Article de méthode

Multiplexé fluorescent puce à ADN pour salivaire humaine analyse des protéines en utilisant un polymère microsphères et faisceaux de fibres optiques

DOI :

10.3791/50726

⸱

10 octobre 2013

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1Department of Chemistry, Tufts University, 2Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), 3Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons une procédure pour le profilage de protéines salivaires utilisant multiplexés puces à anticorps à base de microsphères. Les anticorps monoclonaux ont été liés par covalence à 4,5 um microsphères de polymère de colorants fluorescents codé en utilisant la chimie du carbodiimide. Les microsphères modifiées ont été déposés dans des micropuits à fibres optiques pour mesurer les niveaux de protéine dans la salive en utilisant des dosages immunologiques par fluorescence en sandwich.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici un protocole pour la mesure simultanée de six protéines de la salive à l'aide d'une base de microsphères puce à anticorps fibre optique. La technique d'immuno-matrice employée combine les avantages de base de microsphères en suspension tableau fabrication à l'utilisation de la microscopie à fluorescence. Comme décrit dans le protocole vidéo, disponibles dans le commerce microsphères de polymère de 4,5 um ont été codés en sept types différents, qui se différencient par la concentration de deux colorants fluorescents physiquement piégés à l'intérieur des microsphères. Les microsphères codées contenant des groupes carboxyle de surface ont été modifiées avec des anticorps monoclonaux de capture à travers EDC / NHS couplage de la chimie. Pour assembler la puce à protéines, les différents types de microsphères codées et fonctionnalisées ont été mélangés et déposés de manière aléatoire dans les micropuits 4,5 um, qui ont été gravées chimiquement à l'extrémité proximale d'un faisceau de fibres optiques. Le faisceau de fibres optiques a été utilisé à la fois comme support et pour l'imagerie de la microspheres. Une fois assemblée, la puce à ADN a été utilisée pour capturer des protéines dans le surnageant de la salive recueillie à partir de la clinique. La détection a été basé sur un dosage immunologique de type sandwich utilisant un mélange d'anticorps de détection biotinylés pour différentes substances à analyser avec une sonde fluorescente conjuguée à la streptavidine, R-phycoérythrine. La puce a été imagée par microscopie de fluorescence en trois canaux différents, deux pour l'enregistrement de la microsphère et une pour le signal de test. Les micrographies de fluorescence ont été ensuite décodées et analysées à l'aide d'un algorithme maison dans MATLAB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Depuis la première puce à ADN rapporté par Mark Schena et ses collègues dans le milieu des années 1990, ce puissant outil a été utilisé dans de nombreux domaines de la recherche biologique 1. Microréseaux d'anticorps capables de détecter simultanément de multiples protéines dans des fluides de diagnostic, tels que le sang, ont des applications importantes dans les diagnostics cliniques et des biomarqueurs de dépistage 2-10. Salive, contenant un grand nombre des mêmes analytes que le sang, a été considéré comme une alternative préférable au sang, car la collecte de salive est sûre, non invasive, et peut être effectué par le personnel médical peu formés 11-13. Actuellement, l'analyse des protéines multiplexé en utilisant des échantillons de salive est limitée par plusieurs facteurs importants, y compris la faible concentration de l'analyte cible 14 et la large gamme de concentrations différentes de marqueurs biologiques 15.

.

Ici, nous démontrons l'analyse de six protéines: facteur endothélial vasculaire de croissance humaine (VEGF), la protéine induite par l'interféron-gamma 10 (IP-10), interleukine-8 (IL-8), facteur de croissance épidermique (EGF), la matrice métallopeptidase 9 (MMP-9), et l'interleukine-1 bêta (IL-1β) . Les performances du procédé a d'abord été vérifié à l'aide de solutions standard d'analyte constituant les protéines recombinantes et d'un tampon de blocage. Échantillons de salive réels recueillies auprès de patients de différentes maladies respiratoires chroniques ainsi que des contrôles sains ont également été testés avec des performances satisfaisantes. Le protocole devrait être applicable à d'autres analytes de protéines et d'autres essais à base de microsphères. Cette plate-forme offre des avantages considérables dans le domaine de chimie analytique, car elle permet l'analyse simultanée rapide, précis et reproductible de faibles concentrations de plusieurs protéines avec une large gamme dynamique, interactions non spécifiques minimales, la consommation réduite de l'échantillon, et à faible coût par rapport à un analogue Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

