Enrichissement et purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d’antigènes de surface cellulaire à l’aide des anticorps monoclonaux TG30 et GCTM-2

Résumé

Nous décrivons l’utilisation des anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 pour la détection combinée des antigènes de surface cellulaire par l’intermédiaire du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’identification et l’enrichissement des cellules souches embryonnaires humaines vivantes (hESC) utilisant la sélection positive et également l’utilisation de la sélection négative pour purger hESCs d’une population mélangée de cellules.

Résumé

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) peuvent s’auto-renouveler indéfiniment in vitroet, avec les indices appropriés, peuvent être induites pour se différencier en potentiellement toutes les lignées cellulaires somatiques. Les dérivés différenciés de hESC peuvent potentiellement être utilisés dans les thérapies de transplantation pour traiter une variété de maladies cellulaires dégénératives. Cependant, les protocoles de différenciation hESC produisent généralement un mélange de types de cellules cibles et hors cible différenciés ainsi que de cellules indifférenciées résiduelles. Pour la traduction des dérivés hESC différenciés du laboratoire à la clinique, il est important de pouvoir distinguer les cellules indifférenciées (pluripotentes) et différenciées, et de générer des méthodes pour séparer ces populations. L’application sûre des types hESC-dérivés de cellules somatiques peut seulement être accomplie avec les populations cellules-libres de tige pluripotentes, car les hESCs résiduels pourraient induire des tumeurs connues sous le nom de teratomas après la transplantation. Vers cette fin, nous décrivons ici une méthodologie pour détecter la pluripotence associée aux antigènes de surface cellulaire avec les anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 via le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour l’identification des CSEh TG30 pluripotents^Hi-GCTM-2^Hi en utilisant la sélection positive. En utilisant la sélection négative avec notre méthodologie TG30/GCTM-2 FACS, nous avons pu détecter et purger les CSEh indifférenciés dans les populations subissant une différenciation à un stade très précoce (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Dans une autre étude, des échantillons pluripotents sans cellules souches de cellules TG30^Neg-GCTM-2^Neg différenciées sélectionnées à l’aide de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 n’ont pas formé de teratomes une fois transplantés chez des souris immunodéprimées, ce qui a soutenu la robustesse de notre protocole. D’autre part, le passaging consécutif médié par le TG30/GCTM-2 FACS du TG30^Hipluripotent enrichi -GCTM-2^Hi hESCs n’a pas affecté leur capacité à s’auto-renouveler in vitro ou leur pluripotence intrinsèque. Par conséquent, les caractéristiques de notre méthodologie FACS TG30/GCTM-2 fournissent un test sensible pour obtenir des populations hautement enrichies de hPSC comme intrants pour les tests de différenciation et pour débarrasser les hESC potentiellement tumorigènes (ou résiduels) des populations de cellules dérivées.

Introduction

Les CHP (CSEh) comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes d’origine humaine (CSEh). Le HPSC peut s’auto-renouveler indéfiniment dans des conditions de culture appropriées sans perdre sa capacité connue sous le nom de « pluripotence ». La pluripotence est définie comme le potentiel d’une cellule à se différencier en essentiellement n’importe quelle lignée cellulaire somatique, y compris les cellules représentatives de chacune des trois couches de cellules germinales embryonnaires. Le potentiel remarquable de l’hPSC fournit un moyen pour une grande variété d’applications cellulaires, y compris des options thérapeutiques. Par exemple, il existe des troubles impliquant la mort cellulaire et la dégénérescence, où la fonctionnalité normale des cellules dans le corps humain est compromise, comme dans l’insuffisance cardiaque, les blessures à la colonne vertébrale, le diabète, la maladie de Parkinson, certains cancers et d’autres pathologies cliniques. Les patients souffrant de ces conditions pourraient potentiellement être traités en transplantant des cellules somatiques saines et fonctionnelles qui ont été dérivées de l’hPSC en laboratoire. Cependant, les protocoles actuels de différenciation hPSC ne sont pas efficaces à 100% et donnent un mélange de types de cellules cibles et hors cible différenciés, ainsi que de hPSCs résiduels qui n’ont pas subi de différenciation, continuant plutôt à s’auto-renouveler^1-3. La présence même d’un petit nombre de hPSC dans un échantillon de cellules somatiques hPSC-dérivées destinées à la transplantation dans les patients constitue un risque clinique sérieux car ces cellules par leur nature inhérente pour former des tissus des trois couches germinales embryonnaires, pourraient potentiellement former in vivo un type de tumeur connu sous le nom de teratoma. Par conséquent, seules les populations de cellules cibles jugées exemptes de cellules souches pluripotentes peuvent être considérées comme sûres pour la transplantation chez les patients. Plusieurs approches ont été signalées pour réaliser potentiellement la purge des CSHS résiduelles après la différenciation (pour un examen, voir Polanco et Laslett⁴). Nous avons précédemment rapporté l’utilisation des anticorps monoclonaux TG30 (CD9) et GCTM-2 couplés au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour identifier les cellules souches pluripotentes et les distinguer des cellules subissant un stade précoce de différenciation dans les cultures de lignées^{hESC 5-7.}

