L'état d'équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d'affaires de l'activité de ADNglycosylase

Résumé

des plages de temps pour l'activité glycosylase de 8-oxoguanine ADN glycosylase sont biphasique présentant une salve de formation de produit et une phase de régime permanent linéaire. Utilisant des techniques de trempe de trésorerie, l'éclatement et les taux de régime permanent peut être mesurée, qui correspondent à l'excision de 8 oxoguanine et la libération de la glycosylase de l'ADN du produit, respectivement.

Résumé

Human 8-oxoguanine ADN glycosylase (OGG1) excise le mutagène oxydatif lésion de l'ADN 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) à partir de l'ADN. Caractérisation cinétique des OGG1 est entrepris pour mesurer les taux d'excision 8 oxoG et version du produit. Lorsque la concentration est inférieure à OGG1 substrat d'ADN, les temps de formation de produit sont biphasique; une phase exponentielle rapide (c. salve) de formation du produit est suivie par une phase de régime permanent linéaire. La salve initial de la formation du produit correspond à la concentration de l'enzyme correctement en prise sur le substrat, et l'amplitude de rafale dépend de la concentration de l'enzyme. La constante de l'éclatement de vitesse de premier ordre correspond à la fréquence intrinsèque de l'excision 8 oxoG et le taux de régime permanent lent mesure le taux de libération du produit (Product DNA dissociation constante de vitesse, k _off). Ici, nous décrivons les approches état d'équilibre, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d'affaires d'isoler et de mesurer spétapes SPÉCIFIQUE pendant OGG1 cyclisme catalytique. A fluorescent oligonucléotide marqué lésion contenant et OGG1 purifiés sont utilisés pour faciliter les mesures cinétiques précises. Depuis faibles concentrations d'enzymes sont utilisés pour effectuer des mesures en régime permanent, le mélange des réactifs manuel et extinction de la réaction peut être effectuée pour déterminer le taux de régime permanent (k _off). En outre, l'extrapolation de la vitesse de régime permanent à un point situé sur l'ordonnée à l'instant zéro indique qu'une salve de formation de produit est survenu au cours de la première rotation (c. ordonnée à l'origine est positif). La constante de temps de la phase de salve exponentiel de vitesse de premier ordre peut être mesurée à l'aide d'une technique de mélange et de refroidissement rapide, qui examine la quantité de produit formé à des intervalles de temps courts (<1 s) avant la phase de régime permanent, et correspond à la vitesse de 8 -oxoG excision (c.-à-chimie). L'étape chimique peut également être mesurée en utilisant une approche unique chiffre d'affaires où le cyclisme catalytique estempêché par l'ADN de substrat de saturation avec l'enzyme (E> S). Ces approches permettent de mesurer les constantes de vitesse élémentaires qui influencent l'efficacité d'élimination d'une lésion de l'ADN.

Introduction

Un milieu aérobie accélère l'instabilité génomique. Une importante lésion de l'ADN promutagène résultant du stress oxydatif est la 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8 oxoG). Cela est dû au potentiel de codage ambigu de 8 oxoG. Human 8 oxoguanine ADN glycosylase (OGG1) est chargé d'initier la réparation par excision de base de 8 oxoG. L'activité glycosylase de OGG1 excise la base de 8 oxoG résultant dans l'ADN de produit avec un site apurinique (AP-site). Une activité de lyase faible de OGG1 peut inciser le site de AP dans certains cas.

Caractérisation cinétique des ADN glycosylases trouve généralement qu'ils présentent des....

Protocole

1. Préparation de l'enzyme et substrat d'ADN

1. Surexpriment OGG1 comme une protéine de fusion GST dans E. coli, utilisent la GST-tag pour la purification, puis supprimer la TPS-tag par clivage avec HRV-3C protéase (Figure 1) ^6.
2. Achetez la synthèse chimique 5'-6-carboxyfluorescéine (6-FAM) oligonucléotide marqué contenant un seul résidu de 8 oxoG et son brin complémentaire d'oligonucléotides non marqués. Les oligonucléotides 34-mères contiennent un 8-oxoG à la position 17 à partir de l'extrémité 5 '. Purifier ces oligonucléotides par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
3. Prép....

Résultats

Analyse cinétique état ​​d'équilibre a été effectuée en utilisant 200 substrat d'ADN nM et quatre concentrations apparentes différentes de OGG1 (15, 30, 45, et 60 nM) telle que déterminée par un dosage de protéines Bradford ^2. Les cours du temps de la formation du produit ont été ajustées à une équation linéaire pour déterminer l'ordonnée à l'origine, qui étaient de 2,2, 11, 15 et 26 nm, respectivement, par rapport à chaque concentration de la protéine (figure 2B). Les ordonné.......

Discussion

Les approches cinétiques décrites ici un aperçu des méthodes pour définir des constantes cinétiques élémentaires. Si une évolution dans le temps de formation du produit est biphasique avec le premier chiffre d'affaires enzymatique produisant rapidement, puis une étape après la chimie est limitante pendant revirements catalytiques ultérieurs. Dans le cas de OGG1, le premier chiffre peut être mesurée à l'aide de fortes concentrations d'enzymes avec soit de limitation (S E) des concentrat.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Reagent/Material
5'-6-FAM des oligonucléotides marqués contenant un seul oligonucléotides radiomarqués 8-oxoG	Eurofins MWG Operon		5'-P32 peuvent également être utilisés. La purification du gel de polyacrylamide est recommandée.
Oligonucléotides non marqués (brin complémentaire)	qualité de purification sur gel de polyacrylamide	Eurofins MWG Operon
La seringue jetable BD Luer Lock de 1 ml	Medical	309628	seringue jetable Lue Lock d’autres fournisseurs peuvent également être utilisées.
La seringue jetable BD Luer Lock de 10 ml	BE Medical	309604	seringue jetable Luer Lock d’autres fournisseurs peut également être utilisée.
EquipmentBain-marie
fournisseur			d’instruments
trempe et d’écoulement rapides RQF-3	KinTek Corporation		Instrument d’écoulement rapide d’autres fournisseurs peut également être utilisé.
Typhoon Phosphorimager 8600	GE Healthcare Life Sciences		Imager d’autres fournisseurs peut également être utilisé.
		synergie	KaleidaGraph

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