Article de méthode

Une plate-forme automatisée polyvalent pour micro-échelle expériences de stimulation cellulaire

DOI :

10.3791/50597

⸱

6 août 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons développé une culture de cellules automatisé et plate-forme d'interrogation pour les expériences de stimulation cellulaire micro-échelle. La plate-forme offre un contrôle simple, polyvalent et précis dans la culture et la stimulation de petites populations de cellules, et la récupération de lysats pour les analyses moléculaires. La plate-forme est bien adapté aux études qui utilisent des cellules précieux et / ou des réactifs.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Étude des cellules en culture (analyse in vitro) a fourni des informations importantes sur les systèmes biologiques complexes. Méthodes et équipements conventionnels pour analyse in vitro sont bien adaptés à l'étude d'un grand nombre de cellules (≥ 10 5) des volumes millilitre échelle (≥ 0,1 ml). Cependant, il ya de nombreux cas dans lesquels il est nécessaire ou souhaitable de réduire la taille de la culture pour réduire la consommation des cellules d'intérêt et / ou de réactifs nécessaires à leur culture, stimulation, ou de transformation. Malheureusement, les approches conventionnelles ne supportent pas une manipulation précise et reproductible des cultures de micro-échelle, et les systèmes automatisés microfluidique à base actuellement disponibles sont trop complexes et spécialisés pour une utilisation de routine par la plupart des laboratoires. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une plate-forme technologique simple et polyvalent pour la culture automatisé, la stimulation et la récupération de petites populations de cellules (100 - 2.000 cellules) en volume à micro-échelles (1 - 20 pi). La plate-forme se compose d'un ensemble de microcapillaires revêtues de fibronectine («chambres de perfusion de cellules"), dans lequel les cultures de micro-échelle sont établis, maintenus et encouragés; un appareil numérique microfluidique (DMF) équipé de «transfert» microcapillaires ("hub central "), dont les cellules itinéraires et des réactifs vers et à partir des chambres de perfusion; une pompe à seringue à haute précision, qui transportent des puissances de matériaux entre les chambres de perfusion et le moyeu central, et une interface électronique qui permet de contrôler le transport de matières, ce qui est coordonné et automatisé via des scripts préétablis. À titre d'exemple, nous avons utilisé la plate-forme pour faciliter l'étude des réactions suscitées transcription dans les cellules immunitaires lors de défi avec des bactéries. L'utilisation de la plate-forme nous a permis de réduire la consommation de cellules et de réactifs, de minimiser la variabilité expérience à l'expérience, et de réorienter les mains sur le travail. Compte tenu des avantages qu'il confère, ainsi que son accessibilité et sa polyvalence, our plate-forme doit trouver une utilisation dans une grande variété de laboratoires et d'applications, et se révéler particulièrement utile pour faciliter l'analyse des cellules et des stimuli qui sont disponibles en quantités limitées.

Introduction

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L'étude des cellules maintenues en culture (analyse in vitro) a fourni de précieuses informations sur les principes fondamentaux et les mécanismes moléculaires qui régissent les systèmes biologiques complexes et la santé humaine. Les méthodes conventionnelles de culture, la stimulation et la collecte de cellules d'analyse, qui utilisent des boîtes de Pétri et les plaques de microtitration, ont été conçus pour l'étude de grandes populations de cellules (≥ 10 5) dans des volumes de culture millilitre échelle (≥ 0,1 ml). Cependant, il existe de nombreux cas où des quantités limitées de cellules sont disponibles (par exemple des cellules primaires), ou de petites populations de cellules sont souhaitables (par exemple pour réduire la variabilité de cellule à cellule dans la population), ou réactifs nécessaires sont difficiles à obtenir ou trop coûteux (par exemple les facteurs cellulaires sécrétées purifiées). Ces problèmes peuvent être résolus avec succès par révision à la baisse la taille de la culture, qui a l'avantage supplémentaire de réduire la consommation de tous lesréactifs nécessaires à l'analyse 1,2 vitro. Malheureusement, le matériel et les méthodes conventionnelles ne supportent pas une manipulation précise et reproductible des cultures de micro-échelle et les systèmes automatisés microfluidique à base actuellement disponibles 3-11 sont trop complexes et spécialisés pour une utilisation de routine par la plupart des laboratoires.

