Mesurer les propriétés mécaniques des cellules vivantes par microscopie à force atomique

Résumé

Cet article démontre un protocole pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes au moyen de microindentation aide d'un microscope à force atomique (AFM).

Résumé

Les propriétés mécaniques des cellules et la matrice extracellulaire (MEC) jouent un rôle important dans de nombreux processus biologiques, y compris la différenciation des cellules souches, la formation de tumeurs, et la cicatrisation des plaies. Les changements de raideur des cellules et ECM sont souvent des signes de changements dans la physiologie ou de maladies dans les tissus cellulaires. Par conséquent, la rigidité de la cellule est un indice pour évaluer l'état de cultures de cellules. Parmi la multitude de méthodes utilisées pour mesurer la rigidité des tissus et cellules, micro-indentation en utilisant un microscope à force atomique (AFM) fournit un moyen de mesurer de façon fiable la rigidité des cellules vivantes. Cette méthode a été largement appliquée pour caractériser la rigidité micro-échelle pour une variété de matériaux allant des surfaces métalliques dans les tissus et les cellules biologiques mous. Le principe de base de cette méthode est de mettre en retrait une cellule avec une pointe AFM de la géométrie sélectionnée et mesurer la force appliquée à partir de la flexion du cantilever AFM. Montage de la courbe force-indentation sur le mode Hertzl pour la géométrie de la pointe correspondante peut donner des mesures quantitatives de la rigidité du matériau. Cet article démontre la procédure pour caractériser la rigidité des cellules vivantes à l'aide de l'AFM. Les étapes clés, y compris le processus de calibration AFM, l'acquisition de force courbe, et l'analyse de données en utilisant une routine MATLAB sont démontrés. Les limites de cette méthode sont également discutés.

Introduction

Propriétés mécaniques, notamment la raideur, des cellules individuelles et leurs matrices extracellulaires environnantes (ECM) sont essentielles pour de nombreux processus biologiques, y compris la croissance cellulaire, la motilité, la division, la différenciation et l'homéostasie tissulaire. ¹ Il a été démontré que les cellules rigidité mécanique est principalement déterminée par le cytosquelette, en particulier les réseaux de filaments d'actine et intermédiaires et d'autres protéines associées. ² Les résultats des essais mécaniques sur des réseaux in vitro des filaments d'actine et intermédiaires suggèrent que les mécanismes cellulaires est largement dépendante de la structure du cytosquelette et la précontrainte dans le cytosquelette. ^3-5 Rigidité de cellules vivantes est alors considéré comme un indice pour évaluer la structure du cytosquelette ^6, l'activité myosine ⁷ et de nombreux autres processus cellulaires. Plus important encore, les changements dans les propriétés mécaniques cellulaires sont également souvent considérés comme étroitement associésATED avec diverses maladies telles que la formation de tumeurs et des métastases ^8-10 Contrôle de la rigidité mécanique des cellules vivantes peut donc fournir un nouveau moyen de contrôler la physiologie cellulaire;. pour détecter et diagnostiquer les maladies ^8;. et d'évaluer l'efficacité des traitements médicamenteux ^{11 , 12}

Plusieurs méthodes, y compris microrheologie de traces de particules, ^13-16 cytométrie de torsion magnétique, ¹⁷ micropipette aspiration ^18,19 et microindentation ^20-22 ont été développés pour mesurer l'élasticité des cellules. microrheologie de suivi des particules retrace les vibrations thermiques soit des particules fluorescentes submicroniques injectés dans des cellules ou des marqueurs fiduciaires à l'intérieur du cytosquelette de la cellule. ²³ propriétés élastiques et visqueuses de cellules sont calculés à partir des déplacements des particules mesurées en utilisant le théorème de fluctuation-dissipation. ^14,23 Cette méthode permet mesures simultanées de locauxpropriétés mécaniques à haute résolution spatiale à différents endroits dans une cellule. Cependant, l'injection de particules fluorescentes dans les cellules peut entraîner des changements dans la fonction cellulaire, la structure du cytosquelette, et donc les mécaniciens cellulaires. Procédé d'aspiration par micropipette applique une pression négative dans la micropipette de diamètre allant de 1 à 5 um d'aspirer un petit morceau de membrane de la cellule dans la pipette. la rigidité de la cellule est calculée à partir de la pression négative appliquée et de la déformation de la membrane cellulaire. ¹⁸ Cette méthode, cependant, ne peut pas détecter la distribution hétérogène de la rigidité à travers la cellule. La cytométrie en torsion magnétique (MTC) s'applique champ magnétique pour générer un couple sur des billes paramagnétiques super-attachés à la membrane cellulaire. ¹⁷ raideur cellulaire est dérivée de cette méthode à partir de la relation entre le couple appliqué et de la déformation de torsion de la membrane cellulaire. Il est difficile de contrôler l'emplacement des billes magnétiques dans la méthode MTC, et il est également challenging pour caractériser la déformation en torsion avec une grande résolution. Microindentation applique une indentation avec une géométrie bien définie de punch dans la cellule. La force de pénétration et le retrait résultant dans des cellules suivent souvent la prédiction du modèle Hertz. Des modules de Young de cellules peut être calculée à partir des courbes force-indentation en les équipant le modèle Hertz. Cette méthode a été largement appliquée pour tester les propriétés mécaniques des tissus et des cellules en dépit de ses limitations telles que l'incertitude dans la détermination du point de contact, l'applicabilité du modèle Hertz, et le potentiel d'endommager physiquement les cellules. Parmi les nombreux dispositifs pour microindentaion ^20, le microscope à force atomique (AFM) est disponible dans le commerce et a été largement appliquée pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules et des tissus vivants ^21,24-27.

