Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Essai in vitro pour évaluer l'impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

13.2K vues

⸱

DOI :

10.3791/50821

⸱

15 octobre 2013

 ,  ,  ,  , 
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un test in vitro pour étudier le rôle des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH.

Résumé

T épuisement cellulaire est un facteur important de la clairance de l'agent pathogène échoué au cours des infections virales chroniques. Voies immunorégulatoires, comme PD-1 et IL-10, sont régulés à la hausse sur cette exposition de l'antigène en cours et contribuent à la perte de la prolifération, de la fonction cytolytique réduite et altérée la production de cytokines par les cellules T CD4 et CD8. Dans le modèle murin de l'infection par LCMV, l'administration d'anticorps bloquants contre ces deux voies augmentée réponses des lymphocytes T. Cependant, il n'existe actuellement aucun test in vitro pour mesurer l'impact d'un tel blocus sur la sécrétion de cytokines dans des cellules à partir d'échantillons humains. Notre protocole et approche expérimentale nous permettent de quantifier avec précision et efficacité la restauration de la production de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH chez des sujets infectés par le VIH.

Ici, nous décrivons un modèle expérimental in vitro qui permet des mesures de la sécrétion de cytokines par les cellules spécifiques au VIH T CD4 et de leur impact sur ​​les autres cell sous-ensembles. Cellules T CD8 ont été épuisés de sang total et PBMC restantes ont été isolées par la méthode de séparation Ficoll. Les PBMC appauvries en CD8 ont ensuite été incubées avec des anticorps bloquants contre PD-L1 et / ou l'IL-10Rα et, après une stimulation avec une piscine de HIV-1 Gag peptide, les cellules ont été incubées à 37 ° C, 5% CO 2. Après 48 h, le surnageant a été recueilli pour l'analyse des cytokines par les tableaux et les perles culots cellulaires ont été recueillis pour chaque analyse phénotypique par cytométrie de flux ou de l'analyse de la transcription en utilisant la qRT-PCR. Pour une analyse plus détaillée, différentes populations de cellules ont été obtenues par l'épuisement sélective de sous-ensemble à partir de PBMC ou par tri en utilisant la cytométrie en flux avant d'être évalués dans les mêmes essais. Ces méthodes offrent une approche très sensible et spécifique pour déterminer la modulation de la production de cytokines par les cellules T auxiliaires spécifiques de l'antigène et de déterminer les interactions fonctionnelles entre les différentes populations de cellules immunitaires.

Introduction

Au cours des infections virales persistantes, les cellules-T spécifiques virus acquièrent des défauts fonctionnels dans un processus connu sous le nom T épuisement cellulaire. Au début des études in vivo dans le modèle de LCMV murin d'infection virale chronique ont indiqué que les cellules T spécifiques du virus épuisés ont réduit la fonction cytolytique contre les cellules infectées par un virus, perdent leur capacité à proliférer et à présenter une capacité réduite à produire des cytokines telles que l'IL-2, TNF- α et IFN-γ 1,2. Un réseau complexe de voies immunorégulateurs, tels que PD-1 et l'IL-10, sont régulés à la hausse au cours des infections chroniques et de contribuer à un dysfonctionnement des cellules T (revue dans 3,4). Administration in vivo d'anticorps bloquants contre ces voies inhibitrices chez la souris de LCMV modèle de fonction des cellules T spécifiques du virus épuisés et amélioré la clairance virale rétablie, ce qui indique que l'épuisement de cellules T est un phénomène partiellement réversible (revue dans 5).

Conclusions sur ee modèle de LCMV ont été rapidement étendu à des infections virales chroniques humaines telles que le VHB, le VHC et le VIH 5. Dans chronique par le VIH-1 infection, PD-1 et IL-10 sont régulés à la hausse dans les voies sujets infectés et en corrélation avec les paramètres de la progression de la maladie, directement avec la charge virale et inversement proportionnelle à la numération des CD4 8.6. Blocage des anticorps PD-1 ou l'IL-10 in vitro des voies restauré la prolifération des cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH, indiquant que, comme dans le modèle de la souris LCMV, T épuisement des cellules chez l'homme est un phénomène partiellement réversible. Toutefois, en raison de la nature délicate des expériences sur des échantillons humains ainsi que les limites de la sensibilité des tests in vitro, étude approfondie des profils de restauration fonctionnelle obtenus par ces interventions est frappante absent. Les tests de prolifération ont été, jusqu'à présent, le seul test fiable in vitro testé dans la plupart des études, mais il ya un manque remarquable de preuves sur l'impact de ces interventionsinterventions sur: 1) la capacité de destruction des cellules T cytotoxiques, 2) l'effet antiviral des lymphocytes T sur la réplication virale, 3) le profil de sécrétion des cytokines, et 4) l'effet sur CD4 aide des lymphocytes T sur d'autres sous-ensembles de cellules.

