In vitro enquête de la pompe à efflux MexAB De Pseudomonas aeruginosa

Résumé

Nous présentons un protocole pour l'étude in vitro de pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Ce protocole permet la génération d'un gradient de protons solide, réversible, et accordable à l'intérieur de la membrane du liposome et par conséquent doit être adaptable à n'importe quelle protéine de la membrane sous tension par la force protomotive.

Résumé

Il ya un besoin scientifique émergente pour des outils fiables pour la surveillance du transport membranaire des protéines. Nous présentons une méthode qui conduit à la reconstitution de pompes d'efflux de la bactérie à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa dans un environnement biomimétique qui permet une investigation précise de leur activité de transport. Trois conditions sont remplies: la compartimentation dans un environnement lipidique, l'utilisation d'un indice de référence pour le transport, et la génération d'un gradient de protons. Le transporteur de la protéine de membrane est reconstitué dans des liposomes ainsi que la bactériorhodopsine, une pompe à protons activé par la lumière qui génère un gradient de protons qui est robuste ainsi que réversible et réglable. L'activité de la protéine est déduit des variations de pH qui se produisent à l'intérieur du liposome, en utilisant pyranin, une sonde fluorescente dépendante du pH. Nous décrivons un procédé étape par étape, où la purification des protéines de membrane, la formation de liposomes, de protéines reconstitution, et le transport d'unnalyse sont adressées. Bien qu'ils aient été spécifiquement conçus pour un transporteur RND, les procédés décrits pourraient être adaptés pour être utilisés avec n'importe quel autre transporteur de la protéine de la membrane sous tension par un gradient de protons.

Introduction

Des protéines membranaires intégrales représentent jusqu'à 30% des gènes codés dans les génomes eucaryotes. Ils partagent des rôles essentiels tels que la grille de maintien (récepteurs), le transport des nutriments, d'ions ou de composés toxiques (transporteurs) ou le maintien de la perméabilité à travers les bicouches membranaires (canaux) parmi toutes les cellules vivantes ^1. Les pompes à efflux jouer un rôle central dans la résistance contre l'antibiothérapie ^2. Dans les bactéries à Gram négatif Pseudomonas aeruginosa, qui est protégée par une membrane extérieure, les transporteurs d'efflux sont organisées comme des systèmes tripartites où MexB, la pompe d'efflux situé dans la membrane interne, fonctionne en conjonction avec MexA, une protéine périplasmique, et OprM, un le canal de la membrane externe. La protéine de la membrane cytoplasmique interne agit comme une pompe énergie dépendante avec une large spécificité de substrat. La protéine de membrane externe agit comme une porine tandis que le troisième se trouve dans l'espace périplasmique et on pense à stabiliser l'ensemble du complexe 3. Dans ce qui suit, nous nous concentrons sur la conception d'un test fonctionnel pour l'ensemble MexA MexB.

Les informations structurelles a accumulé au cours de la 5 dernières années grâce à la détermination des rayons X de la AcrB de protéine homologue de Escherichia coli ^4-7. Bien que il est très important de coupler ces informations avec des données dynamiques et cinétiques, la conception d'un test fonctionnel pour ce transporteur est un véritable défi ^8. En effet, les protéines de la membrane doivent être maintenues dans un environnement membraneux et un compartiment fermé doivent être maintenues pendant un transport vectoriel de substrat à atteindre.

Reconstitution de protéines membranaires en protéoliposomes a été largement présenté et examiné (voir Rigaud et Levy ^9). Ces protocoles permettent la surveillance de l'activité des protéines de membrane, par exemple en suivant les substrats à travers la membrane du liposome. Dans ce cas limitations proviennent de la uneDisponibilité des substrats titrable (fluorescent, radioactif, etc.) et du fait que très souvent, ces substrats sont hydrophobes et ont une tendance à traverser les membranes, indépendamment de la présence du transporteur. Comme alternative, on peut suivre les variations spectroscopiques d'un colorant rapports sensibles aux changements chimiques qui se produisent en raison du transport. Comme indiqué plus haut, les protons dynamiser le transport par MexB. Par conséquent, une option correspondante est de surveiller les variations d'un spectroscopiques rapports colorant sensible au pH de suivre les variations de pH dues au transport du substrat conduit à protons. Le choix d'un colorant fluorescent permet d'éviter tous les effets d'artefact en raison de la nature hydrophobe du substrat.