Dans ce rapport, nous décrivons l'assemblage et l'utilisation d'une plate-forme technologique simple et polyvalent pour la culture automatisé, la stimulation et la récupération de petites populations de cellules (100 - 2.000 cellules) dans des volumes micro-échelle (1 - 20 pi). L'architecture de la plate-forme (figure 1) est de conception modulaire: un ensemble de fibronectine revêtu microcapillaires («chambres de perfusion de cellules" du module) sert de site pour l'établissement, l'entretien et la stimulation des cultures de micro-échelle et une microfluidique numérique (DMF ) 12,13 appareil équipé de "transfert" microcapillaires (module "central hub") 14,15 Cellules itinéraireset des réactifs vers et à partir des chambres de perfusion. DMF permet à l'utilisateur de régler individuellement plusieurs gouttelettes simultanément et modifier ou réorganiser les manipulations (c. trains de traitement des échantillons de reconfigurer) sans altérer le matériel de l'appareil. Sa grande flexibilité est évidente dans sa récente apparition comme une technologie clé dans un large éventail d'applications, y compris la culture de cellules 16,17, 18,19 dosages enzymatiques, immunologiques 20,21, 22,23 analyse de l'ADN, la transformation des protéines, 24,25 et le traitement des échantillons cliniques. 26,27 Notre hub central tire parti de la flexibilité inhérente aux dispositifs DMF, et améliore encore ce grâce à l'ajout d'interfaces microcapillaires, qui offre la possibilité de réaliser un sous-ensemble de manipulations (par exemple, la culture de cellules) dans les zones périphériques spécialisés modules, plutôt que sur l'appareil lui-même DMF. Cloisonnement des trains de traitement de cette manière simplifie également la conception de l'APLtform architecture (pas besoin de construire un dispositif de DMF qui peut effectuer toutes les étapes de transformation) et facilite son évolution en tant que de nouvelles fonctions sont nécessaires (il suffit d'intégrer de nouveaux modules périphériques que nécessaire). Transport des cellules et des réactifs à l'intérieur du moyeu central est entraîné par électromouillage forces engendrées par l'activation séquentielle des électrodes à l'intérieur du dispositif DMF 13,28, le transport à destination, et à l'intérieur des chambres de perfusion est effectuée par des changements de pression générés par une seringue à haute précision pompe. Tous ces mouvements fluides sont contrôlés via une interface électronique simple et automatisée grâce à l'utilisation de scripts préétablis.

Comme un exemple représentatif, nous démontrons l'utilisation de la plate-forme pour l'étude des réponses transcriptionnelles suscité dans les cellules immunitaires à défi avec des bactéries (Figure 2). La réalisation de ces expériences sur la plate-forme nous a permis de travailler avec de petits nombres de cellules (~ 1000 par expérimentationétat mental), minimiser la variabilité expérience à l'expérience, les réactifs de conserver et re-direct-mains sur le travail. Compte tenu des avantages qu'il confère, ainsi que son accessibilité et polyvalence, cette plate-forme devrait trouver une utilisation dans une grande variété de laboratoires et d'applications et se révéler particulièrement utile pour faciliter l'analyse des cellules et des stimuli qui sont disponibles en quantités limitées.

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Protocole

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Ce protocole général est conçu pour appuyer l'application de la plate-forme pour un large éventail d'études, les aspects spécifiques à l'étude représentative décrite dans le présent rapport sont séparés entre parenthèses figure 2 illustre une étude représentative réalisée à l'aide du protocole.. Notez que dans le protocole, toutes les commandes "instruire" sont automatisées grâce à l'utilisation de scripts préétablis. Notez aussi que l'étape 2 peut être effectuée en parallèle avec l'étape 1 (par exemple pendant les étapes 1.7 et 1.8), et que l'étape 2.1 est souvent contournés (car les plaques de l'appareil DMF motifs / revêtement peuvent être lavés et réutilisés; voir l'étape 5.2) .

