Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d&#39;enquêter sur l&#39;angiogenèse<em&gt; In vivo</em

Résumé

La rétine murin néonatal fournit un modèle physiologique bien caractérisé de l'angiogenèse, qui permet à des enquêtes sur les rôles des différents gènes ou des médicaments qui modulent l'angiogenèse dans un In vivo Contexte. Immunofluorescence de visualiser avec précision le plexus vasculaire est essentielle à la réussite de ce type d'études.

Résumé

L'angiogenèse est le processus complexe de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins défini par la germination de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau de vaisseaux préexistants. L'angiogenèse joue un rôle essentiel non seulement dans le développement normal des organes et des tissus, mais aussi dans de nombreuses maladies dans lesquelles la formation de vaisseaux sanguins est déréglée, comme le cancer, la cécité et les maladies ischémiques. Dans la vie adulte, les vaisseaux sanguins sont généralement repos si l'angiogenèse est une cible importante pour le développement de médicaments nouveaux pour essayer de réguler la formation de nouveaux vaisseaux spécifiquement dans la maladie. Afin de mieux comprendre l'angiogenèse et d'élaborer des stratégies appropriées pour réglementer cela, les modèles sont nécessaires, qui reflètent avec précision les différentes étapes biologiques qui sont impliqués. La rétine de la souris néonatale constitue un excellent modèle de l'angiogenèse, car les artères, les veines et les capillaires se développent pour former un plexus vasculaire au cours de la première semaine après la naissance. Ce modèle a également l'avantage d'avoir un deux-didimensionnelle (2D) la structure qui rend l'analyse directe par rapport à l'anatomie 3D complexe d'autres réseaux vasculaires. En analysant le plexus vasculaire rétinienne à différents moments après la naissance, il est possible d'observer les différentes étapes de l'angiogenèse sous le microscope. Cet article montre une procédure simple pour analyser la vascularisation de la rétine de la souris en utilisant une coloration fluorescente avec des anticorps spécifiques isolectine et vasculaire.

Introduction

L'angiogenèse est un processus complexe du développement définie par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau de vaisseaux préexistants et est réglementé par plusieurs voies de signalisation. Le plus important d'entre eux est la voie du VEGF. VEGF est libéré par les cellules ischémiques et conduit à l'initiation de la germination angiogénique dans les vaisseaux sanguins avoisinants. Les cellules endothéliales de premier plan à partir d'une nouvelle pousse vasculaire est une cellule «pointe», qui produit filopodes qui atteignent en direction de la source de VEGF, et est suivie par des cellules endothéliales proliférantes "tige". De cette façon, les cellules endothéliales activées migrent et prolifèrent vers une région avasculaire où ils forment de nouveaux tubes vasculaires. Afin de stabiliser ces tubes pour soutenir la circulation sanguine, les cellules endothéliales interagissent avec les péricytes et les cellules musculaires lisses qui entourent les nouveaux vaisseaux sanguins ^1. L'angiogenèse est essentielle pour la vascularisation de l'embryon et des tissus en croissance. Cependant, il contribue également à de nombreux pathologiqueques troubles tels que le cancer, tandis que les défauts de l'angiogenèse sont associés à des maladies ischémiques. Le développement de traitements médicamenteux efficaces pour réguler l'angiogenèse comme un moyen de traiter la maladie est donc d'un grand intérêt. Par exemple, les facteurs anti-angiogéniques efficaces réduiront la croissance du cancer, tandis que les stratégies pro-angiogéniques peuvent être utilisés pour traiter la maladie ischémique. Ainsi, les modèles d'angiogenèse sont essentielles pour mieux comprendre la régulation de la formation de nouveaux vaisseaux et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer ou diminuer la croissance vasculaire.