Une difficulté supplémentaire est la génération d'un gradient de protons. Plusieurs protocoles peuvent être trouvés dans la littérature. Parmi eux, l'utilisation de la technique de la valinomycine est très répandue mais nous avons montré qu'il est fastidieux à accomplir ^10-11. En outre, il estpas reproductible et il n'est pas réversible. Nous avons eu recours à l'utilisation de la bactériorhodopsine (BR), une pompe à protons activé par la lumière de Halobacter salinarium, une archée obligatoire halophile marine Gram négatif aérobie. Cette protéine est coreconstituted dans des liposomes avec MexB et, lors de l'illumination, pompes BR protons à l'intérieur des liposomes et donc crée la ApH (acide à l'intérieur) requis par la protéine de transport du substrat ^12-13.

Protocole

Une. Production et purification de protéines

1. MexA, MexB de Pseudomonas aeruginosa
   1. Transformer les plasmides hébergeant les gènes MexA et MexB dans un E. souche de production coli (par exemple C43 DE3). Plaque sur gélose LB supplémenté avec l'antibiotique approprié. Choisissez une seule colonie pour inoculer une préculture O / N. Le lendemain matin, ensemencer la préculture dans 1 L de LB et de croître à 37 ° C sous agitation (240 rpm).
   2. Une fois que les cellules ont atteint la phase exponentielle _(DO600 = 0,6 à 0,8) induisent avec 1 mM d'IPTG. Effectuer induction pour 2-3 heures à 30 ° C sous agitation.
   3. Centrifuger les cellules (9000 xg pendant 20 min) et les remettre en suspension dans 30 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM.
   4. Broyer les cellules en utilisant une presse française (10 000 psi, 4 passes). Jeter les cellules intactes et des corps d'inclusion par centrifugation à 9000 g pendant 20 min.
   5. Membranes Pellet 1 heure à 100 000 xg et resuspend chaque culot dans 30 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycérol 20% (p / v), de l'imidazole 10 mM, NaCl 500 mM.
   6. Déterminer la concentration totale en protéine de membrane en utilisant le dosage colorimétrique BCA et de solubiliser les membranes O / N avec 2% de maltoside de dodécyle (DDM) dans un volume final déterminé de telle sorte que le détergent: protéine est de 1:1,5 (p / p).
   7. Ultracentrifugation à 100 000 g pendant 1 h à jeter matériau non solubilisé et agrégées.
   8. Incuber le surnageant pendant 2 heures à 4 ° C avec une résine de nickel (de purification MexA) ou une résine de cobalt (de purification MexB) équilibrée avec du Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol à 5% (p / v), de l'imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM.
   9. Verser la résine dans une colonne vide. Recueillir le accréditives.
   10. Laver la résine avec 50 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycérol 20% (p / v), de l'imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM, puis avec 25 ml de bis-Tris 10 mM pH 6, le glycérol 5% (p / v), de l'imidazole 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM.
   11. Éluer le protein avec 20 ml de bis-Tris 10 mM pH 7,4, glycerol à 5% (p / v), de l'imidazole 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM.
   12. Concentrer la protéine avec un dispositif d'ultrafiltration vers le bas à 3 ml et de la charge sur une colonne de dessalage équilibrée avec un tampon imidazole-libre. Juste avant la reconstitution (voir ci-dessous), ultracentrifugation les protéines solubilisées (100 000 xg pendant 20 minutes) pour se débarrasser des lipides et des protéines non solubilisées. Puis se concentrer de nouveau sur la protéine à 0,3 ml.
2. Bactériorhodopsine de Halobacter salinarium
   1. Cultiver des cellules Salinarium Halobacter sous éclairage à 37 ° C pendant 10 jours dans un milieu de croissance liquide contenant du NaCl 4 M, MgSO _4, 150 mM, citrate 10 mM, KCl 30 mM, extraits de levure 5 g / L, et la peptone 5 g / L.
   2. Broyer les cellules par dialyse contre de l'eau déminéralisée.
   3. Purifier la membrane pourpre sur un 30 à 40% (p / v) de gradient de saccharose (100 000 xg pendant 17 h).
   4. Solubiliser la suspension membranaire avec 2% octylglucosidique pendant 24 heures à 37 ° C (volume de solubilisation afin de remettre en suspension la membrane à une 2:1 (poids / poids) du détergent: rapport de protéine). Estimer la concentration de BR solubilisé en utilisant ε (570 nm) = 54 000 M ^-1 cm ^-1. Juste avant la reconstitution (voir ci-dessous), l'ultracentrifugation BR solubilisé (100.000 g pendant 20 min) pour se débarrasser des lipides et des protéines non solubilisées.
      Remarque: Les membranes natives sont naturellement enrichis en BR donc pas de purification supplémentaire est nécessaire.