Cet article démontre la procédure d'utilisation d'un asile MFP3D-Bio AFM pour caractériser les mécanismes cellulaires. AFM pas surment fournit une topographie à haute résolution de cellules, mais aussi a été largement appliquée pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules des tissus. Le principe de l'AFM indentation est illustrée à la figure 1. Le cantilever AFM se rapproche de la cellule à partir de quelques micromètres ci-dessus; entre en contact avec la cellule; tirets la cellule de sorte que la déviation en porte à faux atteigne une valeur de consigne présélectionnée, et se détache de la cellule. Au cours de ce processus, la déviation du cantilever est enregistrée en fonction de sa position comme indiqué sur la figure 1. Avant de prendre contact avec la cellule, la console se déplace dans le milieu sans aucune déviation apparente. Lorsque l'indentation sur la cellule, les coudes en porte à faux et le signal déviation augmente. Les leviers sont modélisés comme des poutres élastiques de telle sorte que leur déviation est proportionnelle à la force appliquée à la cellule. En réglant la déformation maximale en porte à faux, l'amplitude maximale de la force appliquée à l'échantillon est limitée pour éviter dAmage aux cellules. La portion de la courbe de force du point B au point C de la figure 1, où les tirets de pointe dans la cellule, n'est pas propre au modèle hertz pour extraire la rigidité de la cellule.

Figure 1. Illustration de l'AFM microindentation et l'interprétation de la courbe de force. Le panneau supérieur montre le mouvement de l'AFM cantilever entraîné par le scanner piezo. La position verticale Z du cantilever et la déviation en porte à faux signal D est enregistrée au cours du processus. Le porte à faux commence à partir du point A, de quelques microns au dessus de la cellule. En se rapprochant de la cellule, l'échantillon indentation δ reste nulle jusqu'à ce qu'il atteigne le point B, où la pointe est en contact avec la cellule. Les coordonnées du point B dans le complot sont des valeurs critiquespour l'analyse de données, notée (z _0, n _0>). De B ​​à C, les tirets en porte à faux dans la cellule jusqu'à ce que la déflection du cantilever atteint un point de consigne, qui est défini comme le rapport entre la force de pénétration maximale ciblée et la constante de ressort cantilever. Une fois le signal de déviation atteint la valeur maximale prédéterminée, le cantilever est alors retiré de la cellule à un point d, où elle souvent être tiré vers le bas en raison de pointe-échantillon adhésion, se détache de la cellule et revient à sa position initiale à e. Le panneau de droite illustre la relation entre le retrait et le z enregistrée et le signal d. Dans la partie inférieure gauche est un tracé d'une courbe représentative de la force, l'indentation maximum d'un porte à faux, dont la constante de ressort est mesurée comme étant de 0.07N / m, est réglé pour être 17 nm de telle sorte que la force maximale indentation appliquée à l'échantillon est de 1,2 nn. Les endroits clés au cours de l'indentation sont marquées.