Coloration intracellulaire des cytokines (ICS) est un courant très utile et largement utilisé dosage basé sur une cytométrie qui est utilisé pour détecter la production de cytokines dans divers types de cellules chez les souris et les humains. Il a également été utilisé pour étudier l'effet de l'anticorps au blocage des voies inhibitrices. Dans les dosages de l'ICS, la sécrétion de cytokines est bloquée par l'addition de Brefeldin et / ou de monensin. Les cytokines piégées à l'intérieur des cellules sont ensuite détectés avec des anticorps fluorescents en utilisant la cytométrie en flux polychromatique. La durée de l'essai est généralement limité à 6 ou 12 h après la stimulation antigénique puisque les deux Brefeldin et monensine, qui sont typiquement ajoutés en 2 heures de l'addition de l'antigène, sont toxiques pour les cellules. Le dosage des ICS est une technique puissante qui a été i utilesn l'investigation de l'effet de l'administration in vivo d'anticorps de blocage intervention chez les souris où les cellules ont été extraites, après une certaine période de temps après l'exposition de l'anticorps 9. Cependant, il existe plusieurs limitations à l'application de cette approche expérimentale pour évaluer l'impact de blocage des récepteurs inhibiteurs dans les échantillons humains. Lors d'interventions d'anticorps de voies inhibitrices dans une stimulation 6 ou 12 heures in vitro (typiquement le cas avec des échantillons humains), le blocage des récepteurs inhibiteurs dans la plupart des cas, ne modifie pas la fréquence de la réponse des cellules T spécifiques de l'antigène, mesurée par des dosages de l'ICS standards 6, 7. Les mesures de la production de cytokines par des cellules, mesurée par l'intensité moyenne ou la médiane de fluorescence ont donné des résultats incohérents 6, 7, 10. D'autre part, lorsque ICS est effectuée à un point de temps après la fin de la stimulation (par exemple six jours), les changements dans le nombre de cytokine sécrétant caunes peuvent être observées. Les différences sont un effet combiné de la prolifération altérée, la survie et l'évolution de la fonction d'effecteur qui s'accumulent au cours de la période de temps spécifiée 6. Une façon de surmonter une partie de ces limitations est à incuber pendant de longues périodes de temps (par exemple 36 h, 60 h, etc.) Avec l'antigène avant l'ajout de l'inhibiteur de sécrétion des cytokines sans attendre à la prolifération de se produire. Nous avons utilisé avec succès cette méthode pour déterminer la cinétique de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 et CD8 spécifiques du VIH 11,12, mais cette approche n'est pas en mesure de détecter des réponses petites et ne donnera pas un résultat intégré de la sécrétion de cytokine totale survenant car la stimulation. Par conséquent, ICS n'est pas une méthode suffisamment sensible pour détecter l'impact de blocage des voies inhibitrices de la quantité de cytokines produites par les cellules T activées par rapport à la quantification de l'ARNm de cytokines ou des mesures de la sécrétion de cytokines dans le supernatant aux mêmes points dans le temps. En outre, la plupart des cytokines produites par les lymphocytes T activés agissent de façon autocrine, en contribuant à la rétroaction positive ou négative par une interaction avec des boucles de cellules présentatrices d'antigène. Par conséquent, l'addition de Brefeldin monensin ou au cours de l'essai de ICS empêche la sécrétion de cytokines et donc la stimulation des cellules T n'est pas optimale. Enfin, la détection de multiples cytokines avec ICS est limitée par la disponibilité d'anticorps et de la sensibilité pour la détection des cytokines avec la cytométrie de flux, ainsi que par des contraintes dans le nombre des fluorochromes qui peuvent être utilisés simultanément dans n'importe quel panneau donné.