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Protocole

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figure-protocol-1
Figure 1. . Flux de travail pour appliquer une puce à anticorps de la microsphère de la fibre optique à la salive de profilage (1) Des microsphères sont codés en interne avec deux colorants fluorescents, (2) les microsphères codés sont extérieurement modifiées avec des anticorps monoclonaux spécifiques de la protéine, (3) les microsphères multiplexés sont mélangés, et (4) déposés au hasard dans des micropuits gravés à l'extrémité proximale d'un faisceau de fibres optiques (5); protéines salivaires sont capturés par les microsphères à travers immunologique en sandwich, et (6) quantifiés en utilisant la microscopie à fluorescence.

Une. Microsphères encodage

  1. Peser europium de sodium (III) thenoyltrifluoroacetonate trihydrate (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) dans un flacon en verre ambré et préparer une solution stock de 200 mM dans du tétrahydrofuranne (THF). Mélanger doucement par pipetage; vérifier visuellementle colorant est totalement dissous.
  2. Peser coumarine 30 (C30, MW = 347,41 g / mol) dans un flacon en verre ambré et préparer une solution stock de 12 mM dans le THF. Mélanger délicatement la pipette, vérifier visuellement le colorant soit complètement dissous.
  3. Préparer 700 pi de solution de travail pour chaque type de microsphères à l'aide des solutions mères et de THF pour atteindre la concentration finale indiquée dans le tableau 1.
  4. Assurer microsphères (10% p / v) sont bien en suspension au vortex, puis transférer 60 pi de suspension à un tube de 1,5 ml.
  5. Ajouter 600 ul de PBS à suspension de microsphères et mélanger par pipetage 20x. Centrifuger le tube à 10 000 rpm pendant 3 min et retirez soigneusement le surnageant. Répétez ce processus une autre 2x pour laver les microsphères.
  6. Laver le culot de microsphères 3x avec du THF en utilisant une procédure similaire à l'étape 1.5.
  7. Centrifuger la suspension de microsphères / THF à 10 000 tours par minute pendant 3 min, retirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 600 ulsolution de travail énumérés dans le tableau 1. Transférer le mélange dans un nouveau tube de 1,5 ml microtubes.
  8. Scellez le tube à centrifuger avec du Parafilm et le placer sur un agitateur. Agiter à 3000 rpm et incuber pendant 24 heures, protéger de la lumière en couvrant la configuration à l'aide d'une boîte recouverte de papier d'aluminium.
  9. Centrifuger la suspension de microsphères à 10000 rpm pendant 3 minutes pour former une pastille.
  10. Retirer le surnageant de solution de colorant, se laver les microsphères 6x avec 600 ul de methanol, puis avec 600 pi de PBS contenant 0,01% de Tween-20 à un autre 6x, telle que décrite dans l'étape 1.5.
  11. Stocker les microsphères codées dans 600 ul de PBS contenant 0,01% de Tween-20 à 4 ° C jusqu'à son utilisation, l'abri de la lumière.
nom du type de microsphères: 1 2 3 4 5 6 7
Eu-TTA (mM) 100 100 10 100 10
C30 (mM) 1 1 6 6 1 6

Tableau 1. Les concentrations de Eu-TTA et C30 solutions de travail.