Protocole

1. Calibrer la constante de ressort cantilever

1. Chargez le cantilever dans le AFM conformément aux instructions du fabricant. Il est nécessaire de nettoyer le support en porte à faux avec de l'éthanol avant toute expérimentation. Cela permettra de limiter la contamination bactérienne de la culture au cours des mesures AFM.
2. Calibrer InvOLS (Inverse Sensibilité de levier optique). Ce paramètre décrit la quantité de réponse de la photodiode (Volts) par nanomètre de déflection du cantilever.
3. Charger une lame de verre propre sur la scène de l'échantillon, puis installez la tête AFM et régler le faisceau laser et l'alignement conformément aux instructions du fabricant. Engager la pointe de l'AFM sur la lame de verre.
4. Avec l'élément piézo retirée, réaligner le miroir à une lecture de la photodiode de -2 V. effectuer une mesure de spectroscopie de force avec un seuil de déclenchement (réponse maximale de photodiodes) de 2 V.
5. Avec le piezo retirée, réaligner le miroir à une lecture de la photodiode de -2 V. Effectuez une force mesure spectroscopie avec un seuil de déclenchement (maximum de réponse de la photodiode) de +2 V. Remarque: Les valeurs de tension ici sont spécifiques à l'asile AFM. Cette valeur doit être définie selon les spécifications fournies par le fabricant.
   Après l'acquisition des données est terminée, un zoom sur la région firme contact de la courbe de force. Effectuez un ajustement linéaire dans cette région pour trouver la pente, qui sera en V / nm. La réciproque de cette valeur décrit la sensibilité optique de l'ensemble cantilever-photodiode.
6. Rétablir l'alignement du miroir à une déviation libre de 0 V.
7. Calibrer la constante de ressort en porte à faux. Procédé thermique air est utilisé pour déterminer la constante de ressort en porte à faux ^28.
8. Après avoir calibré le InvOLS, élever le scanner loin de la scène de l'échantillon tel qu'il n'y a pas d'interactions entre la pointe et l'échantillon.
9. Commencez la capture des données thermiques. Au cours de ce processus, la vibration thermique de la poutre en porte à faux est Recorded. Le logiciel AFM analyse un spectre de puissance d'une telle vibration thermique et parcelles dans une fenêtre de données.
10. Après quelques secondes d'acquisition de données, effectuer un ajustement pour le segment de données centrée sur le bas-fréquence (résonance fondamentale) de pointe pour déterminer la constante de rappel.

2. Chargement de l'échantillon

1. Installez l'accessoire de chauffe-plat sur la scène AFM, si ce n'est pas déjà équipé.
2. Réglez la température à 37 ° C, et d'attendre 20 min pour que le système atteigne un équilibre thermique stable.
3. Placez la boîte de culture sur la scène AFM et le fixer à l'aide de la pince fournie avec le chauffe-plat. Il est important de réduire au minimum le délai entre le retrait de l'antenne de l'incubateur et le placer sur la scène, afin d'éviter un traumatisme pour les cellules. Pour des mesures de plus de 30 min, média indépendant CO ₂ devrait être utilisé pour remplacer le milieu de culture normal.
4. Appliquez une petite goutte de 37 ° C le milieu de culture à la pointe du til AFM cantilever, et baisser la tête AFM jusqu'à ce que la pointe est juste immergé dans un liquide.
5. Utilisation du haut-vue de la caméra CCD, réaligner le faisceau laser sur le cantilever (l'alignement dans un liquide sera différente de celle de l'air, à cause de la variation de l'indice de réfraction du milieu).
6. Engager la pointe de l'AFM sur une zone propre de la boîte de culture.
7. Effectuer le calibrage des InvOLS tel que décrit ci-dessus, pour la sensibilité en porte à faux dans le milieu liquide.

Remarque: a) Lorsque les cellules sont mises en culture sur des hydrogels, l'étalonnage de InvOLS doivent être effectués à l'avance sur la surface de fond d'une boîte de culture remplie de milieu de culture de cellules. Lors du passage à des échantillons de cellules, une attention particulière doit être portée à ne pas modifier l'alignement du faisceau laser avec la console. b) InvOLS doit être recalibré à chaque fois qu'il ya un changement dans l'alignement laser. c) Il est également recommandé de prendre InvOLS que la moyenne de la valeur à partir de plusieurs courbes d'étalonnage, sepuis chaque calibrage génère un autre InvOLS. La variation de InvOLS est, cependant, comparé à la valeur moyenne de petite taille. Par exemple, l'étalonnage d'un Bruker DNP-10 en porte à faux avec une constante de 0,06 N / m en liquide de 100 fois au printemps produire une valeur de InvOLS moyenne de 66,3 nm / V, avec un écart type de seulement 0,5 nm / V.