1. Assembler et Remplir les Chambres de perfusion portables

  1. Enduire les surfaces intérieures de stérilisation (autoclave) microcapillaires (silice fondue; 679 um od, 534 Identifiant du um; 15 cm de long) avec la fibronectine, en demandant à la pompe à seringue pour aspirer une solution de fibronectine stérile (30 pl de 50 pg / ml) dans chaquemicrocapillaires, l'incubation (37 ° C pendant 2 heures), ordonnant la pompe à seringue pour prélever la solution, et en laissant le microcapillaires sec (température ambiante (RT) pendant 6 heures).
  2. Connecter chaque microcapillaire fibronectine revêtu (chambre de perfusion) à un tube de polycarbonate (500 um de diamètre extérieur, 100 ° du um) et de la tubulure de la pompe à seringue à ports multiples, utilisant des raccords CapTite (6 chambres de perfusion, 8 ports pompe de seringue).
  3. Utilisation de ruban adhésif, fixer le corps de chaque chambre de perfusion à un bloc de chaleur fixé à la température désirée (37 ° C).
  4. Plonger les extrémités ouvertes des chambres de perfusion à un réservoir (tube de microcentifuge ou une plaque de microtitrage) des cellules contenant (P388D.1 macrophages murins) en suspension dans du milieu de croissance frais (milieu RPMI-1640, 10% FBS, 500 unités / ml de pénicilline, 500 ug / ml de streptomycine) à une concentration souhaitée (10 6 cellules / ml).
  5. Demandez à la pompe de la seringue pour dessiner des cellules (10 ul, 10 4 cellules) dans chaque chambre de perfusion suivie d'assez intérimr pour déplacer le bouchon de liquide (~ 4,5 cm) de la partie solidaire du bloc de chauffage.
  6. Permettre aux cellules d'adhérer aux surfaces intérieures revêtues de fibronectine des chambres de perfusion (37 ° C pendant 1 - 2 h). Dans l'intervalle, transférer les extrémités ouvertes des chambres de perfusion à partir du réservoir de cellules à un nouveau réservoir contenant un milieu de croissance frais.
  7. Après la période d'adhésion, charger le pousse-seringue pour envoyer les bouchons liquides (milieux conditionnés et les cellules seules) à perdre, retirer du milieu frais (10 pi), et suivre avec assez d'air pour positionner les nouveaux bouchons liquides (milieu frais) sur la adhéré cellules.
  8. Continuer à mener des échanges moyens (c.-à répéter l'étape 1.7) à intervalles réguliers (toutes les 2 h) jusqu'à ce que les populations cellulaires sont suffisamment équilibrée et étendue (16 à 24 h de culture à petite échelle des populations d'affaires de ~ 1000 cellules / chambre).

2. Fabriquer le dispositif de DMF et assembler l'architecture Hub

  1. comme décrit précédemment 14,29, modèle de la plaque inférieure de l'appareil DMF avec quarante-six oxyde d'indium-étain (ITO) des électrodes (conducteurs de gouttelettes actionnement) par photolithographie et gravure, et les enrober de 5 microns de Parylene-C et 50 nm de Téflon AF. Former la plaque de dessus du dispositif de DMF par revêtement d'un substrat de verre sans dessin ITO avec de Téflon AF, comme ci-dessus.
  2. L'utilisation des trames de compression en métal, fixer les plaques de DMF dans un moule polymère 14,30 avec des évidements qui maintiennent un espacement de 400 pm entre les plaques; cet espacement, combinée avec la taille de l'électrode d'actionnement (2,5 mm 2), qui définit le volume de la gouttelette (2,5 pl par électrode). Notez que l'assemblage DMF peut être accompli par des moyens plus simples 24.
  3. Insert revêtu de Téflon transfert microcapillaires (360 um de diamètre extérieur, 100 ° du um; 3,5 à 4,0 cm de long) dans l'espace entre les plaques DMF, le positionnement de chaque pour s'étendre vers le bord de l'électrode d'actionnement apparenté.
  4. À la salle opposéd de chaque transfert apposer microcapillaires un raccord CapTite.
  5. Engager les connecteurs électriques pour fournir une tension aux électrodes d'ITO. séquences d'activation des électrodes sont automatisées grâce à l'utilisation d'une interface électronique commandé par ordinateur exécutant des scripts préétablis.
  6. En option: Déplacer la plaque tournante du DMF assemblé sur la scène de translation d'un microscope (SZ-6145TR (Olympus, Japon)) équipé d'un dispositif à couplage de charge (CCD) (DCR-HC96 (Sony, Japon)) pour faciliter le suivi de gouttelettes 31.