L’un des avantages de l’utilisation d’anticorps pour détecter les antigènes de surface cellulaire est que les cellules cibles sont généralement viables après la liaison et/ou le marquage des anticorps. Par conséquent, les cellules cibles peuvent être collectées après le marquage des anticorps et reculture pour l’expansion et d’autres applications avant la transplantation. Une mise en garde pour les antigènes de surface cellulaire exprimés sur hPSC est qu’ils ne sont pas exclusifs au stade pluripotent et sont dans de nombreux cas ré-exprimés temporellement pendant le développement et seront donc détectés dans certains types de cellules différenciées. Par conséquent, si l’objectif est d’utiliser des anticorps pour détecter des cellules pluripotentes humaines et les purger d’un échantillon de cellules dérivées de l’hPSC, les anticorps sélectionnés ne devraient pas également réagir avec des antigènes sur les types de cellules différenciés spécifiques destinés à la transplantation. Malheureusement, il existe un nombre limité d’anticorps qui détectent les marqueurs de surface cellulaire sur les hPSCs ^{vivants 4}, ce qui limite les options de sélection. En outre, quelques études ont souligné que la détection d’un seul marqueur de surface cellulaire n’est pas suffisante pour éliminer toutes les HPSC, suggérant que toute tentative d’éliminer toutes les sous-populations pluripotentes hPSC devrait s’appuyer sur des méthodes qui utilisent deux anticorps ou plus détectant différents épitopes exprimés par hPSCs ^9-10. Comme mentionné ci-dessus, seules les cellules dérivées du CHSP qui pourraient être déterminées comme des populations de cellules souches pluripotentes exemptes de cellules sont appropriées pour la transplantation humaine. Atteindre ce niveau de rigueur peut ne pas être atteint avec un seul passage à travers une technologie de tri cellulaire à médiation anticorps. La reculture de la population enrichie de cellules cibles différenciées et les cycles ultérieurs de tri cellulaire peuvent être nécessaires pour obtenir définitivement des échantillons pluripotents sans cellules souches.

Dans notre laboratoire, nous avons largement caractérisé deux anticorps hES de surface cellulaire, TG30 (CD9) et GCTM-2, pour la détection de cellules pluripotentes vivantes. Nos études ont montré que la détection combinée de TG30 et GCTM-2 est fortement corrélée avec l’expression de gènes associés à la pluripotence canonique dans les lignées hESC ^5-7. L’immunoprofilage TG30/GCTM-2 FACS a constamment montré que les cultures hESC constituent un gradient continu quantitatif de l’expression TG30/GCTM-2 ^5-7. Nous avons arbitrairement établi quatre populations (P) de cellules dans ce gradient TG30/GCTM-2 : P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)et P7 (TG30^Hi-GCTM-2^{Hi) 5-7.} Notre caractérisation de ces populations de cellules P4, P5, P6 et P7 a montré que les sous-fractions P6 et P7 expriment un grand nombre de gènes associés à la pluripotence et forment efficacement des colonies en forme de tige lorsqu’elles sont recultured post-FACS ^2-3. D’autre part, les cellules P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)expriment un grand nombre de marqueurs de différenciation et constituent les types de cellules spontanément différenciés qui se produisent généralement dans les cultures en expansion des lignées hESC ^5-6. Nous avons décidé de tester la potentialité de notre FACS TG30/GCTM-2 pour l’élimination sélective des hPSCs résiduels suite à une différenciation précoce, et aussi pour l’enrichissement des populations de cellules souches pluripotentes. Le protocole décrit ci-dessous montre comment collecter et reculturer des cellules P4 différenciées (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)post-FACS pour accomplir la purge de P7 pluripotent (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). En outre, nous expliquons également la collecte et la reculture de cellules pluripotentes P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)pour obtenir une culture enrichie de cellules pluripotentes, qui pourraient ensuite être utilisées comme population d’entrée définie pour augmenter potentiellement l’efficacité et la cohérence des tests de différenciation.

Protocole

Le protocole suivant a été réalisé à l’aide de cultures en vrac standard hESC-MEL1¹¹ fournies par l’installation StemCore de l’Université Monash (Melbourne). Cette lignée cellulaire est systématiquement cultivée sur une couche de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) inactivés mitotiquement dans des milieux hESC/KOSR complétés par bFGF⁷ et est maintenue avec dissociation enzymatique (collagénase) tous les 5-7 jours^8. Les cultures de cseh cultivées à une confluence d’environ 80 % dans des fioles de 75 cm² (T75) sont utilisées comme populations d’entrée pour ce protocole. Toutes les procédures de manipulation cellulaire décrites ci-dessous doivent être effectuées dans des conditions aseptiques dans une enceinte de biosécurité de classe II filtrée par HEPA.