Nous avons développé une approche très sensible in vitro expérimentale pour évaluer l'impact des voies immunorégulatoires dans la régulation de la sécrétion de cytokines par les cellules T CD4 spécifiques du VIH et par la suite CD4 aide à cellules présentatrices d'antigène (CPA) et les cellules tueuses naturelles (cellules NK). Cette méthode peut également être utilisée pour évaluer l'impact de blocus de molécules inhibitrices de la fonction des cellules T CD8 par épuiser les cellules de PBMC T CD4 ou en stimulant des peptides optimales reconnues uniquement par les cellules T CD8. Contrairement à intracellulaires dosages de cytokines de coloration, nous avons décidé de ne pas interférer avec la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T CD4 spécifiques du VIH afin d'être en mesure de: 1) réaliser une quantification plus précise des niveaux de cytokines produites; 2) étudier un panel plus large des cytokines ou des molécules effectrices, et 3) évaluer l'impact de cytokines produites par les cellules T CD4 spécifiques du VIH sur les autres sous-ensembles de cellules. On stimule CD8 PBMC déplétées avec une piscine Gag du VIH-1 de peptide, en présence d'anticorps bloquants pour la voie immunorégulateur d'intérêt. Après le temps désiré d'incubation, généralement 48 heures, nous recueillons les surnageants de mesurer la sécrétion de cytokines avec des tableaux de perles et de recueillir les culots cellulaires soit pour l'analyse phénotypique des différents sous-ensembles de cellules ou pour l'analyse de la transcription. De noter, à tson article 48, point de temps h, on ne détecte pas une population significative de la prolifération des cellules T 12. Il s'agit d'une approche souple et plusieurs adaptations de cette conception peut être appliquée pour répondre à différentes hypothèses. Par exemple, les sous-ensembles de cellules individuelles (telles que des cellules T CD4 spécifiques du VIH ou de PD-1 des cellules de haute T CD4, etc.) Peuvent être triées après 12 h d'incubation avant incubation supplémentaire pendant 36 heures puis on a recueilli les surnageants et les culots de cellules d'enquêter plus spécifiquement l'impact des interventions du blocus sur la sécrétion de cytokines par les sous-populations définies de CMSP.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Une. L'épuisement et l'isolement des PBMC par Ficoll séparation

  1. Épuiser les cellules T CD8 + en ajoutant humain CD8 + Depletion Cocktail à 50 ul / ml de sang entier.
  2. Bien mélanger et incuber pendant 20 min à température ambiante (18-25 ° C).
  3. Après incubation, mélanger le sang total avec HBSS (solution saline équilibrée de Hank sans Ca 2 + ou Mg 2 +) et couche sur Histopaque. Tourner à 340 rcf pendant 30 min (pas de frein, accélération lente).
  4. Recueillir les CMSP et transférer à une nouvelle conique de 50 ml. Laver 2 fois avec 45 ml de RPMI 1640 supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 1% de HEPES et en faisant tourner pendant 10 min à 340 rcf.

2. Blocus d'anticorps et de stimulation spécifique de l'antigène des cellules

  1. Resuspendre les cellules à 2x10 6 pour la condition dans un milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum humain supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% de HEPES,représentant 500 pi par état.
  2. Aliquote de 500 ul de suspension cellulaire par FACS tube.
  3. En fonction de la voie d'une enquête, ajouter PD-L1, l'IL-10Rα anticorps de blocage et / ou des contrôles isotypiques à 10 ug / ml et incuber pendant 15 min à 37 ° C, 5% CO 2.
  4. Stimuler les cellules avec une piscine de peptide Gag VIH-1 à 1 pg / ml / peptide concentration finale. Inclure aussi un contrôle "pas de stimulation" pour chaque condition de blocage. Incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 48 heures.

3. Collecte et analyse de surnageant

  1. Après 48 heures, centrifuger les tubes FACS pendant 7 minutes à 340 FCR.
  2. Recueillir soigneusement les 2 x 225 pi surnageant dans des tubes Eppendorf pour Luminex arrangements de billes sans perturber le culot.
  3. Inactiver les virus dans le surnageant recueilli avec 25 ul de 0,5% de PBS-Tween pour donner une concentration finale de 0,05% de PBS-Tween.
  4. Magasin recueillies surnageants qui ne sont pas immediately utilisé dans un congélateur à -80 ° C.
  5. Mesurer les concentrations de cytokines souhaitées en utilisant le kit Millipore Luminex selon le protocole du fabricant.