Un élément fondamental de la recherche sur l'angiogenèse est le choix d'un modèle vasculaire approprié. Plusieurs modèles in vitro ont été conçus pour reproduire les étapes de base de l'angiogenèse tels que la migration cellulaire endothéliale, la prolifération et la survie ^2,3. Un fréquemment utilisé dans l'essai in vitro est la formation d'un réseau ramifié de cellules endothéliales sur une matrice de Matrigel, même si tson n'est pas spécifique des cellules endothéliales, ni intègrent généralement le soutien de péricytes ou des cellules musculaires lisses. L'évaluation de l'angiogenèse germination ex vivo à l'aide de cultures d'organes de souris telles que le dosage de corps embryoïdes, le dosage de l'anneau aortique et le dosage du métatarse foetal permet l'analyse de l'angiogenèse des cellules endothéliales dans le cadre de cellules de soutien supplémentaires. Cependant, les principales limites de ces essais comprennent le manque de flux sanguin et la régression des navires de plus de temps, ce qui donne une fenêtre limitée pour l'analyse. Par conséquent, pour comprendre la régulation de l'angiogenèse avec plus de précision, dans des modèles in vivo sont nécessaires tels que ceux développés chez la souris en utilisant des éponges sous-cutanée implantés ou des bouchons matrigel, ainsi que le modèle d'ischémie des membres postérieurs. Cependant, ces modèles sont difficiles à analyser en raison de l'architecture 3D complexe du néovaisseaux. En revanche, l'embryon de poisson zèbre s'est avéré un excellent modèle pour l'angiogenèse visualiser dans l'ensembleorganisme ^4. Toutefois, la souris est évolutif beaucoup plus étroitement lié à l'homme que le poisson-zèbre, rendant le modèle préféré dans de nombreux cas la souris. Par conséquent angiogenèse de la rétine postnatal de la souris représente une méthode bien caractérisé de choix pour la recherche sur l'angiogenèse. Il fournit non seulement un paramètre physiologique, mais aussi un plexus vasculaire 2D qui peuvent être facilement visualisées en utilisant des colorants fluorescents appropriés. L'architecture du réseau de vaisseaux, de la prolifération endothéliale, la germination, le recrutement des cellules périvasculaires et le remodelage vasculaire peuvent tous être étudiée en utilisant cette technique.

Dans la rétine néonatale de la souris, le développement des vaisseaux sanguins de la rétine se produit dans la première semaine de vie postnatale. Souris, contrairement aux humains, naissent aveugles et les rétines ne deviennent vascularisée après la naissance. Vaisseaux rétiniens surgissent du centre de la fermeture de la rétine au nerf optique à jour postnatal 0 (P0), et se développent par l'angiogenèse pour former un très organisentd plexus vasculaire qui atteint la périphérie de la rétine d'environ ⁵ P8. Les vaisseaux sanguins se développent d'une manière caractéristique avec le plexus capillaire croissant progressivement vers l'extérieur du disque optique vers la périphérie pour générer un modèle alternatif régulier des artères et des veines avec un réseau capillaire d'intervenir. La vascularisation rétinienne est un modèle idéal pour étudier l'angiogenèse que les navires peuvent être facilement identifiés à mesure qu'ils grandissent dans ce qui est essentiellement un plan 2D, ce qui rend relativement facile d'examiner la vascularisation rétinienne dans les préparations plate-montage ^5. Procédé pour isoler la rétine néonatale de la souris pour l'analyse des réponses des cellules endothéliales de bout de plusieurs heures ex vivo a été rapporté ^6. Sinon, un examen plus détaillé de l'ensemble du système vasculaire rétinienne et des marqueurs vasculaires associées nécessite immunologique des spécimens de la rétine fixes à différents stades de développement.

Ici, nous fournissonsune description détaillée d'une méthode fiable et techniquement simple que nous utilisons pour toute coloration de montage de la murine rétinienne plexus vasculaire, de l'énucléation initiale de l'œil postnatal (voir aussi ⁷⁾ à travers les protocoles de coloration à l'imagerie finale sous le microscope.

Protocole

Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Énucléation et la fixation des Yeux postnatale

1. Placez la souris euthanasiés chiot de son côté, enlever la peau qui recouvre l'œil avec des ciseaux.
2. Utilisez des ciseaux et des pinces pour énucléer l'œil.
3. Placez les ciseaux sous l'œil énucléé, couper le nerf optique et des tissus environnants et soulever l'œil. Transfert à une plaque de 24 puits contenant du paraformaldéhyde 4% (PFA) constitué en 2x PBS à température ambiante.
4. Permettre à chaque œil pour fixer pendant 10 - 15 min, puis transfert à froid 2x PBS sur la glace pendant 5 - 10 min. Il est préférable d'échelonner les énucléations et la fixation subséquente à assurer le degré de fixation est égale pour chaque œil.

