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Article de méthode

La spectrométrie de masse MALDI-TOF à cellules entières est une méthode précise et rapide pour analyser différents modes d’activation des macrophages

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DOI :

10.3791/50926

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26 décembre 2013

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1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la spectrométrie de masse MALDI-TOF à cellules entières sur des cellules eucaryotes. Ici, nous illustrons la précision de cette technique en analysant les multiples états d’activation des macrophages en réponse à leur microenvironnement.

Résumé

MALDI-TOF est une technique de spectrométrie de masse largement utilisée en chimie et en biochimie. Il a également été appliqué en médecine pour identifier des molécules et des biomarqueurs. Récemment, il a été utilisé en microbiologie pour l’identification de routine des bactéries cultivées à partir d’échantillons cliniques, sans étapes de préparation ou de fractionnement. Avec d’autres, nous avons appliqué avec succès cette technique de spectrométrie de masse MALDI-TOF à cellules entières à des cellules eucaryotes. Les applications actuelles vont de l’identification des types de cellules à l’évaluation du contrôle de la qualité des cultures cellulaires et aux applications de diagnostic. Ici, nous décrivons son utilisation pour explorer les différents phénotypes de polarisation des macrophages en réponse aux cytokines ou aux bactéries tuées par la chaleur. Il a permis d’identifier des empreintes spécifiques aux macrophages qui sont représentatives de la diversité des réponses protéomiques des macrophages. Cette application illustre la précision et la simplicité de la méthode. Le protocole que nous avons décrit ici peut être utile pour étudier la réponse immunitaire de l’hôte dans des conditions pathologiques ou peut être étendu à des applications diagnostiques plus larges.

Introduction

La spectrométrie de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) est une technique de spectrométrie de masse populaire pour étudier les échantillons biologiques. L’utilisation d’un faisceau laser et d’une matrice absorbant l’énergie permet un processus d’ionisation douce : l’évaporation et la genèse de grandes biomolécules, pour la plupart monochargées. Ce processus est appelé désorption/ionisation, d’où l’acronyme MALDI. Ces ions sont ensuite accélérés par application de tension et entrent dans un analyseur TOF qui permet la séparation de ces ions et la quantification de leurs massesrespectives1.

MALDI-TOF MS a été largement utilisé en biologie, en chimie et en médecine pour identifier des molécules et des biomarqueurs2-4 ou pour surveiller les modifications post-traductionnelles sur proteins5,6. Récemment, plusieurs groupes ont appliqué MALDI-TOF MS à l’identification de micro-organismes à partir d’échantillons cliniques7,8. Cette application microbiologique est maintenant utilisée régulièrement dans les milieux cliniques. Le MALDI-TOF à cellules entières présente de nombreux avantages par rapport aux applications classiques du MALDI-TOF MS. Les échantillons contenant des cellules entières sont traités directement, ce qui évite les étapes fastidieuses de fractionnement ou de séparation de grandes quantités de matériel. De plus, aucune caractérisation des différents pics n’est nécessaire : l’ensemble du spectre est considéré comme une empreinte digitale de l’échantillon, et des algorithmes d’appariement comparent le spectre testé avec une base de données de spectres de référence.

Nous et d’autres avons appliqué cette technique d’analyse de cellules entières à des cellules eucaryotes. De nombreuses applications peuvent découler de cette technique : (1) identifier les principaux types de cellules à partir d’un échantillon mixte9-11 ; (2) évaluer la viabilité des cultures cellulaires au fil du temps (y compris les applications industrielles de contrôle de la qualité)12 ; (3) surveiller les états d’activation d’une cellule unique de type13 ; (4) Évaluer la transformation maligne d’un échantillon clinique14,15.