2. Préparation des protéoliposomes

1. la formation de liposomes: Mettre 400 ul de DOPC dissous dans du chloroforme (25 mg / ml) dans un bêcher en verre et ajoute 1,5 mg de cholestérol stocké sous forme de poudre. Séchez-les juste avant manipulation sous un courant d'azote ou sous vide pendant au moins 1 heure dans un récipient en verre. La DOPC: rapport molaire de cholestérol est de 3,3:1.
   1. Après avoir séché, hydrater les lipides avec 1 ml de tampon HEPES 25 mM pH 7,K ₂ SO ₄ à 100 mM, MgCl _{2 2} mM, 2 mM de pyranine. La suspension doit apparaître trouble à ce stade.
   2. Chauffer la solution pendant 10 min à 37 ° C. Ultrasons pendant 10 min à 40 W avec 30 impulsions sec, 30 sec pause cycles à la température ambiante. La suspension doit être clair à ce stade.
   3. Pour obtenir une population monodisperse de liposomes, effectuer deux cycles de l'extrusion et pour chaque cycle, passer la suspension de liposomes à travers le filtre au moins 11x. Pour le premier cycle, en utilisant une taille de pores de membrane de 200 nm, et pour le deuxième cycle, en utilisant une taille de pores de membrane de 100 nm. Mesures dynamiques de diffusion de la lumière peuvent être effectués à cette étape pour vérifier l'homogénéité de la suspension.
2. Protéine incorporation
   Principe: membrane protéines peuvent être reconstitués dans des liposomes grâce à l'effet de solubilisation des détergents. Liposomes détergent solubilisées sont incubés avec la protéine membranaire solubilisée détergent et la formation de la proteoliposomes est déclenchée par une élimination rapide du détergent avec des billes de polystyrène ^9.
   1. Ajouter 28 mg de Triton X-100 (0,56% final) et incuber O / N à 4 ° C (la température de solubilisation peut être adapté à la protéine à l'étude).
   2. Ajouter la protéine solubilisée par du détergent (BR, MexB et MexA) aux liposomes solubilisés et incuber 15 min à 4 ° C. Ajouter les protéines de la suspension de liposomes solubilisé dans les rapports suivants (p / p): lipides / MexB = 20, MexB / MexA = 2,5, lipides et / BR = 30.
   3. Ajouter des perles de polystyrène à une 30:1 perles: rapport de détergent (en poids / poids, compte tenu du poids total du détergent, y compris un détergent ajoutée avec les protéines purifiées) et incuber 5 heures, à l'obscurité (en raison de la BR) à température ambiante sous douce agitation. Avant cette procédure, activer les BioBeads avec du méthanol et de l'éthanol incubation et abondamment avec de l'eau de lavage.
   4. Purifier la protéine de protéoliposomes et substrats libres, utilisez un PD-10colonne de dessalage équilibrée avec de l'HEPES 25 mM pH 7, K ₂ SO ₄ et 100 mM de MgCl ₂ 2 mM.
   5. Conserver les protéoliposomes à 18 ° C dans l'obscurité jusqu'à 2-3 semaines.
3. Évaluation de l'efficacité de reconstitution sur gradient de saccharose.
   Pour vérifier que les deux MexB et le BR ont été reconstitués dans des liposomes, de purifier la suspension de protéoliposome sur un gradient de saccharose discontinu.
   1. Régler délicatement les protéoliposomes sur un gradient de cinq couches de saccharose (60%, 20%, 10%, 5% et 2,5%, p / v).
   2. Ultracentrifugation pendant 17 heures à 100 000 xg (avec une accélération minimal et le taux de décélération).
   3. Recueillir soigneusement les diverses fractions de gradient (en particulier les interfaces entre chaque couche de saccharose) et de les analyser sur SDS-PAGE (10%) à l'aide Coomassie ou Western Blot. Protéines agrégées se trouvent au fond du tube, tandis que les protéines non incorporés, détergents solubilisé se trouvent en haut dele tube. Protéoliposomes et des liposomes se trouvent au niveau des interfaces de saccharose qui correspondent à leur densité intrinsèque. Liposomes vides sont récupérés plus loin dans la pente que les protéoliposomes.