2. Préparation de microsphères de protéine de capture d'

  1. Préparer du tampon MES [2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, SDS 0,01%, pH 5,7] et de tampon PBS / SDS (Sodium phosphate 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS à 0,01%, pH 7.4) à l'avance à la température ambiante.
  2. Ajouter 200 pi codé suspension de microsphères (contenant ~ 2 mg de microsphères) dans un tube de 1,5 ml microtubes Safe-Lock. Il est important d'utiliser ce type de tube à centrifuger pour éviter les fuites pendant l'incubation à l'étape 2.6.
  3. Lavez les microsphères avec 600 ul tampon MES 3x comme décrit dans l'étape 1.5. Ajouter 700 ul MES au culot de microsphères et bien mélanger par pipetage.
  4. Préparer 0,105 g / ml de 1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide (EDC, PM = 191,7 g / mol) et 0,163 g / ml de sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) solutions dans un tampon MES dans des tubes séparés.
  5. Ajouter 150 ul de solution fraîchement préparée EDC goutte à goutte dans la suspension de microsphères. La SEE hydrolyse très rapidement, il est donc essentiel d'utiliser une solution fraîchement préparée d'assurer l'efficacité de l'immobilisation. Immédiatement après l'addition de la CED, ajouter la solution sulfo-NHS 150 pi pour les microsphères, bien mélanger par pipetage et vérifiez la suspension est homogène.
  6. Boucher le tube, le sceller avec du Parafilm, et le placer sur un agitateur. Agiter à 1500 tours par minute pendant 4 heures, protéger de la lumière en utilisant une boîte recouverte de papier d'aluminium.
  7. Centrifuger le suspens de microsphèresion à 10000 rpm pendant 3 minutes pour former un culot et éliminer le surnageant. Laver les microsphères avec 500 ul de PBS / SDS 3x tampons comme décrit dans l'étape 1.5.
  8. Ajouter tampon PBS / SDS 200 pi au culot, bien mélanger les microsphères et transférer la solution dans 300 pi de tampon PBS / SDS contenant 60 anticorps de capture de pg. Il est important de suspendre le culot de microsphères, puis d'ajouter la suspension de microsphères dans la solution d'anticorps.
  9. Incuber le mélange d'anticorps microsphères par agitation à 1500 tours par minute pendant 4 heures sur un agitateur, protéger de la lumière en utilisant une boîte recouverte de papier d'aluminium.
  10. Centrifuger la suspension de microsphères à 10000 rpm pendant 3 minutes pour former un culot et éliminer le surnageant. Laver les microsphères avec 500 ul StartingBlock (TBS) de blocage 3x tampons, comme décrit dans l'étape 1.5.
  11. Mélanger microsphères avec 1 ml de TBS tampon de blocage et incuber microsphères à 1500 tours par minute pendant 1 heure sur un agitateur, protéger de la lumière en utilisant une boîte anserouge avec une feuille d'aluminium.
  12. Centrifuger la suspension de microsphères à 7000 rpm pendant 3 minutes pour former un culot et éliminer le surnageant. Laver le culot avec de 3x 500 ul de tampon TBS blocage, tel que décrit dans l'étape 1.5.
  13. Centrifuger la solution à base de microsphères à 7000 rpm pendant 3 minutes pour former un culot et éliminer le surnageant. Ajouter 500 ul SCT tampon de blocage et mélanger par pipetage.
  14. Entreposez la suspension de microsphères modifiées à 4 ° C jusqu'à leur utilisation, protéger de la lumière.
  15. Répétez cette procédure pour faire d'autres types de microsphères en utilisant des anticorps correspondants.

