Liaison covalente de BMP-2 sur les surfaces en utilisant une approche monocouche auto-assemblée

Résumé

Nous décrivons un procédé pour réaliser une immobilisation efficace de la BMP-2 sur les surfaces. Notre approche est basée sur la formation d'une monocouche auto-assemblée de réaliser la liaison de BMP-2 par l'intermédiaire de ses résidus amines libres covalente. Cette méthode est un outil utile pour étudier la signalisation à la membrane cellulaire.

Résumé

la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP-2) est un facteur de croissance incorporé dans la matrice extracellulaire du tissu osseux. BMP-2 agit comme déclencheur de la différenciation des cellules mésenchymateuses en ostéoblastes, stimulant ainsi la guérison et la formation osseuse de novo. L'utilisation clinique de l'humain recombinant BMP-2 (rhBMP-2), en liaison avec des échafaudages a soulevé controverses récentes, sur la base du mode de présentation et la quantité à délivrer. Le protocole présenté ici fournit un moyen simple et efficace pour délivrer la BMP-2 pour des études in vitro sur des cellules. Nous décrivons comment former une monocouche auto-assemblée constituée d'un segment de liaison hétérobifonctionnel, et on montre l'étape ultérieure de liaison pour obtenir une immobilisation covalente de rhBMP-2. Avec cette approche, il est possible d'obtenir une présentation prolongée de la BMP-2, tout en maintenant l'activité biologique de la protéine. En fait, l'immobilisation de la surface de la BMP-2 permet enquêtes ciblées en empêchant annonces non spécifiquesorption, tout en réduisant la quantité de facteur de croissance et, plus particulièrement, ce qui empêche la libération non contrôlée de la surface. Les deux à court et à long terme des événements de signalisation déclenchées par BMP-2 ont lieu lorsque les cellules sont exposées à des surfaces présentant immobilisé de manière covalente rhBMP-2, ce qui rend cette approche appropriée pour des études in vitro sur les réponses cellulaires à la BMP-2 stimulation.

Introduction

Une protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP-2) est un élément du facteur de croissance transformant (TGF-β) de la famille et agit comme inducteur de la formation de novo de l'os ainsi que la régulation de plusieurs tissus au cours du développement embryonnaire et adulte homéostasie ^3.1. Chaque monomère de l'homodimère protéine biologiquement active BMP-2 contient un motif "cysteine ​​de noeud", qui est hautement conservée dans toutes les PGB ^4. Six des sept résidus de cysteine ​​forment des ponts disulfure intramoléculaires qui stabilisent chaque monomère, tandis que le septième cysteine ​​est impliquée dans la dimérisation, la formation d'une liaison intermoléculaire entre les deux monomères ^5,6. Ce nœud de cysteine ​​hautement conservés définit la structure tridimensionnelle de la protéine BMP-2 et détermine ses propriétés uniques, telles que résistance à la chaleur, et des dénaturants acide pH ^7-9. BMP-2 se lie à la sérine / thréonine kinase des récepteurs transmembranaires, ce qui induit une transduction de signal ^{10 à 12. Selon le mode d'oligomérisation du récepteur, différentes voies de signalisation sont activés: une cascade de signalisation Smad-indépendante mène à la phosphatase alcaline de l'induction par l'intermédiaire de la signalisation de p38, tandis qu'une voie de Smad-dépendant activé par les résultats de la phosphorylation du récepteur à Smad translocation nucléaire complexe et l'activation de la transcription d' gènes cibles spécifiques, tels que l'inhibiteur de la différenciation (Id) de 12 à 14.}