4. Collecte et Analyse phénotypique des cellules par cytométrie en flux

  1. Après avoir recueilli le surnageant, laver les cellules dans 3 ml de PBS. Spin cellules pendant 7 minutes à 340 FCR et décanter excès lavage.
  2. Teinture de viabilité en utilisant un kit portable de Stain mort Vivant / Mort peut être fixée selon le protocole du fabricant.
  3. Laver les cellules dans du PBS pendant 7 min à 340 rcf et à 4 ° C. Remettre en suspension dans 100 ul de PBS 1% de FBS.
  4. Si la coloration pour les monocytes ou d'autres cellules présentatrices d'antigènes, les récepteurs de Fc bloc en ajoutant 1,4 ul de réactif de blocage des FcR et vortex pour mélanger.
  5. Incuber pendant 10 min à 4 ° C.
  6. Ajouter les anticorps de surface, les vortex, et incuber pendant 20 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  7. Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS, décanter excès de lavage, et ajouter 200 ul paraformaldéhyde 4%. Incuberà la température ambiante pendant 20 min dans l'obscurité.
  8. Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS, remettre en suspension dans 250 ul de PBS 1% de FBS, et d'acquérir une multilaser cytomètre de flux (par exemple BD LSRII ou Fortessa).

5. Analyse des cellules par qRT-PCR

  1. Pour les cellules non analysé par cytométrie de flux: après la collecte de surnageant, lyser les cellules dans 300 ul de tampon RLT Qiagen contenant 1% de bêta-mercaptoéthanol. Si ce n'est pas en continuant avec le protocole, les cellules peuvent être congelées à -80 ° C après ce point.
  2. Isoler l'ARN en utilisant un kit d'isolement d'ARN en suivant le protocole du fabricant.
  3. Synthétiser un ADNc à partir d'ARN en utilisant un kit de synthèse d'ADNc en suivant le protocole du fabricant.
  4. Faire la PCR quantitative en utilisant la technologie SYBR Green.
  5. Création d'un mélange d'amorces pour chaque amorce utilisée, y compris des gènes domestiques (par exemple, IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) par l'addition d'amorces à la nucléase sans eau pour donner une concentration finale de 10uM. Garder sur la glace.
  6. Créer un mélange maître pour chaque amorce en ajoutant 10,5 pi d'eau sans nucléase, 12,5 pi SYBR vert, et 1 pi mélange d'amorces par plaque bien. Garder sur la glace.
  7. Pipette 24 ul mélange maître dans chaque puits de la plaque qui sera utilisé.
  8. Ajouter 1 ul d'ADNc à chaque puits selon modèle.
  9. Cap puits et la plaque de centrifuger 3 min à 800 rcf.
  10. Exécutez plaque sur une machine qRT-PCR, par exemple, un instrument Stratagene MX3005P.

6. Adaptation pour intracellulaire de cytokines coloration à 48 h

Ajouter Brefeldin monensin et 6 heures avant la coloration des cytokines intracellulaires. Brefeldin est ajouté à une concentration de 10 ug / ml tandis que la monensine est ajoutée selon les instructions du fabricant. Pour plus de commodité, la Bréfeldine peut être ajouté 12 heures avant la teinture, à une concentration de 5 pg / ml.

  1. Après coloration de surface, laver les cellules avec du PBS 1% de FBS et tache danscytokines intracellulaires telles que l'IL-12, IFN-γ et TNF-α en utilisant un kit de fixation / perméabilisation de solutions et de protocole.
  2. Laver les cellules, remettre en suspension dans 250 ul de PBS 1% de FBS, et fonctionner sur un multilaser cytomètre de flux (par exemple BD LSR II ou Fortessa).