3. Collecte courbes de force d'indentation Cell

1. Sélectionnez une cellule pour l'indentation. A l'aide d'un microscope optique, déplacer la platine pour positionner le porte à faux au-dessus de la cellule de telle sorte que la pointe se situe dans la région péri-noyaux. Le réglage précis de la position en porte à faux peut être réalisée en appliquant des compensations à l'X et Y scanners.
   Remarque: Le cantilever AFM doit être retirée de la surface de l'échantillon tout en déplaçant la platine porte-échantillon pour sélectionner une cellule cible. Cela protège le cantilever de frapper dans l'échantillon, puisque la surface de l'échantillon ne peut être plat.
2. Commute en mode de spectroscopie. Réglez l'indentationtaux dans la plage de 1 à 10 um / sec, assez faible pour éviter des effets hydrodynamiques.
3. Réglez le point de déclenchement de déviation, ce qui limite l'effort maximal en retrait pour éviter d'endommager les cellules. Sélectionner l'option de déclenchement relative, ce qui permettra de corriger toute dérive dans le signal de déviation. A force maximale de 2 nn est un bon point de départ pour la plupart des échantillons. Cette valeur doit cependant être ajustée en fonction de la rigidité de l'échantillon. Pour les échantillons mous une valeur inférieure devrait être utilisé pour éviter indentation excessive de l'échantillon. Pour les échantillons raides une grande valeur doit être utilisée pour générer indentation mesurable.
4. De régler la distance de la force suffisamment grande pour que la pointe sera complètement détachée de la cellule entre la mesure de force. Habituellement, la distance de la force est fixé à 5 um.
5. Commander l'AFM de prendre une courbe de force unique.
6. Recueillir au moins trois courbes de force à différents endroits dans la région péri-noyaux de chaque cellule. Bien qu'il soit avantageux de prendre multiplecourbes sur chaque cellule de données statistiques fiables, en prenant trop de courbes de force peuvent conduire à des changements dans la rigidité de la cellule due au stress de la sonde AFM.
7. Lorsque la collecte des données est terminée, retirer la pointe, et répétez les étapes 3.1-3.6 pour autant de cellules que nécessaire pour de bonnes données statistiques sur la rigidité de la cellule sous une certaine condition de l'échantillon. Habituellement, les 30 cellules sont mesurées pour chaque condition.

Pour caractériser la répartition de rigidité dans une cellule unique, le mode de la carte de force est appliquée. Dans le mode Force-carte, définissez une taille de numérisation afin d'inclure la région d'intérêt; définir une résolution appropriée; définir les paramètres d'indentation que ceux choisis pour les courbes de force mono; l'AFM sera alors raster dans la zone de l'échantillon défini et de prendre des courbes de force mono au niveau de chaque pixel dans la région de l'échantillon.

4. Analyse des données

Les courbes de force enregistrées sont analysées à l'aide d'une procédure MATLAB coutume de calculer la rigidité de la cellule. Ce qui suit est une brève description de la procédure MATLAB:

1. Le programme MATLAB identifie le point de contact coordonne z0 et d0 (voir la figure 1) en utilisant un algorithme adopté d'une méthode publiée par Lin et al ^29.:
2. Pour chaque point de données dans la courbe de force, effectuer un ajustement linéaire des données vers la gauche du point d'intérêt, et un modèle Hertz correspond à la droite (à l'aide du point sélectionné en tant que premier point de contact), jusqu'à l'ensemble indentation maximale (200-300 nm recommandé).
3. Pour chaque point, calculer l'erreur RMS relative des deux crises et additionner ces valeurs.
4. Le point qui atteint l'erreur de montage totale minimum est sélectionné comme premier point de contact.
   Note: Le temps de calcul peut être réduit par la mise en œuvre d'une recherche-section d'or plutôt que linéaire balayage de la courbe de force entière.
5. Exemple de déformation δ et l'indentation force F sont calculés comme suit:
   
6. Ferrure des moindres carrés est appliqué pour s'adapter à la F c données δ dans la région après le contact, z ≥ z _0, le modèle Hertz pour extraire le module d'Young, E de la cellule:
   
   , Où v est le coefficient de Poisson.
   Remarque: lorsque δ est supérieur à 10% de l'épaisseur de l'échantillon (hauteur de la cellule), la rigidité de la cellule de mesure est influencée par la rigidité du substrat. L'épaisseur de la région péri-nucléaire est habituellement de l'ordre de quelques micromètres. Par conséquent, seuls les premiers 200-300 nm de courbe δ F est apte au modèle Hertz.

Résultats

Figure 2a montre trois courbes de force représentatifs prélevés à partir de fibroblastes 3T3 cultivées sur une surface en plastique, gel de polyacrylamide des modules 3000 Pa de Young et 17.000 Pa, respectivement. Après identifiant soigneusement les points de contact dans les courbes, la force de pénétration en fonction de la déformation de la cellule est représentée sur la figure 2b. Sous une force de magnitude inférieure à 0,3 nN, une pyramide pleine forme, alinéas 3 micromètres dans ...

Discussion

La méthode d'indentation AFM a des avantages pour caractériser les propriétés mécaniques des cellules vivantes. Quoique moins sensible que la cytométrie de torsion magnétique et pinces optiques, qui peuvent mesurer des forces sur le plan piconewton ^32, l'AFM permet de détecter la force de résistance à partir d'échantillons allant de quelques dizaines de pico-Newton à des centaines de nano-Newton, comparables à aller de force peut être appliqué à des cellules à l'aide d'une micropipette

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope à force atomique	Asylum Research	MFP3D-BIO