Deux jours avant d’effectuer un essai TG30/GCTM-2 FACS, préparer les plaques de culture T75 (décrites à la section 1) qui doivent être utilisées pour la reculture des cellules récupérées après le FACS (décrites à la section 4).

1. Ensemencement des CMF et préparation du milieu conditionné par le MEF

1.1 JOUR -2: Placage des CGEM dans des fioles T75

1. Pipetter 10 ml de gélatine à 0,1 % p/v dans chaque fiole T75 et incliner la surface uniformément.
2. Incuber pendant 30 min à température ambiante dans une armoire de biosécurité.
3. Aspirer la solution de gélatine.
4. Ajouter 20 ml de milieu MEF dans le ballon et pré-équilibrer à 37 °C/5 % de_CO2 pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire.
5. Plaque mitotiquement inactivée MEFs sur fiole(s) préparée(s) aux densités suivantes. Pour 1/3 MEF densité graine 1,4 x 10⁴ cellules/cm² (T75= 1 x 10⁶ MEF). Pour les semences MEF pleine densité 5,3 x 10⁴ cellules/cm² (T75 = 4 x 10⁶ MEF).

Remarque: Nous utilisons par habitude les MEFs qui ont été mitotically inactivés par γ-irradiation. Un protocole pour la préparation des CMF irradiés par γ se trouve dans Michalska^12.

6. Incuber les cultures de MEF irradiées à 37 °C/5 % de_CO2 pendant la nuit. Les fioles 1/3 peuvent être incubées pendant 1-4 jours sans changement mef-moyen. Ces fioles sont utilisées pour la reformulation des cellules post-FACS (comme dans le protocole 4). Les fioles pleines de MEF sont incubées pendant la nuit pour générer du CM comme suit à l’étape 1.2 ci-dessous.

1.2 JOUR -1: Préparation du milieu conditionné par le MEF (CM)

1. Aspirer le milieu MEF à partir de fioles T75 pleines de MEF.
2. Ajouter un milieu hESC/KOSR prééquilibré de 25 ml complété par 5 ng/ml de FGF-2 humain par fiole T75. Incuber à 37 °C/5 % de_CO2 pendant 24 heures.
3. Recueillir le milieu conditionné par le MEF (CM) dans un tube de culture de tissu stérile, compléter fraîchement le CM avec 10 ng/ml de FGF-2 humain et filtrer à l’aide d’un filtre en polyéthersulfone de 0,22 μm.
4. Pour produire un CM supplémentaire, répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 quotidiennement sur la même culture MEF pendant une semaine.

Le jour de l’exécution d’un essai TG30/GCTM-2, remplacer le milieu MEF dans des fioles T75 1/3 MEF par du CM et pré-équilibrer pendant au moins 30 min avant d’ensemencer les CSEh ou les cellules dérivées du CSEh récupérés de la procédure décrite ci-dessous. Le CM est utilisé frais ou conservé à 4 °C jusqu’à 2 semaines. Cm est utilisé dans ce protocole car dans nos mains il augmente la viabilité des cellules post-FACS par rapport aux milieux non conditionnés (résultats non montrés).

2. Exécution d’un test FACS TG30/GCTM-2 : Dissociation de cultures en vrac de cseh en cellules individuelles

Remarque : Prechill 20 % FBS/DMEM-F12 milieu à 4 °C.

1. Aspirer le support hESC/KOSR à partir de deux fioles T75 avec une ligne hESC cultivée.
2. Rincer les cellules de chaque T75 avec 10 ml de DPBS et aspirer à les éliminer.
3. Ajouter 3 ml de solution de dissociation TrypLE Express dans chaque fiole T75. Incuber à 37 °C/5 % de_CO2 pendant 5 min.
4. Heurter le côté des fioles pour obtenir un délogement complet des cellules. Vérifier au microscope. Si les cellules ne se délogent pas facilement, incuber pendant encore 2-3 min à 37 °C/5 % de_CO2.
5. Ajouter 10 ml à 20 % de FBS/DMEM-F12 (maintenus à 4 °C) dans chaque fiole T75. À l’aide d’une pipette stérile de 10 ml, triturer doucement les cellules dissociées plusieurs fois contre la paroi du ballon pour obtenir une suspension principalement unicellulaire.
6. Placer une passoire cellulaire de 70 μm sur un tube stérile en polypropylène de 50 ml. Utilisez une pipette stérile de 10 ml pour forcer les suspensions monocellulaires hESC regroupées à partir des deux fioles T75 à travers la passoire.
7. Jetez la passoire cellulaire, remplacez le couvercle du tube et centrifugez la suspension hESC en commun à 1 000 x g pendant 2 min.
8. Jeter le surnageant et laver les cellules en remettez doucement le culot dans 10 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C).
9. Effectuer une deuxième centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min.
10. Jeter le surnageant, ajouter 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (préchilled à 4 °C) et triturer doucement pour ressusciter les cellules. Placez le tube de 50 ml sur de la glace. Ce tube sera utilisé pour la procédure d’immunomarquage de l’échantillon de tri décrite ci-dessous.
11. Prendre 20 μl de la suspension monocellulaire hESC (étape 2.10) pour compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Vous devriez vous attendre à un rendement de 10-15 millions de cellules par flacon T75.