3. Fibre optique Assemblée puces à ADN

  1. Mélanger 50 pi de chaque type de microsphères d'interception de protéines dans un nouveau tube autoclave. Centrifuger les microsphères d'actions en commun à 7000 rpm pendant 3 minutes, et retirer le surnageant de sorte que le volume restant est d'environ 100 pi.
  2. Coupées à la main fibre optique faisceaux à environ 5 cm de longueur etpolir de manière séquentielle aux deux extrémités sur une machine de polissage à l'aide de 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 et 0,05 um de taille de diamant rodage films. Soniquer le faisceau poli dans de l'eau déminéralisée pendant 2 min pour éliminer les particules.
  3. Mettez une petite barre d'agitation magnétique dans un tube de 0,5 ml à centrifuger, ajouter 400 ul de PBS sans protéines tampon et remuer sur une plaque d'agitation magnétique pendant 30 min pour éliminer les bulles d'air.
  4. Graver une extrémité du faisceau de fibres polies dans une solution de HCl 0,025 N pour 150 sec 10,16. Immerger immédiatement et soniquer la fin gravé dans de l'eau déminéralisée pendant 1 min. Sécher les faisceaux de fibres à l'air comprimé.
  5. Monter le faisceau de fibres sur un support de fibre et de bloquer la fin gravé dans le tampon PBS sans bulles exempt de protéines pendant 1 heure.
  6. Dépôt de 1 ul aliquote de la suspension de microsphères stockée sur l'extrémité gravée du faisceau de fibres optiques. Protéger l'installation de la lumière avec une boîte de papier d'aluminium, et d'attendre 15 min. Le volume de la suspension seradiminuer par évaporation et forcer les microsphères dans les puits gravés. Répétez cette étape de chargement une fois de plus.
  7. Utilisez un tampon saturé avec une solution de l'échantillon pour éliminer les microsphères qui ne sont pas piégés dans les puits. La puce à protéine est maintenant prêt à utiliser. Rendez-vous immédiatement à l'étape 4.1 pour l'analyse de la salive.

4. Analyse des échantillons de salive de puces à ADN utilisant des microsphères

  1. Ajouter une solution de 200 ul d'échantillon (100 ul de surnageant de salive diluée avec un volume égal de StartingBlock T20 (PBS) du tampon de blocage. L'protocole de collecte de salive surnageant a été publiée antérieurement 10). dans un autoclave microtube de 0,5 ml. Trempez la puce à protéine chargée sur la fibre dans la solution et incuber sur l'agitateur à 600 tours par minute pendant 2 heures, protéger de la lumière en utilisant une boîte recouverte de papier d'aluminium.
  2. Préparer 20 ml de tampon de lavage par addition de 200 ul de solution de BSA à 10% et 200 ul de 10% de Tween-20 dans 19,6 ml de PBS, mix et en agitant doucement.
  3. Trempez la puce à protéine dans un nouveau tube autoclave contenant 200 tampon de lavage ul et agiter à 600 tours par minute pendant 2 min. Répéter ce lavage 3x.
  4. Incuber la puce à ADN en solution à 100 ul d'un cocktail d'anticorps de détection contenant 5 ug / ml d'anti-VEGF, IP-10, IL-8, l'EGF, la MMP-9, les anticorps de détection biotinylés IL-1β dans StartingBlock T20 (PBS) du tampon de blocage pendant 30 min à température ambiante sur agitateur à 600 rpm, protéger de la lumière en utilisant une boîte recouverte de papier d'aluminium.
  5. Laver 3x de puces à ADN avec le tampon de lavage comme décrit dans l'étape 4.3.
  6. Incuber la puce dans 200 ul de 20 pg / ml conjugué streptavidine-phycoérythrine R (SAPE) solution dans du PBS à 600 tours par minute sur l'agitateur pendant 10 min, protéger de la lumière en utilisant une boîte recouverte de papier d'aluminium.
  7. Laver le 5x de puces à ADN avec le tampon de lavage comme décrit dans l'étape 4.3.
  8. Nettoyer l'extrémité distale de la fibre (par exemple, à une distance de l'extrémitédes microsphères) bundle avec un tampon saturé avec de l'éthanol absolu.
  9. Sécher les deux extrémités de la fibre avec de l'air comprimé. Monter la fibre sur un microscope à épifluorescence et de l'image à travers l'extrémité distale de la fibre.
  10. Acquérir les images microsphères correspondant à Eu-TTA, C30, et SAPE intensités d'émission de fluorescence. Filtres optiques installation et temps d'exposition pour l'imagerie de fluorescence d'Eu-TTA, C30, et SAPE sont représentés dans le tableau 2.
Canal Eu-TTA C30 SAPE
Excitateur 365/10x 350/50x 546/10x
Beamsplitter 525DCLP 400DCLP 560LP
Émetteur 620/60m 460/50m 580/30m
Temps d'exposition 1 s 0,3 sec 1 s