2. Dissection de rétines murins postnatale

1. Transfert yeux dans une boîte de Pétri contenant 2x PBS à l'aide d'une pipette Pasteur en plastique qui a été coupé pour élargir l'alésage et le placez sous une dissection du microscope.
2. Enlevez tout le gras autour de l'œil en utilisant des pinces et ciseaux.
3. Pierce au bord de la cornée avec des ciseaux pointus et coupez autour de la cornée et de l'iris et le jeter.
4. Insérez forceps entre la rétine et la sclérotique et enlever la sclérotique en prenant soin de ne pas déchirer la rétine. La couche choroïde peut également être retiré, mais si il ya un risque de dommages à la rétine survenant au cours de cette étape, la couche choroïde peut être laissé sur que cela ne devrait pas affecter de manière significative la qualité de l'immunomarquage.
5. Retirez la lentille et l'humeur vitrée aide d'une pince.
6. Retirez les vaisseaux de hyaloids en les rassemblant dans le centre de l'œil avec une pince fine, puis rapidement se détacher du centre de la rétine (alternativement snip à la base des navires hyaloid avec des ciseaux fins).
7. Rincer la rétine en forme de cuvette avec du PBS dans une boîte de Petri propre.
8. Ajouter 4 à 5 incisions radiaires atteignant environ 2/3 du rayon de la rétine à l'aide de ressort scissors pour créer une forme de «pétale».
9. Prélever de PBS à l'aide d'une pipette Pasteur pour aplatir la rétine, puis enlever l'excédent PBS avec un petit morceau de papier absorbant.
10. Lentement pipette froid (-20 ° C) baisse de méthanol à goutte sur la surface de la rétine jusqu'à totalement couvert puis inondation avec du méthanol supplémentaire. Cela aidera à fixer les rétines et facilitera la perméabilisation. Les rétines deviennent blancs.
11. Transférer dans un tube de 2 ml à l'aide d'une pipette Pasteur plastique qui a été coupée pour élargir l'alésage.
12. Laisser rétine dans le méthanol froid pendant au moins 20 min avant de procéder à immunomarquage. Parmi les anticorps utilisés ici, seulement la VE-cadhérine ne peut pas être utilisée avec succès sur des rétines fixes de méthanol. Dans ce cas rétines doivent procéder directement à immunologique après l'étape 9.
13. Si nécessaire, la rétine peut être stocké dans le méthanol à -20 ° C pendant plusieurs mois avant la coloration.

3. Immuno / coloration isolectine de la rétine Vasculature

1. Retirez délicatement / versez le méthanol et rincer doucement rétines brièvement dans du PBS (à ce stade, la rétine est toujours dans le même tube de 2 ml de l'étape 11 ci-dessus).
2. Retirer du PBS et couverture rétines avec 100 pi de solution de Perm / Block (PBS + 0,3% de Triton + 0,2% BSA) + 5% de sérum approprié (voir tableau 1) et agiter doucement pendant 1 heure.
3. Retirer Perm / Bloquer et incuber rétines en agitant doucement la nuit à 4 ° C avec 100 pi d'anticorps primaires (voir le tableau 1) et / ou IsolectinB4, tous préparés par dilution dans Perm / Block.
4. Eliminer l'anticorps / isolectine et laver rétines 4 x 10 min dans du PBS + 0,3% de Triton (PBSTx).
5. Dans certains cas, par exemple après coloration avec IsolectinB4-Alexa488 ou un anticorps primaire directement conjugué, un anticorps secondaire n'est pas obligatoire et la rétine peut être monté directement (étape 7). Quand un anticorps primaire non conjugué a été utilisé dans l'étape 3, puis 100 ml de l'fluor appropriéanticorps secondaire escent (dilué à 1/200 dans PBSTx) est ajouté et laissé à incuber pendant la nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à température ambiante.
6. Eliminer l'anticorps secondaire et laver rétines 4 x 15 min dans 2 ml PBSTx.
7. Transfert rétines sur des lames en utilisant un large trou en plastique pipette Pasteur et enlever l'excédent PBSTx avec le tissu absorbant. Mont rétines en ajoutant 50 pl de milieu de montage Prolongez sur une lamelle et la position doucement sur la rétine.
8. Transfert glisse au réfrigérateur pendant la nuit à 4 ° C, en s'assurant qu'ils sont bien à plat et à l'abri de la lumière, afin de permettre le prolonger milieu de montage pour valider.
9. rétine de l'image à l'aide d'un microscope confocal ou d'un microscope à épifluorescence.