Remarque: Fbs est employé dans cette partie du protocole pour augmenter la viabilité de cellules post-FACS.

3. Coloration immunofluorescente des antigènes de surface cellulaire TG30 et GCTM-2

1. Aliquote de 150 μl (~100 000 cellules) d’une suspension monocellulaire hESC (à partir de l’étape 2.11) dans chacun des six tubes microcentrifugés de 1,5 ml. Ces six aliquotes seront utilisées pour les contrôles de coloration nécessaires à l’étalonnage de l’essai sur la machine FACS. La suspension cellulaire restante d’environ 9 ml sera votre échantillon de tri dans lequel la culture dissociée sera cosinté pour la détection de TG30 et GCTM-2, selon les tableaux 1 et 2.
2. Effectuer des réactions de liaison des anticorps primaires dans 20% FBS/DMEM-F12. Les volumes de réaction finaux doivent être d’environ 9 ml pour l’échantillon de tri et de 200 μl pour les témoins. Inclure les témoins d’isotypes comme anticorps primaires. Placez les tubes horizontalement sur la glace et mélangez doucement pendant 30 min sur une plate-forme à bascule.
3. Centrifuger les réactions d’anticorps primaires à 1 000 x g pendant 2 min.
4. Jetez le surnageant et lavez les cellules en ressuscitant le culot dans 20 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C) pour l’échantillon de tri et 200 μl pour les contrôles.
5. Effectuer un deuxième tour à 1 000 x g pendant 2 min.
6. Effectuer des réactions de liaison d’anticorps secondaires dans 20% FBS/DMEM-F12. Les volumes de réaction finaux doivent être de 2,5 ml pour l’échantillon de tri et de 200 μl pour les témoins. Préparez le tube de réaction PE-anti-souris CD90.2 à ce stade. Placez les tubes horizontalement sur la glace et mélangez doucement pendant 30 min sur une plate-forme à bascule.

Remarque: Pendant cette période d’incubation, il est pratique de collecter le CM et de préparer 1/3 de fioles MEF T75 avec du CM comme dans la section 1.2.

7. Centrifuger les réactions d’anticorps secondaires à 1 000 x g pendant 2 min.
8. Jeter le surnageant et laver les cellules DEUX FOIS en ressuscitant le culot dans 20 ml 20% FBS / DMEM-F12 (préchilled à 4 ° C) pour l’échantillon de tri et 200 μl pour les contrôles.
9. Effectuer un spin à 1 000 x g pendant 2 min après chaque lavage et placer des tubes sur de la glace.
10. Jeter les surnageants et les pastilles cellulaires remises en suspension dans 20 % de FBS/DMEM-F12 complétés par de l’iodure de propidium (IP) à 0,3 μg/ml. Utilisez 2-3 ml pour l’échantillon de tri et 300 μl pour les contrôles.

Remarque: NE PAS ajouter PI au tube de commande avec des cellules non colorées.

11. Utilisez une micropipette P1000 pour forcer chaque suspension cellulaire individuelle à travers une passoire de cellule de couvercle de 35 μm, couplée à des tubes à essai ronds en polystyrène à tube de 5 ml.
12. Centrifuger à 50 g/min pour forcer à travers la suspension cellulaire résiduelle sur les couvercles de la crépine.
13. Ressusciter chaque suspension à cellule unique en tapotant les côtés des tubes et la placer sur de la glace. Vos cellules sont maintenant prêtes pour le FACS. Je vous en prie, continuez tout de suite.