3. Relier les chambres de perfusion au Hub DMF et stimuler les populations cellulaires

  1. Retirez les extrémités ouvertes des chambres de perfusion du réservoir de fluide (voir l'étape 1.6) et insérez-les dans les raccords CapTite fixés aux extrémités du transfert microcapillaires du moyeu DMF (voir l'étape 2.4).
  2. Demandez à la pompe de la seringue pour envoyer les bouchons liquides (milieux conditionnés) dans les chambres de perfusion à perdre.
  3. InstRUCT le moyeu du DMF pour dessiner stimulus (E. coli particules biologiques à 100 pg / ml dans du milieu frais contenant 0,1% de Pluronic F127 p / v) à partir d'un réservoir embarqué et délivrer une gouttelette de taille appropriée (10 pl) pour chaque transfert microcapillaire . Les réservoirs de bord sont composés de compartiments de forme cylindrique (1,5 x 1,5 cm chacune) et reliée au moyeu par l'intermédiaire de tubes de DMF.
  4. Demandez à la pompe à seringue pour aspirer le stimulus se branche sur le transfert microcapillaires, et suivre avec assez d'air pour positionner les bouchons sur les populations de cellules dans les chambres de perfusion.
  5. Incuber les cellules avec des mesures de relance (37 ° C pendant 1-4 heures). Facultatif: Échange de relance frais (c. répétez les étapes 3,2-3,4) à intervalles réguliers.

4. Mettre fin à la stimulation et récupérer Lysats cellulaires pour l'analyse

  1. Facultatif: si une période post-stimulation est nécessaire, échanger les bouchons liquides stimulus contenant de milieu frais (c. répétez les étapes 3,2 à 3.4, En remplaçant un milieu frais de relance), et continuer à incuber et échanger si nécessaire.
  2. Echange les bouchons liquide dans les chambres de perfusion pour le tampon de lavage (Prelude Direct Lysis Buffer Module B) (c. répétez les étapes 3.2 à 3.4, en remplaçant le tampon de lavage de relance), et incuber au besoin (5 min).
  3. Bourse Les bouchons liquides (tampon de lavage) pour la solution de lyse (Prelude Direct tampon du module de lyse A avec 0,1% de Pluronic F127 w / v) (c. répétez les étapes 3.2 à 3.4, en remplaçant la solution de lyse de relance), et incuber au besoin (5 min) .
  4. Demandez à la pompe de la seringue pour envoyer les bouchons liquides (lysats cellulaires) au moyeu DMF.
  5. Démonter le moyeu DMF, retirez la plaque supérieure de l'appareil DMF (en prenant soin de ne pas incliner la plaque de côté, car cela peut entraîner des gouttelettes de mélange), et de recueillir les lysats en utilisant un Pipetman ou une seringue pour une analyse hors-plate-forme (profilage de l'expression génique par qPCR).

5. Propre plate-forme matérielle pourRéutiliser

  1. Plonger le transfert microcapillaires et raccords CapTite en Javel à 10% (v / v dans l'eau) pendant 10 min à température ambiante, bien rincer avec de l'eau déminéralisée et sec en utilisant de l'azote gazeux.
  2. Plonger les plaques d'appareils DMF en Javel à 10% pendant 10 min à température ambiante, bien rincer avec de l'isopropanol puis de l'eau déminéralisée et sec en utilisant de l'azote gazeux suivie d'une cuisson à 160 ° C pendant 10 min.
  3. Le tube de polycarbonate de la seringue pompe, et la fonte de polymère de l'appareil DMF et le cadre de compression, peut être réutilisée sans nettoyage. La perfusion chambre microcapillaires sont jetés après chaque expérience.