Tableau 2. Paramètres pour les trois images fluorescentes de la puce.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des images de fluorescence provenant de trois canaux qui montrent une petite section du faisceau à fibre optique sont représentées sur les figures 2A-C. Ces images ont été analysées en utilisant un algorithme écrit en MATLAB (comme décrit plus en détail dans la section Discussion). L'analyse utilise à la fois des informations d'image de codage Eu-TTA (Figure 2A) et l'image de codage de C30 (figure 2B) pour décoder les microsphères, et les intensités de fluorescence des ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les chercheurs devraient accorder une attention supplémentaire pour les étapes suivantes: pour une meilleure précision de décodage, il est nécessaire de vérifier les microsphères ont été suspendus de manière homogène dans toutes les étapes de lavage et incubation pendant la procédure microsphères de codage. En outre, les microsphères doivent être codées à l'abri de la lumière à travers toute l'expérience. À la suite des procédures de codage et de stockage appropriées, nous avons constaté que la précision globale...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les National Institutes of de santé (subvention 08UDE017788-05). EBP reconnaît également le soutien de la Fondation Espagnole pour la Science et la Technologie (FECYT). Les auteurs remercient Shonda T. Gaylord et Pratyusha Mogalisetti pour la lecture critique du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Colorant Eu-TTAFisher ScientificAC42319-0010
THFSigma-Aldrich34865-100ML
Flacon en verre ambréFisher Scientific03-339-23B
Colorant coumarine 30Sigma-Aldrich546127-100MG
MicrosphèresBangslabsPC05N/6698
Tubes à centrifuger de 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
PBS 10x concentréSigma-AldrichP5493-1L
EauSigma-AldrichW4502-1L
MéthanolSigma-Aldrich34860-100ML
Tw-20Sigma-AldrichP7949-100 ml
BupH MES sérum physiologiquetamponné Thermo Scientific28390
FDSSigma-Aldrich05030-500ML-F
Solution NaOHFisher ScientificSS256-500
Safe-lock microcentrifugetube VWR labshop53511-997
EDCThermo Scientific22980
Sulfo-NHSThermo Scientific24510
Anticorps de capture VEGF humainR& D SystemsMAB293
Anticorps de capture IP-10 humainR& D SystemsMAB266
Anticorps de capture de l’IL-8 humainR& D SystemsMAB208
Anticorps de capture EGF humainR& D SystemsMAB636
Anticorps de capture MMP-9 humainR& D SystemsMAB936
Anticorps anti-capture IL-1&beta ; humainR& D SystemsMAB601
Souris IgG1 contrôle de l’isotype antibodyR& D SystemsMAB002
Tampon StartingBlock (TBS)Thermo Scientific37542
Solution étalon HCl 1,0 NSigma-Aldrich318949-500 ml
0,5 ml Tubes à centrifugerFisher Scientific05-408-120
Tampon sans protéines (PBS)Thermo Scientific37572
Humain recombinant VEGF 165R& D Systems293-VE
Recombinant humain IP-10R& D Systems266-IP
IL-8 humain recombinantR& D Systems208-IL
Recombinant humain EGFR& D Systems236-EG
Recombinant humain MMP-9R& D Systems911-MP
IL-1 humain recombinant ;R& D Systems201-LB
StartingBlock T20 (PBS) tamponThermo Scientific37539
Bloqueur BSA en PBSThermo Scientific37525
Détection d’anticorps VEGF biotinylésR& D SystemsBAF293
Anticorps de détection IP-10 biotinylésR& D SystemsBAF266
Anticorps de détection de l’IL-8 biotinyléR& D SystemsBAF208
Anticorps de détection EGF biotinylésR& D SystemsBAF236
Anticorps de détection MMP-9 biotinyléR& D SystemsBAF911
Anticorps de détection IL-1&beta biotinylésR& D SystemsBAF201
Streptavidine, R-phycoérythrineInvitrogenS-21388
Éthanol (200 proof)Sigma-AldrichE7023-500ML

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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