Résultats

Après dissection de la rétine devrait ressembler à une fleur plat (Figure 1). En utilisant le protocole décrit ci-dessus, les cellules endothéliales peuvent être vus à l'aide isolectine coloration B4-Alexa488 et en soutenant les cellules musculaires vasculaires sont visualisés à l'aide anti-alpha actine musculaire lisse (Figure 2). Le point de vue de faible puissance utilisant un objectif 5X dans la figure 2 permet une vue d'ensemble de l'organisation va...

Discussion

La méthode présentée ici offre un moyen simple et efficace pour obtenir des images de préparations colorées de montage entières de rétines de souris néonatales, ce qui en fait un modèle facilement quantifiable et physiologiquement pertinents de l'angiogenèse. Initialement, l'œil de la souris peut être assez difficile à disséquer en raison de sa petite taille et la forme du globe, alors un peu de pratique et de bons outils de dissection sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Dissection des yeux prép...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material
Pipettes en plastique 3 ml	Fournitures de laboratoire scientifique	PIP4210	Retirez l’embout avec des ciseaux pour créer un large alésage
Plaques BD Falcon 24 puits	Fournitures de laboratoire scientifique	353226
Boîtes de Pétri Select TV 90 mm	Fournitures de laboratoire scientifique	SLS2002
lames Histobond	VWR	631-0624
Lamelles 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Pince à épiler #5	World precision instruments	14095
Ciseaux à ressort de 10,5 cm de long, avec lames droites de 8 mm	Instruments de précision World	501235	Utilisé pour l’énucléation
Ciseaux Vannas de 8,5 cm de long, avec lames droites de 7 mm et pointes superfines de 0,025 x 0,015 mm	World precision instruments	500086	Utilisé pour la dissection de la rétine
Ciseaux vannes superfins de 8 cm de long avec lames droites de 3 mm et pointes superfines de 0,015 x 0,015 mm	Instruments de précision World	501778	Utilisé pour la dissection de la rétine
tubes limpide’ ; 2 ml	Starlab	E1420-2000
réactifs
Phosphate de sodium dibasic	Sigma	S0876	Réactif PBS
Phosphate de potassium monobasique	Sigma	P5655	Réactif PBS
Chlorure de sodium	Sigma	S9625	Réactif PBS
Paraformaldéhyde	Sigma	P6148	Compléter en 2x PBS et stocker à -20 ° ; C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Sérum d’âne	Sigma	D9663
Sérum de chèvre	Vecteur	S-1000
Réactif anti-décoloration Prolong Gold	Invitrogen	P36930	Réactif de montage
Isolectine GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Utilisation à Dilution 1:200
Isolectine GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Utilisation à dilution 1:200
Anticorps primairesAnti-NG2 (lapin polyclonal)Millipore AB5320 Détecte les péricytes Anti-GFAP (clone GA5, souris monoclonale)Millipore MAB360 Détecte les astrocytes Anti-Desmin (clone Y66,
monoclonal de lapin)	Millipore	04-585	Détecte les péricytes
Anti-Collagène IV (polyclonal de lapin	Chemicon	AB756P	Détecte la membrane basale vasculaire
Anti-alpha muscle lisse actine-Cy3 (clone 1A4, souris monoclonale)	Sigma	C6198	Détecte les cellules musculaires lisses vasculaires.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550546	Détecte les cellules endothéliales
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)	BD Pharmingen	553370	Détecte les cellules endothéliales
Anti-VE-Cadhérine (clone 11D4.1, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550548	Détecte les jonctions cellulaires endothéliales
Anti-Alk1 (chèvre polyclonale)	R& D Systems	AF770	Détecte les cellules
Anticorps secondaires
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	Tous les anticorps secondaires sont aliquotes immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Chèvre anti-rat-Alexa488	Invitrogen	A11006	Tous les anticorps secondaires sont aliquote immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Chèvre anti-rat-Alexa594	Invitrogen	A11007	Tous les anticorps secondaires sont aliquotes immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Chèvre anti-souris-Alexa488	Invitrogen	A11029	Tous les anticorps secondaires sont aliquotes immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Âne anti-chèvre-Alexa594	Invitrogen	A11058	Tous les anticorps secondaires sont aliquotes immédiatement à l’arrivée et stockés à -20 ° ;C.
Microscopes
Microscope de dissection	Caméra Zeiss	Stemi SV6
Caméra	Zeiss	Axiocam HRc	pour microscope de dissection
Microscope épifluorescent	Zeiss	Axioimager avec caméra Apotome
Caméra	Zeiss	Axiocam HRm	Axioimager
	Nikon	A1R

) endothéliales pour microscope confocal