Ici, nous décrivons l’utilisation de la MS MALDI-TOF à cellules entières pour explorer les différents phénotypes de polarisation des macrophages en réponse aux cytokines ou aux bactéries tuées par la chaleur. Les macrophages jouent un rôle central dans la réponse immunitaire aux agents pathogènes microbiens. Ils détectent les agents infectieux dans les tissus grâce à des récepteurs de reconnaissance de formes capables de détecter les motifs microbiens conservés, tels que le lipopolysaccharide (LPS)16. Les macrophages sont des cellules présentatrices d’antigènes professionnelles qui interagissent avec les lymphocytes T pour monter la réponse immunitaire adaptative. Les lymphocytes T influencent les macrophages en libérant des cytokines qui renforcent ou régulent l’activité microbicide des macrophages. Par analogie avec la polarisation des lymphocytes Th1/Th2, les macrophages inflammatoires, microbicides et tumoricides ont été classés en macrophages M1 et en macrophages immunorégulateurs en macrophages M217-19. Le terme M1 fait référence à l’activation classique des macrophages par des cytokines de type I, telles que l’interféron (IFN)-γ et le facteur de nécrose tumorale (TNF), ou des produits bactériens, tels que le LPS18,20-23, tandis que les macrophages activés par des voies alternatives (interleukine (IL)-4, IL-10, Transforming Growth Factor-β1 sont considérés comme des macrophages M219,24,25. La grande plasticité phénotypique et fonctionnelle des macrophages en réponse à leur microenvironnement rend ces macrophages utiles pour analyser les changements subtils par une approche MALDI-TOF MS.

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Protocole

Dans le protocole actuel, la technique MALDI-TOF à cellule entière est utilisée pour obtenir un spectre de masse considéré comme une empreinte digitale de l’échantillon. Une analyse bioinformatique a permis la comparaison et la classification de ces empreintes digitales. Ce protocole comportait trois parties principales :

  1. La préparation des échantillons biologiques : macrophages de contrôle et macrophages stimulés par différents agonistes.
  2. L’analyse de chaque type d’échantillon avec des réplicats techniques par MALDI-TOF MS à cellules entières.
  3. L’analyse bioinformatique de données brutes.

Préparer des solutions stériles pour l’isolement et la culture cellulaires. Préparez et stockez tous les réactifs à 4 °C

