Article de méthode

Visualisation de développement cranio-facial dans les SOX10: Kaede poisson zèbre transgénique ligne à l'aide Time-lapse de microscopie confocale

DOI :

10.3791/50525

⸱

30 septembre 2013

 ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital

Dans cet article

Résumé

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Visualisation des données expérimentales est devenu un élément clé dans la présentation des résultats à la communauté scientifique. Génération de direct enregistrement time-lapse d'embryons croissance contribue à une meilleure présentation et la compréhension des processus de développement complexes. Ce protocole est un guide pour le marquage des cellules par l'intermédiaire de photoconversion de la protéine chez le poisson zèbre kaede étape par étape.

Résumé

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Vertébré palatogenesis est un processus de développement très chorégraphiée et complexe, qui implique la migration de la crête neurale crânienne (CNC) des cellules, la convergence et l'extension des protubérances du visage, et la maturation du squelette cranio-facial. Pour étudier la contribution de la crête neurale crânienne à des régions spécifiques du palais de poisson zèbre un de SOX10: Kaede ligne de poisson zèbre transgénique a été généré. Sox10 fournit restriction de la lignée de la protéine Kaede rapporteur de la crête neurale, ce qui rend la cellule étiquetage d'un processus plus précis que colorant traditionnel ou injection d'ARNm rapporteur. Kaede est une protéine de photo-convertible qui passe du vert au rouge après l'activation de photo et permet de suivre précisément les cellules. Les SOX10: Kaede ligne transgénique a été utilisé pour effectuer une analyse de la lignée de délimiter les populations de cellules CNC qui donnent lieu à maxillaire par rapport à des éléments mandibulaires et illustrent homologie des protubérances du visage pour amniotes. Ce protocole décrit l'étape consistant às pour générer une vidéo en time-lapse en direct d'un SOX10: embryon de poisson zèbre Kaede. Développement de la plaque ethmoïde servira un exemple pratique. Ce protocole peut être appliqué à la réalisation d'un time-lapse enregistrement confocale de toute Kaede ou protéine rapporteur photoconvertible similaire chez le poisson zèbre transgénique. En outre, il peut être utilisé pour capturer non seulement normal, mais aussi anormale développement des structures craniofaciales dans les mutants de poisson zèbre.

Introduction

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Les fentes faciales représentent la déformation craniofaciale la plus répandue, avec 1/700-1, 000 livraisons affectées 1. Perturbation du développement cranio-facial embryonnaire précoce peut conduire à la formation de fente labio-palatine (FL / P). Bien que les causes de fissure syndromique ont été largement représenté, les bases génétiques et épigénétiques de formes non syndromiques de clefting buccofaciale doivent encore être mis au jour 2-4. Afin de comprendre l'étiologie et la pathogenèse de ces malformations, il est nécessaire d'élucider le développement des structures craniofaciales sur une base cellulaire.

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Protocole

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Une. Collection d'embryons pour Photoconversion

  1. Mettre en place au moins dix paires de SOX10: poisson zèbre transgénique Kaede entre 5 et 18 heures dans la soirée.
  2. Le lendemain matin, tirez diviseurs et ramasser les œufs vers midi. Les transférer à des boîtes de Pétri et les mettre dans 28,5 ° C incubateur.
  3. Aux environs de 24 heures après la fécondation, nettoyer les boîtes de Pétri en supprimant des embryons morts. Vérifiez le stade de développement des embryons 13 en utilisant la microscopie champ de lumière et tout microscope à fluorescence avec la protéine fluorescente verte (EGFP) de filtre. Kaede sera visible à trav....

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Résultats

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Dans le SOX10: CNCCs Kaede lignée transgénique, migratoires et post migratoires sont marqués par fluorescence verte. Les cellules marquées par la CNCC vert fluorescent Kaede récapitulent endogène expression de l'ARNm SOX10 5.

Parmi d'autres applications, ce modèle animal a été utilisé pour mieux visualiser le développement de structures cranio-faciales charge CNCC. Le développement normal des structures spécifiques et aussi le développement pathologique des malformations cranio-fa.......

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Discussion

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Voici une nouvelle méthode pour la visualisation de développement cranio-facial dans le modèle de poisson zèbre est affiché. Les SOX10: Kaede ligne de poisson zèbre transgénique a été utilisé avec succès pour décrire le modèle migratoire de la CNCC en détail est utilisé comme organisme modèle 5.

Des études antérieures ont utilisé des repères bruts tels que l'œil aux cellules cibles et se sont appuyés sur l'injection Kaede de l'ARNm, des essais de photoconversion ou cag.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

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Les auteurs remercient Robert Kelsh pour avoir bien voulu partager le poisson zèbre réactif promoteur SOX10.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sox10 :kaede ligne de poisson-zèbre transgénique MGHDisponible via le laboratoire Liao
Boîtes de Pétri 100x15 mmBD Falcon351029
Boîtes de Pétri 35 mm x10 mmBD Falcon351008
Ultrapure à faible point de fusion (LMP) AgaroseInvitrogen15517022
Lab Tek 2 chambres SlideSystem LabTek154453
Microchargeurs 200/pqtFisherE5242956003
Nikon A1R Si Confocal série TiNikonNon Numéro
de catalogue NIS Elements Software AR3.2 64-bitNikonNon Numéro
de catalogue

Références

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  1. Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC). Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).
  2. Dixon, M. J., et al.

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Mots-clés

Craniofacial DevelopmentNeural Crest MigrationTime lapse Confocal MicroscopySox10 Kaede TransgenicPhotoactivation ProtocolZebrafish Embryo ImagingCranial Neural CrestEthmoid Plate DevelopmentPrimary Palate FormationOrofacial Cleft Analysis

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