Dans l'os, la BMP-2 induit la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes, stimulant ainsi la guérison et la formation de novo de l'os. Actuellement, exprimée par recombinaison BMP-2 est appliqué en clinique pour améliorer la guérison des sites fracturés. Une stratégie courante dans l'ingénierie tissulaire osseuse est l'utilisation de facteurs de croissance injectables, ce qui est moins invasive par rapport aux systèmes d'administration locale. Cependant, des études in vivo et des applications cliniques ont montré que la demi-vie biologique courte, loc non spécifiquelisation et domiciliation rapide de BMP-2 peut conduire à plusieurs problèmes locaux, ectopiques et systémiques ^15. Par conséquent, pour obtenir une présentation efficace, le piégeage ou l'immobilisation de la BMP-2 à l'intérieur ou sur des matériaux est nécessaire pour sa délivrance locale et prolongée au niveau du site cible. Une distribution prolongée peut être obtenue avec des approches de rétention de non-covalentes, telles que le piégeage physique, l'adsorption ou la complexation d'ions ^16. Cependant, il est connu que l'adsorption non spécifique de protéines sur les surfaces peut élément de dénaturation des molécules ^17. Pour la liaison des facteurs de croissance covalente, différents types de supports ont été développés au cours de la dernière décennie. L'utilisation de molécules de liaison bifonctionnels qui ciblent des groupes amino ou carboxyle de la protéine, par exemple, est un type d'approche qui ne nécessite pas nécessairement une modification de la protéine pour obtenir son immobilisation. En fait, tandis que la modification des protéines offre l'avantage de contrôler l'orientation de la protéine,l'introduction de domaines artificiels, des étiquettes et des chaînes peptidiques spécifiques à un site peut modifier l'activité biologique de facteurs de croissance ^17. Ainsi, pour contourner la dénaturation due à l'interaction avec le matériau de support, les surfaces peuvent être fonctionnalisés à l'avance, par exemple, avec une monocouche auto-assemblée (SAM) d'une molécule de liaison, suivie d'un couplage du facteur désiré ^18. Nous avons utilisé une approche fondée sur les SAM pour immobiliser de manière covalente BMP-2 sur une surface en ciblant ses résidus aminés libres et avons montré que la protéine immobilisée conserve à la fois son activité biologique à court et à long terme ^19. Ce protocole offre un moyen simple et efficace pour délivrer la BMP-2 dans des cellules pour des études in vitro sur les mécanismes qui se produisent à la membrane cellulaire et régulent la signalisation intracellulaire responsable de la signalisation ostéogénique.

Protocole

Une. Synthèse de 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide ester (NHS-MU)

1. Ajouter goutte à goutte une solution de 500 mg de N-hydroxysuccinimide et 30 mg de 4 - (diméthylamino) pyridine dans 10 ml d'acétone (PA) pour 1 g d'acide 11-mercaptoundécanoïque dans 40 ml de dichlorométhane (pa) à la température ambiante (RT).
2. Refroidir la réaction à 0 ° C et ajouter goutte à goutte 1,1 g de N, N '-dicyclohexylcarbodiimide dans 10 ml de dichlorométhane (sous atmosphère d'azote). Gardez la réaction à basse température pendant 1 heure puis mélanger à température ambiante jusqu'au lendemain.
3. Filtrer le précipité et le sécher sous pression réduite. On purifie le produit par Chromatographie éclair avec du benzène de pétrole et d'acétate d'éthyle (ap) dans un rapport de 1:1.

2. Préparation de couches d'or homogènes

1. Des lamelles de verre propres avec des lingettes de précision et soniquer les pendant 5 min dans une solution contenant un mélange 1:1 d'acétate d'éthyle (pa) et de méthanol (pa). Rinse substrats avec du méthanol et sèchent sous flux d'azote.
2. Placer les substrats de nettoyage dans le dispositif de revêtement par pulvérisation. Évacuer la chambre. Enlever la couche d'oxyde de chrome plus élevée à partir de la cible de chrome par pulvérisation cathodique pendant 60 sec. Placer les échantillons au-dessous de la poutre métallique et les enrober d'une couche de chrome de 10 nm, suivi par enrobage avec une couche d'or de 40 nm.

3. L'immobilisation de la surface de la BMP-2

1. Dissoudre MU-NHS dans du N, N-dimethlyformamide (DMF) à une concentration finale d'environ 1 mM et l'incubation des substrats d'or dans la solution MU-NHS à température ambiante pendant 4 heures sous atmosphère d'azote.
2. Surfaces soniquer dans le DMF pendant 2 min, rincer avec du DMF et MeOH et sèchent sous flux d'azote.
3. Préparer une solution stock de rhBMP-2 dans HCl stérile 4 mm avec une concentration de 100 pg / ml (aliquotes de conserver à -80 ° C). Pour les dilutions de travail (3,5 pg / ml), diluer la solution mère dans du PBS / NaCl (PBS contenant 1 M de NaCl) et undjust à pH 8,5, immédiatement avant utilisation.
4. Incuber les surfaces fonctionnalisées MU-NHS dans la solution de travail rhBMP-2 à 4 ° C pendant une nuit. Retirer surnageant d'incubation. Surfaces soniquer dans PBS / NaCl pendant 2 minutes et laver 3 fois avec PBS stérile / NaCl.

4. Caractérisation de surface

1. Pour bloquer l'adsorption non spécifique de l'anticorps, incuber les surfaces avec une BSA à 5% (p / v) dans une solution PBS pendant 1 heure à température ambiante, suivi d'une incubation avec un anticorps anti-BMP-2 (1:100 dans 1% (w / v ) solution de BSA / PBS) pendant 1 heure à température ambiante. Laver les surfaces deux fois avec du PBS et de traitement par ultrasons pendant 30 s.
2. Incuber les substrats avec un anticorps secondaire conjugué à HRP (1:1000 dans 1% (p / v) de solution de BSA / PBS) pendant 30 min à température ambiante, puis le laver deux fois avec du PBS.
3. Utilisez Ampliflu essai rouge pour mesurer l'activité enzymatique HRP à 570 nm avec un lecteur de plaque.