1. Préparation des monocytes humains

  1. Préparez le milieu de culture cellulaire. Ajouter 55 ml de sérum humain AB+ ou de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de la solution antibiotique (pénicilline à 10 000 UI/ml et streptomycine à 10 000 μg/ml ; concentration finale de 100 UI/ml pour la pénicilline et de 100 μg/ml pour la streptomycine) dans le milieu RPMI 1640 (500 ml).
    1. Isolez les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de leucopacks (concentrés de leucocytes).
      1. Préparez des tubes de 50 ml contenant 15 ml de Ficoll. Diluer le sang dans une solution saline (vol/vol, 1/10). Déposer 30 ml de PBMC dilués sur Ficoll comme décrit précédemment26.
      2. Centrifugeuse à 700 x g pendant 20 min. Récupérer les PBMC à l’interface entre Ficoll (densité de 1,077 g/ml) et le plasma dilué. Diluer les PBMC dans un milieu de culture et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
    2. Préparez des monocytes CD14+ à partir de PBMC à l’aide de billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD14.
      Remarque : Maintenir les produits et les cellules à 4 °C jusqu’à l’apparition des monocytes.
      1. Préparez un tampon courant composé d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,2, de 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et de 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
      2. Dissociez doucement les PBMC granulés (10 à7 cellules par dosage) en 80 μl de tampon courant.
      3. Ajoutez 20 μl de microbilles CD14 aux PBMC. Mélanger et incuber les PBMC pendant 15 min. Laver les PBMC avec 5 ml de tampon de fonctionnement et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Dissociez doucement les PBMC granulés en 500 μl de tampon courant pour 108 PBMCs.
        Remarque : utilisez 500 μl de tampon courant pour les concentrations de PBMC inférieures à 108 PBMC.
      4. Passez à la séparation magnétique.
        Remarque : pour moins de 2 x 108 PBMC, utilisez la colonne MS ; pour plus de 2 x 108 PBMC et moins de 2 x 109 PBMC, utilisez la colonne LS.
      5. Rincer la précolonne et la colonne avec tampon de fonctionnement (500 μl pour la colonne MS ou 3 ml pour la colonne LS). Ajoutez des PBMC dans la précolonne (attendez que les cellules non étiquetées passent à travers la colonne). Rincer 3 fois avec un tampon de coulée (500 μl pour la colonne MS ou 3 ml pour la colonne LS). Supprimez la précolonne.
      6. Placez la colonne sur des tubes de 15 ml. Ajoutez un tampon courant (1 ml pour la colonne MS ou 5 ml pour la colonne LS) sur la colonne et éluez les cellules CD14+ en appliquant une pression sur la colonne.
      7. Centrifuger l’éluat à 300 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant. Laver la pastille de monocyte avec 10 ml de milieu de culture.
        Remarque : Analysez la pureté de la préparation des monocytes à l’aide d’anticorps anti-CD14 et de la cytométrie en flux (classiquement supérieure à 95 %).
  2. Différenciation des monocytes en macrophages.
    1. Incuber les monocytes (10 à6 monocytes par puits dans des plaques à 6 puits) dans 3 ml de milieu de culture contenant 10 % de sérum humain AB+ à 37 °C. Après 4 jours, remplacer le milieu de culture contenant du sérum humain par 3 ml de milieu de culture contenant 10 % de FBS pendant 3 jours supplémentaires.
    2. Identifier la population cellulaire obtenue en tant que macrophages dérivés de monocytes (MDM) par cytométrie en flux (voir Figure 1).
      1. Remplacer le milieu de culture par 3 ml de PBS. Grattez les MDM avec un policier en caoutchouc et récupérez les suspensions MDM. Centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min. Ajoutez du PBS contenant 2 % de BSA aux MDM granulés et agitez doucement la suspension cellulaire. Ajustez la concentration cellulaire (10 à6 MDM dans 200 ml de PBS) et incubez à 4 °C.
      2. Ajouter 10 ml d’anticorps anti-CD14 et 10 ml d’anticorps anti-CD68 dans une suspension MDM et incuber à 4 °C pendant 20 min dans l’obscurité.
        Remarque : ces anticorps doivent être marqués avec deux fluorochromes différents, conformément à l’analyse par cytométrie en flux. Par exemple, les anticorps anti-CD14 peuvent être conjugués avec de la phycoérythrine couplée (pour la coloration des monocytes) et des anticorps anti-CD68 couplés à Alexa Fluor 647 (pour la coloration des macrophages).
      3. Centrifugez les MDM à 400 x g pendant 5 min. Éliminer les surnageants. Dissociez doucement la pastille cellulaire et incubez les MDM dans 250 ml de paraformaldéhyde à 3 % (PFA) pendant 15 min à température ambiante. Centrifugeuse MDM fixes en PFA à 400 x g pendant 5 min. Laver les MDM avec 3 ml de PBS et centrifuger les MDM à 400 x g pendant 5 min. Dissocier délicatement la pastille MDM dans 400 ml de PBS.
      4. Analysez la différenciation des monocytes (qui expriment CD14 mais pas CD68) en monocytes (qui expriment CD68 mais pas CD14). Remarque : classiquement, plus de 95 % des cellules sont MDM.
  3. Stimulation de 18 heures de MDM.
    1. Remplacer le milieu de culture des MDM adhérents par un milieu de culture frais de 3 ml (contenant 10 % de FBS).
    2. Pour induire une polarisation M1 ou M2, utilisez les cytokines recombinantes humaines suivantes : IFN-γ et TNF pour la polarisation M1, et IL-4 pour la polarisation M2. Les macrophages M1 sont également obtenus par stimulation avec LPS. Notez que les solutions mères de cytokines sont conservées à -80 °C et que la solution mère de LPS est conservée à -20 °C.
      1. Diluer la solution mère d’IFN-gγ (1 mg/ml) à 1/100 dans un milieu de culture pour obtenir une dilution de 10 ng/ml. Ajouter 6 μl de cette dilution d’IFN-γ aux MDM pour obtenir une concentration finale d’IFN-γ de 20 ng/ml.
      2. Diluer la solution mère de TNF (1 mg/ml) à 1/100 dans un milieu de culture pour obtenir une dilution de 10 ng/ml. Ajouter 6 μl de cette dilution de TNF aux MDM pour obtenir une concentration finale de TNF de 20 ng/ml.
      3. Diluer la solution mère d’IL-4 (1 mg/ml) à 1/100 dans un milieu de culture pour obtenir une dilution de 10 ng/ml. Ajouter 6 μl de cette dilution d’IL-4 à des MDM pour obtenir une concentration finale d’IL-4 de 20 ng/ml.
      4. Ajouter 3 μl de la solution mère de LPS (1 mg/ml) aux MDM pour obtenir une concentration finale de LPS de 1 μg/ml.
    3. Pour stimuler les MDM avec des bactéries, utilisez des bactéries tuées par la chaleur. Lavez les bactéries vivantes avec du PBS et chauffez-les à 95 °C pendant 1 heure. L’utilisation d’Orientia tsutsugamushi (souche Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, souche BCG CIP 671203) et Coxiella burnetii (Nine Mile en phase I) était parce que ces agents pathogènes sont connus pour infecter les macrophages. Ainsi, préparez une suspension d’O. tsutsugamushi à raison de 10à 9 bactéries/ml. Ajoutez 50 μl aux MDM . Répétez la même étape pour M. bovis et C. burnetii.
  4. Préparation d’échantillons biologiques pour MALDI-TOF MS.
    1. Laver les MDM stimulés par le PBS sans Ca2+ ou Mg2+ (les cellules peuvent s’agglutiner en présence de Ca2+ ou Mg2+). Grattez les MDM avec un policier en caoutchouc et récupérez les suspensions MDM. Lavez à nouveau les MDM dans du PBS sans Ca2+ ou Mg2+ à 400 x g pendant 5 min pour éliminer la contamination par le FBS.
    2. Ajustez la concentration cellulaire (2 x 106 MDM par dosage). Centrifugez les MDM à 400 x g pendant 5 min et jetez les surnageants. Prélever les pastilles cellulaires dans 20 μl de PBS sans Ca2+ ou Mg2+.
    3. Analysez immédiatement les échantillons ou stockez-les dans du PBS à -80 °C avant l’analyse.