3. Fluorescence Mesure

1. Effectuer des mesures de fluorescence à 25,0 ° C en utilisant un spectrofluorimètre pour permettre des mesures deux longueurs d'onde (lampe Xe, 150 W). Périodes d'éclairage de substitution (pour activer BR avec longueurs d'onde d'excitation / émission de 550 nm / 550 nm) et des mesures de fluorescence de longueurs d'onde d'excitation / émission de 455 nm / 509 nm pendant 2 secondes pour mesurer la fluorescence pyranine. Définissez les excitation et d'émission des largeurs de bande de 5 nm. Effectuer les mesures en présence de 50 nM de valinomycine pour empêcher la formation d'une membrane ΔΨ potentiel inverse.
   Remarque: En effet, parce que les pompes à protons BR, il ya des frais plus positifs à l'intérieur du liposome qu'à l'extérieur. Cette chargegradient peut être éliminé en utilisant la valinomycine, qui est un ionophore sélectif de K ^+. Une fois ajouté à la valinomycine liposomes en suspension, comme une molécule hydrophobe, permet d'insérer dans la membrane du liposome, transporter passivement K ^+, et par conséquent de dissiper la membrane ΔΨ potentiel.

Résultats

L'essai consiste à surveiller la fluorescence de la pyranine comme une fonction du temps pendant un gradient de protons est généré. À cette fin, les échantillons sont soumis à un éclairage en variante (et donc le pompage de protons par le BR est déclenchée) et ensuite à l'aide de la mesure de fluorescence d'excitation et d'émission de longueurs d'onde de la pyranine (λ _ex = 455 nm et λ _em = 509 nm).

La figure 1 montre une commande représentatif obtenu par le test, en l'absence de MexA / MexB, vérifier que le gradient de protons généré par le BR est réversible. Après un cycle d'acidification, protéoliposomes sont conservés à l'obscurité pendant 45 min afin que le BR à arrêter le pompage des protons (protons diffusent lentement et de manière passive à travers les bicouches lipidiques suivant leur gradient de concentration). Après cette période de récupération, l'activation de BR est possible, simplement en allumant à nouveau la même suspension.

Figure 2correspond à une mesure réelle de transport. Un témoin négatif avec des protéines liposomes libres montre que, comme attendu, le pH est constant lors de l'illumination (figures 2A et 2B, cercles oranges). Cependant, protéoliposomes contenant BR dans leurs membranes ne la pompe à protons, donc le pH à l'intérieur des baisses de liposomes et un gradient stable est construit (Figures 2A et 2B, carrés violets). Triangles gris et losanges rouges (Figure 2A) représentent pH à l'intérieur de protéoliposomes contenant BR et MexB, en présence ou en l'absence de Hoechst 33342, respectivement. On observe une activité de substrat indépendante où le gradient de protons n'est que partiellement dissipée par MexB contre-transport. Nous attribuons cette observation à une activité basale de MexB.

Afin de tester l'effet de MexA sur l'activité de MexB, MexA a été ajouté à la reconstitution, d'abord en l'absence de tout substrat ( Figure 2B, diamants bleus). Encore une fois, le gradient de protons généré par le BR n'est que partiellement dissipée. La mesure réelle de transport est réalisé sur le même échantillon. Au préalable, le gradient de protons doit être réinitialisé et le substrat doit être ajoutée à la suspension pour atteindre son site de liaison à la protéine. À cette fin, la suspension est incubée à l'obscurité en présence du substrat pendant 45 mn. Lors de l'illumination subséquente, on peut voir que le gradient de protons généré par le BR est maintenant totalement dissipée par MexAB (Figure 2B, triangles verts), en conséquence de transport de substrat par la pompe.

. Figure 1 réversibilité du gradient de proton construit par illumination BR: pyranine fluorescence de protéoliposomes BR mesurées en fonction du temps. De 0-15 min, pompes BR protons en raison de l'activation de la lumière. De 15 à 60 min, protéoliposomes sont incubées dans l'obscurité, pendant ce temps, les protons se déplacent de manière passive sur les liposomes jusqu'à ce que le pH et le pH intravésiculaire extravésiculaire sont égales. De 60-75 min, BR est toujours fonctionnel et pompes protons lors de l'illumination.

. Figure 2 Transport dosage: pyranine fluorescence, convertie aux variations de pH correspondantes, en fonction du temps A) de pH à l'intérieur de liposomes témoins (cercles oranges); pH à l'intérieur de protéoliposomes contenant BR dans la membrane (carrés violets); du pH à l'intérieur. de protéoliposomes contenant BR, et MexB dans la membrane sans Hoechst 33342 (d rougeiamonds); pH à l'intérieur de protéoliposomes contenant BR et MexB dans la membrane avec Hoechst 33342 (triangles gris) B) de pH à l'intérieur de liposomes témoins (cercles oranges),. pH à l'intérieur de protéoliposomes contenant BR dans la membrane (carrés violets); pH à l'intérieur de protéoliposomes contenant BR, MexB et MexA dans la membrane sans Hoechst 33342 (losanges bleus); pH à l'intérieur de protéoliposomes contenant BR, MexB et MexA dans la membrane avec Hoechst 33342 (triangles verts).