4. Culture post-FACS de cellules de subfraction TG30/GCTM-2 dans des fioles de 75 cm² (T75)

1. Nous avons précédemment rapporté comment mettre en place une machine FACS pour l’immunoprofilage TG30 /^{GCTM-2 7}. La procédure permet la récupération de css uniques viables, exempts de CEM, et à l’intérieur des portes de P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)et P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)- voir figure 1E. Configurez la machine FACS pour le FACS TG30/GCTM-2 comme dans notre rapport précédent pour récupérer les sous-propriétés cellulaires à utiliser ensuite.
2. Ajouter 1 ml de CM, préparé comme à l’étape 1.2, à chacun des deux tubes à essai ronds de fond en polystyrène de 5 ml avant de prélever les cellules de la machine FACS. Placer sur la glace.
3. Récupérez 400 000 cellules chacune à partir de sous-fractions de cellules P4 différenciées (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)et pluripotentes P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)à l’aide de TG30/GCTM-2 FACS.
4. Centrifuger les tubes de collecte à 1 000 x g pendant 5 min.
5. Aspirez les surnageants. Ajouter 1 ml préquilibré à 37 °C/5 % de_CO2 CM pour ressusciter chaque pastille cellulaire à l’aide d’un micropipettor P1000. Ensemencer les cellules de chaque fraction sur une fiole prééquilibrée de 1/3 MEF T75 avec cm (préparée conformément à l’étape 1.2)
6. Culture à 37 °C/5 % de_CO2 pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire.
7. Aspirer le CM tous les jours et le remplacer par du CM fraîchement préparé (comme à l’étape 1.2) pendant environ deux semaines. Les cultures de cellules P7 pluripotentes (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)montrent des colonies humaines ressemblant à des tiges après une semaine et atteignent une confluence d’environ 80% à 9-11 jours. Les cultures de cellules P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)se développent principalement comme une pelouse de cellules ressemblant à des fibroblastes qui atteint la confluence à 11-13 jours. À ce stade, si nécessaire, les cultures cellulaires P4 et P7 peuvent être utilisées pour la reculture consécutive médiée par TG30/GCTM-2 FACS de sous-propriétés P4 ou P7 (voir les figures 2 et 3).

Résultats

Les dérivés hESC qui sont exempts de cellules souches pluripotentes peuvent être obtenus par passaging consécutif de cellules de la sous-fraction P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg).

Des rapports précédents ont établi que dans les cultures standard hESC coexistent un mélange de sous-populations présentant un gradient d’expression de gènes associés à la pluripotence^5,6,13. La détection combinée d’antigènes de surface cellulaire comme TG30 (CD9) et GCTM-2 permet la discrimination d’un certain nombre de sous-ensembles de cellules au stade pluripotent et à divers stades de différenciation précoce, comme l’indique leur expression de marqueurs de cellules souches et de facteurs de transcription spécifiques à la lignée^5,6,13. En accord avec les rapports précédents, nous avons pu distinguer les cellules P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)et P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)dans la ligne hESC-MEL1 utilisée pour cette étude(figure 1). Avec ce résultat, nous avons procédé à la collecte différenciée P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)cellules et pluripotent P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)cellules pour la culture ultérieure dans les études décrites ci-dessous.

Nous avons étudié si, en utilisant une approche de sélection négative, nous pouvions purger les CSEh indifférenciés des populations cellulaires subissant une différenciation à un stade très précoce (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Nous avons utilisé un nombre défini de cellules P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)qui ont été successivement cultivées post-FACS(figure 2A)pendant environ deux semaines, et réanalysées à l’aide de TG30/GCTM-2 FACS avant de replater à chaque passage. Les résultats ont montré que la P4-subfraction enrichie pour TG30^Neg-GCTM-2^Neg différenciait les types de cellules après passaging consécutif, et une présence mineure de cellules P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)au passage initial(Figure 2A,Passage 1) a finalement disparu après un nouveau passaging, devenant des échantillons pluripotents sans cellules souches(Figure 2A,Passage 3).

L’enrichissement des cellules hESC pluripotentes peut être réalisé par la collecte des cellules TG30^Hi-GCTM-2^{Cellules Hi.}

Sur la base d’observations antérieures utilisant ce test, nous nous attendrions à un enrichissement des CSEh pluripotents en collectant des cellules P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)qui devraient former des colonies de CSEh. Par conséquent, nous avons également étudié le passaging consécutif facs-négocié par TG30/GCTM-2 des cellules pluripotentes P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Dans ces cultures P7, TG30/GCTM-2 FACS immunoprofiling a été exécuté avant de replating des cellules à chaque passage et seulement des cellules P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)ont été recultured. De cette façon, nous avons observé que la majorité des cellules étaient situées dans les sous-fractions associées à la pluripotence (P6 et P7), indiquant un enrichissement des cellules pluripotentes qui maintenaient également une capacité à différencier et à générer un petit pourcentage de cellules P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)(Figure 3A). En outre, les cultures de cellules P7 ont montré un grand nombre de colonies de type hESC pendant le passaging(figure 3B),indiquant également le maintien de l’état de pluripotence.