2. Analyse des macrophages par MS Maldi-TOF à cellules entières

  1. Préparation de la matrice CHCA.
    1. Ajoutez 500 μl d’acétonitrile, 250 μl d’acide trifluoroacétique à 10 % et 250 μl d’eau de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) dans un flacon. Diluer 10 mg de CHCA dans cette solution jusqu’à une concentration finale de 10 mg/ml. Mélanger et soniser pendant au moins 20 min.
      Note : la sonication améliorera la saturation de la matrice mais cette étape n’est pas obligatoire.
    2. Centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min. Jeter la pastille et conserver le surnageant.
      Remarque : préparez la solution matricielle juste avant utilisation. Une solution matricielle contenant des cristaux ne permet pas une bonne ionisation des molécules de l’échantillon, ce qui peut affecter la qualité des spectres.
  2. Préparation de la cible en acier MALDI.
    1. Humidifiez la cible en acier poli avec de l’eau chaude du robinet. Frottez avec du papier essuyé avec précision. Ajouter 70 % d’éthanol et frotter. Rincer à l’eau en frottant. Ajouter 70 % d’éthanol et frotter avec du papier de précision.
    2. Immergez la cible dans de l’éthanol à 70 % et du sonicate pendant au moins 15 min. Recouvrez la cible de 500 μl pour 1 ml d’acide trifluoroacétique à 80 %. Frottez et essuyez avec du papier de précision. Rincer à l’eau HPLC sans frotter. Sécher la cible à température ambiante.
      Remarque : une cible mal nettoyée peut affecter la qualité des spectres.
  3. Préparation des dépôts.
    1. Placez la cible propre sur un support horizontal et de niveau pour obtenir des dépôts uniformes.
    2. Décongelez doucement les échantillons MDM sur de la glace. Remarque : une décongélation rapide et vigoureuse peut altérer les échantillons, affectant ainsi la qualité des spectres. Homogénéiser les MDM (en pipetant d’avant en arrière la suspension cellulaire) avant le dépôt de 1 μl (contenant environ 1 x 105 cellules) sur la cible MALDI. Ajouter 1 μl de la solution matricielle MALDI sur l’échantillon. Évitez de mélanger le point avec la pipette. Le mélange de points avec des pipettes modifie la qualité des spectres. Déposer 12 à 16 échantillons/dosage (répétitions techniques).
    3. S’évaporer spontanément à température ambiante. Remarque : l’évaporation se fait progressivement et conduit à la formation de cristaux de matrice/échantillon. Les dépôts peuvent être immédiatement analysés ou stockés dans l’obscurité pendant plusieurs jours avant l’analyse (jusqu’à 2 semaines).
    4. L'utilisateur doit s'assurer que les cytokines ou les bactéries tuées par la chaleur utilisées dans l'expérience ne fournissent pas de pics dans la plage des spectres des macrophages stimulés. Ici, nous avons vérifié que les cytokines et les bactéries tuées par la chaleur seules ne fournissaient aucun signal dans la gamme étudiée (0-20 kDa).
  4. Réglage du spectromètre de masse et acquisition de données.
    1. Insérez la cible en acier contenant les échantillons dans le spectromètre de masse.
    2. Configurez le spectromètre de masse et exécutez l’acquisition des données. Utilisez la configuration par défaut pour l’acquisition automatique des données.
    3. Remarque : une vue détaillée de la configuration du logiciel flexControl est donnée dans l’annexe/le tableau 1. Cela peut varier en fonction du spectromètre de masse et du logiciel utilisé.