Discussion

Nous décrivons une procédure de reconstitution conçu pour le dosage du transport membranaire des protéines. Une fois établie, la procédure de reconstitution de protéines conduit à des mesures qui sont très reproductibles. Cependant, les conditions précises pour la reconstitution de la protéine variera d'une protéine à l'autre. Beaucoup de soin doit être pris dans l'optimisation des paramètres suivants: i) la qualité de la purification (pureté et de l'absence de matière agrégée), ii) l'efficacité de l'étape de détergent solubilisant (lorsque cela est possible, un faible détergent cmc doit être préférée, car ils sont plus faciles à obtenir débarrasser d'), iii) la désorption du détergent (il est par exemple possible de combiner l'utilisation de billes de polystyrène avec une étape de dialyse, mais cela peut affecter la vitesse de désorption, un paramètre critique pour l'activité ultérieure de la protéine, voir réf [ 9]), iv) la reconstitution des lipides (la nature chimique du lipide, le lipide à rapport de la protéine, la présence de plus d'amphiphiles sont des paramètres essentiels qui doivent être modifiés et optimisés). De la température de plus et le temps d'incubation affecter toutes ces questions.

Le contrôle de qualité est donc primordial à chaque étape de la procédure de reconstitution. De ce point de vue, diffusion de la lumière est une technique très pratique car il est rapide, non destructive, et il ne nécessite que 20 ul d'échantillon à une concentration dans la gamme micromolaire. Une fois que les protéoliposomes sont formés, gradient de saccharose est également d'une grande aide, car elle ouvre la voie à une vérification systématique de la reconstitution: qualitative (est la protéine en effet intégré dans la membrane du liposome) ainsi que quantitative (combien de protéine dans un liposome). Ce dernier serait adressée par la mesure précisément la protéine et les concentrations de lipides.

Notre analyse ne repose pas sur le titrage du substrat lui-même et cela évite les considérations inquiets concernant une éventuelle diffusion passive d'artefact de la molécule en raison de partitionnement hydrophobe dans les membranes. Le test exploite les propriétés de pyranine comme sonde fiable et quantitative pour surveiller les changements de pH. Nos résultats sont en accord avec les résultats obtenus avec une autre procédure où la formation de gradient de protons a été réalisée en utilisant la valinomycine ^10, mais il permet un gradient plus robuste et reproductible ^11. En outre, le gradient de protons peut être réglé avec précision, en faisant simplement varier la concentration du tampon (pour plus de détails voir Verchere et al. ^12).

Dans le mode opératoire d'une mesure de contrôle est effectuée en premier, en l'absence de substrat (ce qui donne accès à l'activité de la protéine passive). L'activité de transporteur de la protéine de la membrane proprement dite est ensuite mesurée après que le substrat a été ajouté dans la même cuve. C'est vraiment un atout parce que l'expérience peut être considérée comme un véritable ambiguïté, résultat, non induite par le substrat.

ent "> Le protocole pourrait être adapté à la haute-moyen débit (par exemple 96 puits mesures) automatisation parce éclairer l'échantillon déclenche la réaction. automatisation et parallélisation consisterait à préparer un grand lot de protéoliposome, et dans la distribution des aliquotes dans un 96 puits plaque. substrats (et également des inhibiteurs possibles) seraient alors ajoutés et après incubation dans l'obscurité pendant 45 minutes la plaque serait soumis à des cycles de mesure de la fluorescence éclairage / pyranine sur un lecteur de microplaques.

Pour plus d'informations sur le protocole, les lecteurs sont invités à lire Verchere et al. ^12,13

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)	Avanti Polar Lipids	850375C
Cholestérol	Sigma Aldrich	C8667
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Triton X-100	Sigma Aldrich	93427
Valinomycine	Invitrogen	V-1644
Pyranine (8- acide hydroxypyrène-1,3,6-trisulfonique)	Invitrogen	H-348
DDM (n-Dodecyl-&beta ;-D-maltopyranoside)	Affymetrix	D310LA
(extrudeur, seringues étanches aux gaz Hamilton)	Avanti Polar Lipids	610000
Biobeads SM-2 Adsorbants	Bio-Rad	152-3920
Econo-Pac Chromatographie à colonne vide	Biorad	732-1010
Colonnes de dessalage	Bio-Rad	54805
Instrument de diffusion dynamique de la lumière	Wyatt Technology	Fluorimètre DynaPro NanoStar
JASCO FP-6200	JASCO	6816-J002A

Kit d’extrudeuse