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Résultats

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Comme une démonstration de la plate-forme automatisée, nous l'avons utilisé pour réaliser une étude dans laquelle de petites populations de cellules immunitaires ont été cultivées dans des cultures de micro-échelle, contesté par des bactéries, et lysées pour l'analyse hors plate-forme de réponses pro-inflammatoires (Figure 2 ).

Chacune des six chambres de perfusion de cellules a été ensemencé avec 10 4 cellules immunitaires (macrophages murins P388D.1) remises en ...

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Discussion

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Nous avons développé une plate-forme automatisée simple et polyvalent pour la culture cellulaire à micro-échelle et des expériences de stimulation. La plate-forme nous permet de travailler avec de petits volumes de culture et les populations cellulaires (1 - 20 pi et 100 - 2.000 cellules, par chambre); dimensions de la culture pourrait être encore réduit par l'utilisation de micro-capillaires de petit diamètre. Travailler à ces échelles de réduire le coût des études de routine et fait des études possibles q...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

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Les auteurs remercient Ronald F. Renzi et Michael S. Bartsch pour leur contribution à la conception et au développement de dispositifs DMF et le moyeu DMF. Cette recherche a été entièrement pris en charge par le Laboratoire de recherche en scène et le programme de développement au Sandia National Laboratories. Sandia est un laboratoire multi-programme géré et exploité par Sandia Corporation, une filiale en propriété exclusive de Lockheed Martin Corporation, pour le ministère de l'Administration nationale de sécurité nucléaire américain de l'Énergie sous contrat DE-AC04-94AL85000.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Module de lyse directe PreludeNuGEN1400-24
Bleu trypan (0,4 % p/v)GIBCO15250-061
Décapant cellulaireCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesInvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCRApplied BiosystemsMm00443111_m1
CCL5 TaqMan qRT-PCRApplied BiosystemsMm01302428_m1
PTGS2 TaqMan qRT-PCRApplied BiosystemsMm00478374_m1
TNF TaqMan qRT-PCR AppliedBiosystemsMm00443258_m1
GAPDH TaqMan qRT-PCR AppliedBiosystemsMm99999915_g1
Pluronic F127Sigma Chemical2594628
Fluorinert FC-40Sigma Chemical51142-49-5
Dimère de parylène CSpecialty Coating Systems28804-46-8
Teflon-AFDuPontAF1600
Ruban polyimideULINES-11928
Substrats en verre revêtus d’oxyde d’indium et d’étain (ITO) Delta TechnologiesCB-40IN-1107
Moyeu DMF Microcapillaires en silice fondue revêtus de téflon MicrocapillairesTSU100375
Tubes et raccords microcapillairesSandia National Laboratories
Tube en polycarbonateParadigm OpticsCTPC100-500-5
Pousse-seringue de précision à 8 ports équipé de 30 mm (500 μ ; l capacité) seringuesHamilton Company54848-01
Instrument de dépôt en phase vapeur de parylène-CSpecialty Coating SystemsPDS 2010 Labcoter 2
Générateur de fonction haute tensionTrek615A-1 615-3
MVX10microscope OlympusEn option (facilite le suivi des gouttelettes sur le moyeu DMF)
Caméra numérique CCD QIClickQImagingQIClick-F-CLR-12En option (facilite le suivi des gouttelettes sur le moyeu DMF)
de la chambre de perfusion Polymicro Technologies TSP530700

Références

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Mots-clés

Micro scale Cell CultureDigital MicrofluidicsCell Perfusion ChambersSyringe Pump ControlAutomated Cell StimulationQuantitative RT PCR AnalysisFibronectin CoatingMicrocapillary TransportCell Lysate RecoveryImmune Cell Stimulation

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