3. Analyse bioinformatique

Remarque : l’analyse bioinformatique a été réalisée à l’aide du logiciel d’analyse statistique gratuit et open source R, ainsi que de bibliothèques d’analyse spécifiques (MALDIquant). R peut être téléchargé gratuitement sur son site web http://cran.r-project.org/. Une description détaillée du script est fournie sous la forme matériel supplémentaire.

  1. Chargement et prétraitement des données brutes.
    1. Stockez les données brutes sur l’ordinateur associé au spectromètre de masse dans plusieurs fichiers et dossiers. Récupérez le dossier racine de l’expérience avec tous les sous-dossiers. Copiez le dossier racine sur l’ordinateur personnel pour l’analyse.
    2. Utilisez les bibliothèques readBrukerFlexData et MALDIquant pour charger et analyser les données brutes.
      Remarque : readBrukerFlexData permet de charger des données brutes du spectromètre de masse dans un objet spécifique dans R pour une analyse plus approfondie. Voir la description de MALDIquant pour plus d’informations27.
    3. Analyser les spectra.
      générés Remarque : chaque spectre est constitué d’une liste de pics avec leurs masses et intensités respectives (abondance relative). Utilisez la racine carrée des intensités pour améliorer la visualisation graphique des spectres. Corrigez l’arrière-plan à l’aide d’un algorithme d’écrêtage de pic non linéaire sensible aux statistiques pour l’estimation de la ligne de base27. Utilisez un rapport signal/bruit de 6 pour détecter les pics. Considérez que les pics détectés sont similaires dans tous les spectres lorsque les valeurs de masse/charge (m/z) se trouvent dans une fenêtre de 2 000 ppm.
  2. Définition et calcul du score. Classez les spectres à l’aide d’un clustering hiérarchique avec un algorithme de ward pour l’agglomération et une matrice de dissimilitude basée sur la distance de Jaccard.
    Remarque : l’indice de Jaccard mesure la similitude entre les ensembles d’échantillons booléens (c’est-à-dire la présence/l’absence d’une liste de pics).
  3. Comparaison des spectres et visualisation.
    1. Analysez les tracés des spectres bruts. Remarque : l’axe des x représente le rapport m/z (en Daltons) et l’axe des y représente l’intensité (abondance relative).
    2. Évaluez la similitude entre les spectres par regroupement hiérarchique. Représenter la similitude (ou la divergence) comme le dendrogramme.
    3. Évaluez la reproductibilité au moyen d’une représentation virtuelle en vue gel. Remarque : la représentation virtuelle en vue gel est un tracé de carte thermique modifié où l’abondance relative est codée en couleur avec des intensités croissantes de bleu.

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Résultats

L'objectif du présent protocole est de démontrer la précision de la spectrométrie de masse MALDI-TOF sur cellules entières pour évaluer la réactivité des macrophages à leur microenvironnement.

Figure 1 décrit la préparation de macrophages stimulés à partir d'échantillons sanguins. Figure 2 représente l'analyse des monocytes et des MDM par cytométrie en flux. Remarquez que les monocytes exprimaient CD14 mais pas CD68 (Figure 1A). En revanche, l...

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Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation de MALDI-TOF-MS sur des cellules entières eucaryotes. Ici, nous illustrons la précision de la méthode en analysant les multiples états d’activation des macrophages en réponse à leur microenvironnement.

Le succès du protocole repose sur quelques étapes critiques. Tout d’abord, tout contaminant en solution peut modifier les spectres. Par exemple, il est important de laver les cellules dans le PBS pour éliminer le milieu de culture et les protéines sériques avant...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer. RO, JLM et CC sont les inventeurs d'un brevet international WO 2011/154650, nommé « Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF ».

Remerciements

Richard Ouedraogo bénéficie d’une subvention du Ministère de la Santé (PHRC 2010). Nous remercions Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops et Nicolas Amstrong pour l’assistance technique.

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Références

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