Figure 1. Stratégie de tri représentative pour obtenir des sous-fractions FACS TG30/GCTM-2. (A): Les suspensions de cellules hES dissociées sont triées comme des cellules simples et les touffes ou doublets potentiels sont fermées avec la dispersion vers l’avant pour la hauteur et la surface (FSC-H et FSC-A). (B) : Les débris potentiels sont éliminés avec FSC-A et SSC-A, et seules les cellules intactes sont triées. C) : Les cellules non viables sont exclues en fonction de la fluorescence de l’iodure de propidium (PI) (FSC-A et FL3-A). (D) : Des cellules d’alimentation de MEF ont été fermées par sélection négative basée sur l’expression de cd90.2-PE de souris (FL2-A et SSC-A). (E) : La fraction hESC viable isolée, exempte de mangeoires MEF, est finalement fractionnée en sous-populations P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)et P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). La porte négative (TG30^Neg-GCTM-2^Neg,nommée P4) a été réglée en fonction de l’autofluorescence de fond pour les cellules non souillées et également des contrôles d’isotype. (F) : Pourcentages des différentes sous-populations fermées typiques d’une analyse cytométrique en flux TG30/GCTM-2. Cliquez ici pour agrandir la silhouette.

Figure 2. Cultures consécutives représentatives de cellules P4 spontanément différenciées (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)de la ligne hESC-MEL1. (A) : Graphiques facs représentatifs TG30/GCTM-2 montrant des sous-ensembles de cellules fermées (P4, P5, P6 et P7) discriminés par le niveau d’expression détecté des marqueurs de surface cellulaire TG30 et GCTM-2. Une population initiale de 400 000 dérivés hESC présentant une immunoprofilage P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)est recueillie à partir de cultures en vrac de la lignée hESC-MEL1. Ces cellules P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)sont successivement passageées post-FACS dans des conditions favorables au renouvellement du cseh dans les fioles T75, jusqu’à atteindre la confluence (11-13 jours). Avant chaque passage, le FACS TG30/GCTM-2 est effectué pour collecter et reculturer uniquement les types de cellules différenciés P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). (B) : Morphologie typique de la pelouse des cellules différenciées P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)après 14 jours. C) : Des colonies sporadiques de type hESC vues après 14 jours mélangées à la pelouse des cellules P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)au passage 1 seulement, sont très probablement générées par la contamination des cellules P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Barre d’échelle = 200 μm. Cliquez ici pour agrandir la silhouette.

Figure 3. Les cellules P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)dérivées de raies hESC peuvent être successivement passées post-FACS sans perdre leurs propriétés pluripotentes intrinsèques. Immunoprofilage représentatif TG30/GCTM-2 FACS des différents passages consécutifs, montrant les sous-ensembles discriminés de cellules (P4, P5, P6 et P7) selon le niveau d’expression de TG30 et GCTM-2. (A) : Une population de départ de 400 000 cellules montrant des caractéristiques P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)est récupérée à partir de cultures en vrac de la lignée hESC-MEL1. Les cellules P7 pluripotentes (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)sont successivement croisées après facs dans des conditions favorables au renouvellement de la CSEh dans les fioles T75, jusqu’à atteindre une confluence d’environ 80 % (9 à 11 jours). L’immunoprofilage TG30/GCTM-2 FACS est effectué avant de replater les cellules à chaque passage et seules les cellules P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)sont recultures. Les résultats montrent que les cellules P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)conservent leurs caractéristiques pluripotentes avec un passaging ultérieur, y compris la conservation de l’expression (TG30^Hi-GCTM-2^Hi),formant des colonies de type hESC (montrées en B)et maintenant la capacité de différencier comme on peut le déduire de la récapitulation d’une petite fraction de P4 différencié (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)dans chacun des gradients FACS. Barre d’échelle = 200 μm. Cliquez ici pour agrandir la silhouette.

Échantillon (volumes de réaction)	Anticorps primaires	Anticorps secondaire	PE Rat Anti-Souris CD90.2 b	Iodure de propidium c
Échantillon de tri (~ 9 ml pour les ABs primaires, 2,5 ml pour les ABs secondaires)	(TG30 + GCTM-2) a	AF 488 chèvre anti-souris IgG2a + AF 647 chèvre anti-souris IgM	+	+
Témoin 1 : TG30 (200 μl)	TG30	AF 488 chèvre anti-souris IgG2a	-	+
Témoin 2 : GCTM-2 (200 μl)	GCTM-2	AF 647 chèvre anti-souris IgM	-	+
Contrôle-3 : CD90.2 anti-souris (200 μl)	-	-	+	+
Témoin 4 : Phycoérythrine (EP) (200 μl)	Isotype IgG2a de souris	R-phycoérythrine chèvre anti-souris IgG2a	-	+
Contrôle 5 : Isotype de l’immunoglobuline de souris (200 μl)	Isotype IgG2a de souris + isotype IgM	AF 488 chèvre anti-souris IgG2a + AF 647 chèvre anti-souris IgM	-	+
Témoin 6 : Cellules non colorées (200 μl)	-	-	-	-

