document. Parce que notre intérêt est dans le système vasculaire coronarien développement, nous avons voulu étudier cette population de cellules embryonnaires au cours des étapes spécifiques. Ainsi, le protocole initial a dû être modifié pour être compatible avec la petite taille des ventricules embryonnaires et le faible rendement potentiel des cellules endothéliales à ces stades de développement. En utilisant cette approche à échelle réduite, nous avons évalué coronaire remodelage plexus dans les cellules endothéliales transgéniques ventriculaires embryonnaires.

Introduction

L'avènement de lignées cellulaires immortalisées a révolutionné la biologie cellulaire de base ^1. Les lignées cellulaires actuellement disponibles sont issus d'un large éventail d'organes et englobent tous les principaux types de cellules. Cependant, les lignées cellulaires établies ont certaines limites. Le processus d'immortalisation change évidemment le comportement des cellules, en particulier en ce qui concerne la durée de vie et la prolifération, mais peut également affecter l'expression des protéines inattendus, tels que les protéines du cytosquelette ^2. En outre, bien que de nombreuses lignées cellulaires différentes ....

Protocole

1. Préparer Perles anticorps conjugués

1. Un jour avant la dissection, mélanger l'anticorps de choix avec les Dynabeads appropriées (par exemple Dynabeads IgG de rat pour un anticorps dirigé chez le rat, 4 x 10 ⁸ perles / ml) selon les instructions du fabricant. Pour l'anticorps anti-CD31 anticorps de rat BD (0,5 pg / pl, utilisé pour isoler des cellules endothéliales), trois anticorps pi est ajouté pour 25 perles pl, pour une concentration finale de 1,5 mg d'anticorps anti-CD31 et 1 x 10 ⁷ perles / 25 pi de tampon.
2. Incuber des perles et des anticorps nuit à 4 ° C.

2. Prépar....

Résultats

En utilisant un anticorps spécifique de l'endothélium qui reconnaît CD31, les cellules endothéliales ont été isolés à partir des ventricules embryonnaires (E) 13,5 (figure 1A) et 18.5 (figures 1B-1D) embryons. Lorsqu'il est cultivé sur une boîte de culture traitée, ces cellules restent arrondis et pourraient former un motif de pavés si près de confluence (figure 1A). Diluer collagène a également été utilisé pour recouvrir les puits, et tandis que les cellules en.......

Discussion

Travailler avec des cellules embryonnaires primaires permet des expériences nouvelles pour traiter in vitro étapes critiques du développement. Toutefois, la procédure d'isolement n'est pas anodin. Les étapes critiques pour isoler un type de cellules comprennent veillant à ce que les cellules sont bien séparés par digestion par la collagénase, puis qu'ils sont bien en suspension au cours des étapes de lavage. Dissection mécanique par pipetage contribue grandement séparer les cellules lors de l'ét.......

Matériaux

EQUIPMENT

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
REAGENTS
Timed-pregnant			micelles À disséquer au stade embryonnaire d’intérêt
Anti-souris CD31	BD Bioscience	553370
Rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
Collagène	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
Colagénase, type I	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Milieu de croissance des cellules endothéliales	(fabriqué en laboratoire comme décrit dans les notes)		DMEM contenant 20 % FBS, 5 &mu ; M β ;-mercapt– ; thanol, 50 &mu ; g/ml ECG, et 1x pénicilline/streptomycine
β ;-mercapt– ; thanol	Sigma-Aldrich	M6250
ECGS Biomedical	Technologies, Inc.	BT-203
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140
Trypsine-EDTA	Gibco	25300
Plaque de culture à 384 puits	Greiner	T-3037-6	La plaque a été préparée avec un gel de collagène fin, comme décrit dans 6 ; surface de travail 10 mm2
Collagène de type I	BD	354236	Utilisation lors d’une finale concentration de 1,5 mg/ml
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	Utilisé comme indiqué dans 13 <
Microscope stéréoscopique	Nikon	SMZ645
Thermo		3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
Centrifugeuse de table	Thermo	75002430

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