5. Analyse de l'activité biologique

1. Seed 1 x 10 ⁵ souris C2C12 myoblastes par puits dans 6 puits plates dans un milieu de croissance, consistant en un haut DMEM contenant du pyruvate de glucose supplémenté avec 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine et de les incuber pendant 24 heures à 37 ° C / 5% CO _2.
2. Affamer les cellules dans du DMEM sans sérum pendant 3-5 heures avant le semis sur les surfaces décorées avec BMP-2 immobilisé.
3. Pour l'enquête de court terme signalisation induction, remplacer le milieu par 200 ul DMEM sans sérum frais et placer les immobilisés BMP-2 surfaces au-dessus des cellules. La surface doit être manipulé avec des pincettes fines de pointe pour éviter les rayures.
4. Retirez délicatement la surface de et aspirer le milieu avec une pipette, laver les cellules deux fois avec du PBS. Procéder à l'analyse des réponses cellulaires.
5. Pour l'analyse de l'activité biologique à long terme, les cellules de la plaque sur les surfaces et leur culture à 37 ° C / 5% CO ₂ dans des conditions de sérum faible (2% de FBS) pendant six jours.

Résultats

Dans notre configuration, l'or a été choisi comme excipient car il fournit un système biologique non spécifique mais chimiquement accordable. En outre, l'application de monocouches auto-assemblage comporte de nombreux avantages: SAM adsorber spontanément par leurs «tête-groupes" sur les métaux et forment des monocouches avec quelques défauts, tandis que leurs groupes terminaux fonctionnels peuvent encore être modifiés. Ainsi, ils fournissent une plateforme pour adapter les propriétés de l'interface d'une manière encore ...

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons la préparation de surfaces fonctionnalisées avec bioactif rhBMP-2. Cette approche comporte deux étapes: 1) la formation initiale d'une monocouche d'auto-assemblage (SAM) d'un groupe de liaison bifonctionnel sur la surface d'or, 2) l'immobilisation covalente de la protéine de rhBMP-2. Dans des travaux antérieurs, nous avons validé la liaison efficace de l'agent de liaison bifonctionnel, et le facteur de croissance, et démontré que la surface immobilisée rhBMP-2 co...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
N-hydroxysuccinimide	Sigma-Aldrich	130672	;
4-(diméthylamino)pyridine	Sigma-Aldrich	522805	;
Acétone	AppliChem	A2282	;
Acide 11-mercaptoundécanoïque	Sigma-Aldrich	674427	;
Dichlorméthane	Merck	106050	;
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	D80002	;
Pétrole benzène	Merck		;
Lamelles en verre	Carl Roth	M 875	;
Acétate d’éthyle	AppliChem	A3550	;
Méthanol	Carl Roth	4627	;
N,N-diméthylformamide	Carl Roth	T921	;
rhBMP-2	R& D Systems	355-BM	Sans porteur, exprimé en E.coli
PBS	PAA	H15-002	;
NaCl	Carl Roth	HN00.2	;
Poly(diméthylsiloxane) (PDMS)	Dow Corning		;
Sylgard 184 kit élastomère de silicone	Dow Corning		;
Anti-rhBMP-2	Sigma	B9553	;
Chèvre anti-souris IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005	Anticorps secondaire
Ampliflu Red assay	Sigma	90101	;
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquide	Gibco	41966
Sérum de veau fœtal	Sigma	F7524	Filtré stérile, testé en culture cellulaire
Pen/Strep	Gibco	15140	;
Trypsine 0,05 % (1x) avec EDTA 4Na	Gibco	25300	;
Glycine (0,1 M)	Riedel-de Haë ; n	33226	;
IGEPAL CA-630 (1 %)	Sigma	I8896	Tampon de lyse (dosage ALP)19
Chlorure de magnésium (MgCl2)(1 mM)	Carl Roth	HNO3.2	;
Chlorure de zinc (ZnCl2) (1 mM)	Carl Roth	3533.1	;
p-nitrophénylphosphate (pNPP)	Sigma	S0942	Substrat de la phosphatase
Anti-mysine à chaîne lourde (CMH)	Études développementales Hybridoma Bank, Université de l’Iowa	MF20	Anticorps monoclonal
Alexa Fluor 488 Chèvre anti-souris	Invitrogen	A11001	;
DAPI	Sigma	D9542	;
Equipement
Ultrsonic (Sonorex Super RK 102H), Fréquence 35 kHz	BANDELIN electronic GmbH Co. KG&		nbsp ;
MED 020 Système de pulvérisation cathodique	BAL-TEC AG		Conditions de revêtement Cr : 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sec Au : 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Lecteur de plaques	Tecan		;