Tableau 1. Exemple de tri et contrôles pour le tri FACS. ^a L’échantillon de tri est immunostained simultanément avec des anticorps TG30 et GCTM-2. ^b PE-anti-souris CD90.2 est utilisé pour reconnaître les cellules de souris et supprimer les MEF des hESCs au cours de FACS^{14. c} Les cellules non viables sont exclues à l’aide d’iodure de propidium à une concentration finale de 0,3 μg/ml. Réactif ajouté (+), non ajouté (-) au tube de réaction.

anticorps	hôte	Isotype	Dilution de travail
TG30 (1,4 mg/ml)	souris	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (hybridome surnageant)	souris	Igm	1:5 ~ 1:10 a
AF 488 chèvre anti-souris IgG2a	chèvre	Polyclonale	1:500
AF 647 chèvre anti-souris IgM	chèvre	Polyclonale	1:500
R-phycoérythrine (PE) chèvre anti-souris IgG2a	chèvre	Polyclonale	1:1,000
CD90.2 anti-souris	rat	IgG2b	1:100
Souris purifiée IgG2a, κ Contrôle d’isotype	souris	IgG2a	1:200
IgM de souris purifiée, κ Contrôle d’isotype	souris	Igm	1:200

Tableau 2. Détails et dilutions d’anticorps pour le tri FACS. ^a En raison de l’expression extrêmement très élevée de GCTM-2 sur la surface cellulaire des CSEh, il n’est pas possible d’atteindre la saturation avec cet anticorps. Chaque lot de surnageant d’hybridome GCTM-2 doit être titré par rapport à un témoin standard ou à un lot précédent afin d’obtenir des résultats similaires avec des CSEh à l’échelle et d’éviter les taches excessives.

Nom du support	composition
hESC/KOSR moyen	Milieu Eagle modifié de Dulbecco: Mélange de nutriments F-12 (DMEM / F-12) complété par 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Acides aminés non essentiels, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ ml facteur de croissance des fibroblastes humains 2 (FGF-2) et Pen / Strep à 1x.
Milieu MEF	Le produit Modified Eagle Medium, high glucose (DMEM) de Dulbecco complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de GlutaMAX et Pen /Strep à 1x.

Tableau 3. Composition des milieux de culture.

Discussion

Dans le contexte clinique, les types de cellules somatiques différenciés sont le produit final souhaité pour la transplantation et les applications thérapeutiques, et les hPSC sont une source auto-renouvelée et évolutive pour générer ces cellules somatiques ou leurs progéniteurs en laboratoire. La présence de CSEh indifférenciés résiduels avec un potentiel inhérent pour la formation de tératome est un risque pour la sécurité en considérant les cellules somatiques hESC-dérivées pour la transplantation dans les patients. Pour un examen de ce risque et d’autres risques associés à la thérapie cellulaire, veuillez consulter Sharpe et coll. ¹⁶ Par conséquent, pour réaliser de telles applications, il est impératif que les chercheurs visent à générer des populations de cellules cibles qui sont également exemptes de cellules souches pluripotentes. À cette fin, nous démontrons ici qu’en utilisant notre méthodologie FACS TG30/GCTM-2, il est possible de surveiller la présence de cellules pluripotentes (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)dans une population de cellules différenciantes et d’obtenir des dérivés viables différenciés par hESC qui peuvent être enrichis et recultures post-FACS. Bien qu’il ne soit pas possible d’obtenir des échantillons 100% sans cellules souches pluripotentes avec un seul passage de notre protocole, les dérivés hESC enrichis peuvent être recultured et après un passaging consécutif 100% pureté des cellules somatiques est atteint. La viabilité démontrée des cellules somatiques pour l’expansion post-FACS permet également potentiellement la production d’un nombre adéquat de cellules adaptées aux thérapies de transplantation potentielles.

Les résultats encourageants de cette étude pilote nous ont incités à effectuer une enquête plus complète en utilisant notre protocole TG30/GCTM-2 dans une étude comparative avec plusieurs lignées de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC)^15. Dans cette étude, nous avons constaté que les échantillons sans cellules souches pluripotentes obtenus à l’aide de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 ne généraient pas de tératomes lorsqu’ils étaient transplantés chez des souris privées d’immunité. Par conséquent, nous pouvons affirmer avec confiance qu’avec l’utilisation de ce protocole in vitro, les cultures cellulaires de différenciation à un stade précoce déterminées comme étant exemptes de cellules pluripotentes TG30 Hi-GCTM-2^Hi ne développent pas de teratomas in vivo. Cela soutient fortement la robustesse de notre test, fournissant une approche potentielle pour éliminer le risque de formation de tératomes avant l’utilisation de cellules dérivées de hPSC dans des applications cliniques.