7. Adaptation pour le tri des cellules

  1. 16 heures après la stimulation, la tache pour la viabilité cellulaire en utilisant le kit de Stain mort Vivant / Mort peut être fixée selon le protocole du fabricant. Gardez les cellules sur la glace durant la procédure entière.
  2. Laver les cellules avec du PBS pendant 7 min à 340 rcf et à 4 ° C. Remettre en suspension dans 100 ul de PBS 1% de FBS.
  3. Ajouter des anticorps de surface, vortex pour mélanger et incuber les cellules sur la glace dans l'obscurité pendant 20 min.
  4. Laver les cellules avec du PBS 1% de FBS à 340 rcf et à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul de milieu RPMI 1640 froid contenant 10% de sérum bovin foetal supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% HEPES.
  5. cellules de filtrage à l'aide de 5 ml Polystyrene Tube à fond rond avec bouchon Cell-passoire.
  6. Préparer des tubes de collecte pour trier par addition de 200 ul de milieu RPMI 1640 contenant 10% de sérum bovin foetal supplémenté avec 50 UI de pénicilline, 50 ug / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 1% de HEPES à chaque tube. Conservez tous les tubes sur la glace pendant le tri.
  7. Trier en direct les sous-ensembles de cellules d'intérêt sur ​​un instrument (par exemple BD FACS Aria II) situé dans un établissement équipé pour matières infectieuses.
  8. Après que les cellules ont été triées, place des cellules dans l'incubateur pour la durée souhaitée et suivre l'analyse collection surnageant / Luminex et d'analyse collecte de culot cellulaire / PCR.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Pour effectuer des mesures de cytokines en utilisant ce système in vitro, il est essentiel d'être capable de distinguer les réponses spécifiques de l'antigène par rapport au pas de commande de stimulation. En général, nous avons considéré que les réponses positives des valeurs de la stimulation antigénique qui donnent au moins trois fois plus dans les niveaux de cytokine par rapport au pas de commande de stimulation et qui étaient dans la plage linéaire du dosage. Nous utilisons sensibilité tableau de perles do...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

collecte de surnageant est une composante essentielle de cette conception expérimentale. Lors de la récolte des surnageants pour l'analyse Luminex, des aliquotes ont été établis et conservés à -80 ° C pour éviter la dégradation des protéines en raison de cycles gel-dégel. La congélation et la décongélation peut être processus rigoureux pour les protéines, et en minimisant gel-dégel, le signal sera maximisé dans les essais. Par conséquent, il est plus facile d'obtenir des données plus précises et reproductibles l...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Nous remercions Gordon Freeman pour fournir l'anticorps bloquant anti-PD-L1. Nous remercions le personnel clinique et de laboratoire à l'Hôpital général du Massachusetts et tous les participants à l'étude pour leur rôle inestimable dans ce projet.

Cette étude a été financée par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health (SP1 AI-080192; DEK), le coeur-poumon National and Blood Institute des National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK est soutenu par une bourse de carrière bourse de recherche du Fonds de recherche en santé du Québec (FRQS). FP est soutenu par une subvention de la communion de l'Assemblée générale Comité exécutif Hôpital Massachusetts sur la recherche et le Global Health Institute de Harvard (HGHI).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution saline équilibrée Hanks sans Ca2+ ou Mg2+SigmaH9394
RPMI 1640SigmaR0883
Histopaque-1077Sigma10771
Sérum humain ABGemini BioProducts100-512
Pénicilline/StreptomycineMediatech30 001 CI
L-glutamineMediatech25 005 CI
Tampon HEPESMediatech25060CI
Réactif bloquant FcR, humainMiltenyi130-059-901
RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail Stem Cell15663
LIVE/DEAD Kit de teinture de cellules mortes fixable, pour l’excitation UVInvitrogenL23105
Rneasy Mini KitQiagen74104
Improm-II Système de Transcription InversePromegaA3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master MixAgilent600830
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Perméabilisation Kit de SolutionBD554714
Tween-20FisherBP337100
IFN-γ ; amorceInvitrogenFOR : CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV : TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primerInvitrogenFOR : TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV : AGTGATGGCATGGACTGTGG

Références

  1. Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
  2. Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
  3. Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
  4. Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
  5. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
  6. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
  7. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
  8. Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
  9. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  10. Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
  11. Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
  12. Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
  13. Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Cellules T CD4 sp cifiques du VIHAnalyse de la s cr tion de cytokinesBlocage de PD 1Blocage d IL 10RS paration au FicollCytom trie en fluxR seau de billes LuminexAnalyse par qRT PCRPeptide Gag du VIHMarquage intracellulaire des cytokines
Essai in vitro pour évaluer l'impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.