Le virus respiratoire syncytial humain (HRSV) peut provoquer une bronchiolite sévère chez les jeunes nourrissons. Une partie de la pathogenèse de la maladie grave du VRSL est causée par la réponse immunitaire de l’hôte. La stimulation des cellules immunitaires humaines primaires avec le HRSV fournit un système modèle rapide et reproductible pour étudier l’activation des voies inflammatoires et l’infection.
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Article de méthode
Un modèle in vitro pour étudier les réponses immunitaires des cellules mononucléées du sang périphérique humain à l’infection par le virus respiratoire syncytial humain
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les infections par le virus respiratoire syncytial humain (VRHR) présentent un large spectre de gravité de la maladie, allant d’infections bénignes à une bronchiolite potentiellement mortelle. Une partie importante de la pathogenèse d’une maladie grave est une réponse immunitaire accrue conduisant à une immunopathologie.
Ici, nous décrivons un protocole utilisé pour étudier la réponse immunitaire des cellules immunitaires humaines à une infection par le VRSL. Tout d’abord, nous décrivons les méthodes utilisées pour la culture, la purification et la quantification du HRSV. Par la suite, nous décrivons un modèle humain in vitro dans lequel les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont stimulées par le HRSV en direct. Ce système modèle peut être utilisé pour étudier plusieurs paramètres qui peuvent contribuer à la gravité de la maladie, y compris la réponse immunitaire innée et adaptative. Ces réponses peuvent être mesurées au niveau transcriptionnel et translationnel. De plus, l’infection virale des cellules peut être facilement mesurée à l’aide de la cytométrie en flux. Dans l’ensemble, la stimulation de PBMC avec le HRSV en direct fournit un système modèle rapide et reproductible pour examiner les mécanismes impliqués dans la maladie induite par le HRSV.
Introduction
Le virus respiratoire syncytial humain (VRHR) est la cause la plus fréquente d’infections des voies respiratoires inférieures chez les enfants. Chaque année, plus de 33 millions d’enfants de moins de cinq ans sont infectés par le VRH, ce qui entraîne plus de trois millions d’hospitalisations et près de 200 000 décès1. De plus en plus de preuves suggèrent que le VRS représente également une menace importante pour les personnes âgées et les adultes atteints de maladies chroniques sous-jacentes2.
La majorité des infections par le VRSH chez les jeunes enfants présentent des symptômes bénins, comparables à ceux du rhume, et....
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Protocole
Remarque :
Les expériences avec le HRSV doivent être réalisées dans une hotte de sécurité biologique au sein d'un laboratoire de niveau de sécurité biologique 2. Recueillir tous les déchets viraux et les matériaux ayant été en contact avec le virus afin de les éliminer correctement en raison des risques biologiques.
Des précautions particulières doivent être prises lors de l'utilisation de sang humain potentiellement infecté.
Il est essentiel d'utiliser des réactifs exempts de pyrogènes tout au long de tous les protocoles.
1. Culture du HRSV A2
- Cult....
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Résultats
La méthode de culture et de purification du HRSV A2 décrite ici permet d'obtenir un rendement compris entre 2 × 107 et 2 × 108 particules virales infectieuses quantifiées par FITC-50 par ml. Les résultats de l'analyse microscopique, pour laquelle les cellules infectées marquées au FITC ont été comptées (résultats non montrés), ont été comparés aux résultats de la quantification par cytométrie en flux (Figure 1). Les deux méthodes ont fourni des titres similaires,.......
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Discussion
Dans cette étude, nous démontrons que l’infection de PBMC par le HRSV est un système modèle rapide et fiable dans lequel les voies inflammatoires peuvent être étudiées. Afin de stimuler les PBMC, il faut préparer et quantifier un stock de HRSV.
Plusieurs lignées cellulaires sont sensibles à l’infection par le VRSR. Les lignées cellulaires les plus utilisées pour la culture du HRSV sont les cellules HEp-2, HeLa et Vero. Cependant, nous ne recommandons pas l’utilisation de cellules Vero pour la .......
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Déclarations de divulgation
Nous n’avons rien à divulguer.
Remerciements
RSV A2 a été aimablement fourni par le Dr R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Pays-Bas). MV et GF sont soutenus par le consortium Virgo, financé par le projet du gouvernement néerlandais numéro FES0908, et par le projet de l’Initiative néerlandaise de génomique (NGI) numéro 050-060-452. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| PBS | Lonza | BE17-516F | PBS sans Ca2+ Mg2+ ou rouge phénol |
| HBSS | Invitrogen | 14025-100 | HBSS, Calcium, Magnésium, sans rouge de phénol |
| DMEM | Invitrogen | 31966-047 | DMEM, Glucose élevé, GlutaMAX, Pyruvate |
| RPMI | Invitrogen | 72400054 | RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES |
| Reduced Serum Medium (Opti-MEM) | Invitrogen | 51985-026 | Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX |
| FCS | Greiner Bio-one | FBS (Fetal Bovin Serum) | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030 | Albumine de sérum bovin |
| P/S | Invitrogen | 15140-122 | Pénicilline-Streptomycine, liquide |
| Trypsine | Invitrogen | 25300-054 | 0,05 % Trypsine-EDTA (1x), Rouge de Phénol |
| Cellules HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| A549 Cellules | ATCC | CCL-185 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | S7903 | Saccharose BioXtra, &ge ; 99,5 % |
| IgG2 anti-souris-FITC | BD Pharmingen | 555057 | Ms IgG2b K FITC contrôle isotype |
| Anti-NP-RSV-FITC | Abcam | ab25849 | Anti-Respiratory Syncytial Virus anticorps [671] (FITC) |
| Milieu à gradient de densité (Lymphoprep) | Axis-Shield | 1114545 | |
| tubes EDTA | BD Biosciences | 367525 | |
| Acétone | Merck Millipore | 1000141000 | Acétone pour l’analyse |
| Matériau | |||
| Tubes à centrifuger | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polyallomer, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm |
| SureSpin 630 Rotor avec godets de 36 ml | Sorvall | 79368 | Rotor à godets oscillants en titane |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Sorvall | 46900 | |
| CB 150l 2 Liant |
Références
- Nair, H., Nokes, D. J., et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 375, 1545-1555 (2010).
- Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E.
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