A l’inverse, nous montrons également que le test FACS TG30/GCTM-2 peut être utilisé pour récupérer une populationcellulaire pluripotente avec un niveau d’expression élevé de ces deux antigènes de surface (TG30 Hi-GCTM-2^Hi). Des études antérieures ont montré que les cellules TG30^Hi-GCTM-2^Hi présentent la corrélation la plus élevée avec^{l’expression de l’oct4 hi} et forment le plus grand nombre de colonies de type hESC^5,6,13,15. Nous pensons donc que le réseau de pluripotence estactivé à ses niveaux maximaux dans les cellules exprimant TG30 Hi-GCTM-2^Hi. Nous considérons que l’utilisation de notre protocole FACS TG30/GCTM-2 et la récupération des cellules P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)pourraient permettre une purification à grande échelle des cultures hESC vivantes enrichies, en tant qu’entrées dans les tests de différenciation.

En conclusion, nous démontrons ici la potentialité de nos essais FACS basés sur l’expression combinée des antigènes de surface TG30 et GCTM-2 pour la purge et l’enrichissement des cseh. Les études futures avec des protocoles pour la différenciation dirigée des hPSCs sont susceptibles d’être également informatives concernant cette potentialité. Nous sommes conscients que dans certains essais où les dérivés hESC différenciés expriment temporellement TG30 (CD9) ou GCTM-2, ces deux anticorps pourraient ne pas être appropriés ou suffisants pour purger les cellules pluripotentes d’une population différenciée à un moment donné dans l’essai^6. Par conséquent, il existe un besoin continu de trouver de nouveaux anticorps qui reconnaissent spécifiquement les CSEh vivants pour surmonter la limitation possible de la réaction croisée avec certains types de cellules différenciées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Nom long : Dulbecco’s Modified Eagle Medium :Mélange de nutriments F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Nom long : Knockout Serum Replacement
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Nom long : GlutaMAX
supplement Nonessential Amino Acids	Life Technologies	11140050	Nom long : MEM Solution d’acides aminés non essentiels
Mercaptoethanol	Life Technologies	21985023	Nom long : 2-Mercaptoethanol
DPBS	Life Technologies	14190250	Nom long : Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, sans calcium, sans magnésium
TrypLE Express	Life Technologies	12604039	Nom long : TrypLE Express (1x), sans rouge de phénol
AF-488	Life Technologies	A21131	Nom long : Alexa Fluor 488 chèvre anti-souris IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	Nom long : Alexa Fluor 647 chèvre anti-souris IgM
PE-anti IgG2a	Life Technologies	P21139	Nom long : R-Phycoérythrine chèvre anti-souris IgG2a (&gamma ; 2a) Conjugué
DMEM	Life Technologies	11965-092	Nom long : Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high glucose
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Nom long : Pénicilline-streptomycine, eau distillée
	liquide Life Technologies	15230-089.	Nom long : Eau distillée stérile
PI	SIGMA	P4864	Nom long : Solution d’iodure de propidium
FBS	SIGMA	12203C	Nom long : Gélatine sérique bovine fœtale
	SIGMA	G-1890	Nom long : Gélatine de peau porcine
Humain FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	Nom long : Facteur de croissance des fibroblastes basique, recombinant humain, sans animaux
Filtre 0.22 &mu ; m	Millipore	SCGPU02RE	Nom long : Stericup-GP, 0.22 &mu ; M, polyéthersulfone, 250 ml, radio-stérilisé
70 &mu ; m Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Nom long : Cell strainer avec 70 &mu ; m Maille de nylon
35 &mu ; m Filtre à cellules de couvercle, tube de 5 ml	Becton Dickinson	352235	Nom long : Tube à essai à fond rond en polystyrène de 5 ml, avec un capuchon de filtre à cellules (35 &mu ; m)
5 ml Tube à essai à fond rond en polystyrène	Becton Dickinson	352054	Nom long : 5 ml Tube à essai à fond rond en polystyrène,
stérile IgG2a Contrôle de l’isotype	Becton Dickinson	554126	Nom long : Souris purifiée IgG2a, &kappa ; Contrôle des isotypes
IgM Contrôle des isotypes	Becton Dickinson	553472	Nom long : IgM de souris purifiée, &kappa ; Contrôle d’isotype
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Nom long : PE Rat Anti-Mouse CD90.2
8-peaks calibration	Becton Dickinson	559123	Nom long : Rainbow Calibration Particles (8 pics)
Tube stérile en polypropylène de 50 ml	Greiner Bio-One	227261	Nom long : Tube en polypropylène de 50 ml à fond conique,
fiole stérile T75	Greiner Bio-One	658175	Nom long : CELLSTAR Filter Cap Culture cellulaire 75 cm2 Fioles
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Nom long : TG30 Anticorps clone TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Nom long : GCTM-2 n’est pas disponible dans le commerce, mais TG343 et l’anticorps monoclonal équivalent le sont
Tableau 4. Liste des matériaux et
réactifsMachine FACS	Becton Dickinson		FACSVantage SE avec option FACSDiva
Microscope inversé Olympus			IX71
Tableau 5. Liste des équipements.