Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

Rajesh Guntupalli; Iryna Sorokulova; Eric Olsen; Ludmila Globa; Oleg Pustovyy; Vitaly Vodyanoy

doi:10.3791/50474

Article de méthode

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

DOI :

10.3791/50474

⸱

8 mai 2013

Rajesh Guntupalli¹ , Iryna Sorokulova¹ , Eric Olsen² , Ludmila Globa¹ , Oleg Pustovyy¹ , Vitaly Vodyanoy¹

¹Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University , ²Clinical Research Laboratory, 81st Medical Group, Keesler Air Force Base

Dans cet article

Résumé

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Biocapteurs de phages lytiques et des perles d'anticorps sont capables de discriminer entre résistant à la méthicilline (SARM) et les bactéries de staphylocoque sensibles. Les phages ont été immobilisés par une méthode de Langmuir-Blodgett sur une surface d'un capteur à microbalance à cristal de quartz et a travaillé comme Large gamme des sondes de staphylocoque. perles d'anticorps reconnaissent SARM.

Résumé

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Un bactériophage lytique structurellement transformée ayant un large spectre d'hôte des souches de Staphylococcus aureus et une protéine liant à la pénicilline (PBP 2a) anticorps billes de latex conjuguées ont été utilisées pour créer un biocapteur conçu pour discrimination résistant à la méthicilline (SARM) et sensible (SASM) S . espèces ^de Staphylococcus ^1,2. Les phages lytiques ont été transformés en sphéroïdes phages par le contact avec l'interface eau-chloroforme. Phage monocouches sphéroïde ont été déplacés sur une surface du biocapteur par Langmuir-Blodgett (LB) technique ^3. Les biocapteurs créés ont été examinés par une microbalance à cristal de quartz avec un suivi de dissipation (QCM-D) pour évaluer les interactions bactéries-phages. Interactions bactéries-sphéroïde conduit à la fréquence de résonance réduite et une augmentation de la dissipation d'énergie pour les deux souches de SARM et SASM. Après la liaison bactérienne, ces capteurs ont été plus exposées à l'anticorps protéine liant à la pénicilline perles de latexs. Capteurs analysés par le SARM ont répondu à PBP 2a perles d'anticorps, bien capteurs inspectés avec MSSA donné aucune réponse. Cette distinction expérimentale détermine une discrimination claire entre résistant à la méthicilline et S. sensible souches de Staphylococcus. Également liées et non liées bactériophages supprimer la croissance bactérienne sur les surfaces et dans les suspensions de l'eau. Une fois phages lytiques sont changés en sphéroïdes, ils conservent leur activité lytique forte et montrent une grande capacité de capture bactérienne. Les phages et les phages sphéroïdes peuvent être utilisés pour les essais et la stérilisation des micro-organismes résistant aux antibiotiques. D'autres applications peuvent inclure l'utilisation en thérapie bactériophage et surfaces antimicrobiennes.

Introduction

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Souches résistantes à la méthicilline de Staphylococcus aureus ont été suggérés comme un facteur dans les infections et les épidémies nosocomiales essentielles ^4-8. Les moyens ordinaires de la reconnaissance de la résistance à la méticilline, comme la diffusion test de disque d'oxacilline d'agar écran, ou microdilution, s'appuient sur des conditions de culture adaptées pour améliorer l'expression de la résistance. Les modifications comprennent l'utilisation de l'oxacilline, incubation à 30 ou 35 ° C plutôt qu'à 37 ° C, et l'ajout de NaCl dans le milieu de croissance. En outre, pour la détection correcte par ces type....

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Protocole

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1. Préparer le terrain

Obtenir souche de type S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 et Bacillus subtilis ATCC 6051. Souches résistantes à la méthicilline de S. aureus - MRSA1, le SARM 2, le SARM 5, 13 SARM, le SARM 26, 34 SARM, le SARM 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Le phage lytique 12600.
Obtenir PBP 2a anticorps billes de latex conjuguées.
Préparer NZY moyen comme décrit ^21.
Procurez-phosphate solution saline tamponnée (PBS).
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Résultats

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Le phage a démontré une activité lytique contre toutes les souches testées de S. aureus, y compris les souches de SARM, comme indiqué par le test de la goutte de phage. tailles de plaque variaient généralement de 5 à 15 mm. Aucune activité n'a été trouvée contre les autres-cultures d'essai (tableau 1).

Une croissance normale de S. aureus ATCC 12600 dans un milieu NZY sur agitateur-incubateur à 37 ° C est représenté en figure 1A (une.......

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Discussion

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Il est bien connu que les phages peuvent être utilisés comme sondes de biocapteurs pour les bactéries pathogènes ^28. Il est démontré dans ce travail que phage avec des anticorps 2a PBP peut être utilisé pour résoudre le vieux problème: les souches résistantes et sensibles aux antibiotiques discrimination rapides.

Il a été constaté cependant ces phages de staphylocoques non modifiés normales ne sont pas adaptés pour la détection des bactéries avec des dispositifs QCM, même si elles.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

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Les travaux rapportés ici ont été pris en charge par des subventions de l'Université d'Auburn AUDFS et USAF CRADA 07-277-60MDG-01. Les opinions exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas la politique ou la position officielle de l'Armée de l'Air des États-Unis, ministère de la Défense ou le gouvernement américain.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
réactifs
salin tamponné au phosphate (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
chloroforme de qualité spectrophotométrique	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8 % A.C.S.)
Hexane-anhydre	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95 %)
Alcool éthylique	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a anticorps billes de latex conjuguées	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japon	Le test
SARM-ScreenS. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 et Bacillus subtilis ATCC 6051 de	l’American Type Culture Collection (Manassas, VA) ;
SARM1, SARM 2, SARM 5, SARM 13, SARM 26, SARM 34, SARM 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882 ; Le phage lytique 12600	La collection de cultures de l’Université d’Auburn, Auburn, AL
Centrifugeuse	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuge
KSV 2200 LB Balance à film	KSV Chemicals, Finlande
Système optique de microscope optique	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Vä ; stra Frö ; lunda, Suède	E4
Microscope électronique à balayage (MEB)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F MEB
Microscopie électronique transmettrice (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 &mu ; m, GP Express PLUS membrane
Bio-Assay dish	NUNC A/S, Denmark	240835	Dimensions(mm), 245 x 245 x 25
Pipettes	Gilson, Pipetman, France	P100, P200, P1000
C24 Incubator Shaker	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Pièces de quartz recouvertes d’or	Auburn University, AL
Boîtes de Pétri	faites maisonFisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Flacons de culture	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Erlenmeyer flacons
Spectromètre optique	Genesys 20. Thermo Spectronic, États-Unis.	4001
Nettoyeur plasma	Harrick Plasma, États-Unis	PDC-32G
Système de purification d’eau Millipore	Ellipsomètre	Direct-Q
Accurion, États-Unis	nanofilm_ep³se
Software	Q-Sense AB, Suède	QSoft, QTools

d’imagerie Millipore

Références

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Guntupalli, R., Sorokulova, I., Krumnow, A., Pustovyy, O., Olsen, E., Vodyanoy, V. Real-time optical detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using lytic phage probes. Biosens. Bioelectron. 24, 151-154 (2008).
Guntupalli, R., Sorokulova, I., et al.

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Mots-clés

D tection du SARM sph ro de de phages analyse QCM D technique de Langmuir Blodgett anticorps PBP 2a Staphylococcus aureus r sistance aux antibiotiques capture bact rienne microscopie lectronique

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

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