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Article de méthode

Transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs purifiées par MACS dans la rétine adulte de la souris

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DOI :

10.3791/50932

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22 février 2014

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1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La transplantation de cellules représente une stratégie pour le traitement de la dégénération rétinienne caractérisée par la perte de photorécepteur. Ici nous décrivons une méthode pour l’enrichissement des photorécepteurs transplantables et de leur greffe sous-rétinienne chez les souris adultes.

Résumé

La déficience visuelle et la cécité due à la perte des cellules de détection de la lumière de la rétine, c’est-à-dire des photorécepteurs, représentent la principale raison de l’invalidité dans les pays industrialisés. Le remplacement des photorécepteurs dégénérés par la transplantation de cellules représente une option de traitement possible dans de futures applications cliniques. En effet, des études précliniques récentes ont démontré que les photorécepteurs immatures, isolés de la rétine néonatale de souris au jour postnatal 4, ont le potentiel de s’intégrer dans la rétine de souris adulte après une transplantation sous-rétinienne. Les cellules de distributeur ont généré une morphologie mûre de photorécepteur comprenant les segments intérieurs et externes, un corps rond de cellules situé à la couche nucléaire externe, et les bornes synaptiques à proximité des cellules bipolaires endogènes. En effet, des rapports récents ont démontré que les photorécepteurs donneurs s’intègrent fonctionnellement dans les circuits neuronaux des souris hôtes. Pour une future application clinique d’une telle approche de remplacement cellulaire, des suspensions purifiées des cellules de choix doivent être générées et placées à la position correcte pour une intégration appropriée dans l’œil. Pour l’enrichissement des précurseurs de photorécepteurs, le tri doit être basé sur des antigènes de surface cellulaire spécifiques afin d’éviter la modification du rapporteur génétique des cellules donneuses. Ici, nous montrons le tri cellulaire magnétique-associé (MACS) - enrichissement des précurseurs transplantables de photorécepteur de tige isolés de la rétine néonatale des souris rapporteurs photoréceptrices-spécifiques basées sur le marqueur de surface cellulaire CD73. L’incubation avec des anticorps anti-CD73 suivis des anticorps secondaires conjugués de micro-perle a permis l’enrichissement des précurseurs de photorécepteur de tige par MACS à approximativement 90%. Par rapport à la cytométrie en flux, macs a l’avantage qu’il peut être plus facile d’appliquer aux normes GMP et que des quantités élevées de cellules peuvent être triées dans des périodes relativement courtes. L’injection de suspensions cellulaires enrichies dans l’espace sous-rétinien de souris adultes de type sauvage a entraîné un taux d’intégration 3 fois plus élevé par rapport aux suspensions cellulaires non triées.

Introduction

La vision est l’un des principaux sens de l’homme. La dégradation de ce sens et la cécité sont l’une des principales raisons du handicap dans les pays industrialisés. La cause prédominante de déficience visuelle ou de cécité est la dégénérescence rétinienne, caractérisée par une perte de cellules photorécepteurs, comme on peut l’observer dans la dégénérescence maculaire, la rétinite pigmentaire, la dystrophie cononique-tige et d’autres conditions. À ce jour, il n’existe pas de thérapie efficace pour restaurer la vision perdue. En 2006 et 2008, deux laboratoires différents ont signalé, indépendamment l’un de l’autre, une transplantation réussie de cellules précurseurs de photorécepteurs de tiges dans des rétines adultes de souris de type sauvage1,2. Ainsi, surgissant la possibilité de transplantation de cellules de précurseur de photorécepteur également dans une rétine dégénérée, pour remplacer les photorécepteurs dégénérés et restaurer la vision. En effet, il a été démontré récemment, que de telles cellules précurseurs photoréceptrices transplantées suscitent des critères morphologiques de photorécepteurs matures de type sauvage, tels que des segments externes correctement développés3, desbornes synaptiques à proximité immédiate de cellules bipolaires endogènes et d’un corps cellulaire rond situé dans la couche nucléaire externe2-4,ainsi que la capacité à s’intégrer fonctionnellement dans les circuits neuronaux de l’hôte5-7. L’un des grands principes de cette stratégie est l’utilisation des rétines de jeunes souris du jour postnatal 4 (PN 4, PN0 est défini comme le jour de la naissance), ce qui entraîne un mélange de différents types de cellules pour la transplantation. Sur le fond d’une future application thérapeutique, ce mélange doit être purifié pour les cellules précurseurs de photorécepteurs. CD73 a été décrit comme le premier marqueur de surface cellulaire spécifique pour les jeunes photorécepteurs dans la rétine8-10. Ici, nous démontrons une méthode de purification de cellules précurseurs de photorécepteurs basée sur ce marqueur de surface cellulaire et avec l’utilisation de la technique de tri cellulaire magnétique associé (MACS). Macs pourrait avoir des avantages par rapport aux techniques de tri cellulaire fluorescent-activé, en raison des temps de tri rapides et de l’ajustement plus facile aux conditions GMP. Nous pourrions démontrer un enrichissement d’environ 90% et un taux d’intégration jusqu’à 3 fois plus élevé lors de la transplantation de la population enrichie dans l’espace sous-rétinien chez les rétines adultes de type sauvage. Ainsi, l’enrichissement de cellules précurseurs de photorécepteurs à base de MACS et la transplantation sous-rétinienne sont des techniques fiables et prometteuses pour le développement d’une stratégie thérapeutique régénératrice pour le traitement de la dégénérescence rétinienne.

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Protocole

Énoncé sur l’utilisation éthique et les soins des animaux :

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées en stricte conformité avec les lois de l’Union européenne et allemandes (Tierschutzgesetz) et ont adhéré à la déclaration ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la TU Dresde et de la Landesdirektion Dresden (numéro d’approbation : 24D-9168.11-1/2008-33).

1. Avant de commencer la dissociation des cellules et le tri des cellules

  1. Étiqueter trois tubes réactionnaires de 15 ml avec : Wash (W), Fraction positive (+) et Fraction négative (-).

2. Dissociation de la rétine

  1. Décapitez les chiots PN 4 à l’aide d’un ciseau.
  2. Rincer la tête des petits peu de temps après avec de l’éthanol à 70 % et les laver dans du PBS.
  3. Transférer la tête à HBSS froid et énucléer l’œil (répétez cette étape pour toutes les têtes). Pour énucléer, ouvrez les paupières et fixez l’œil avec une pince incurvée au niveau de la région du nerf optique. Ensuite, tirez l’œil soigneusement hors de l’orbite.
  4. Après avoir énucléé tous les yeux, isolez la rétine: introduisez un ciseau fermé dans le nerf optique et ouvrez les lames. Peal le RPE / chorid out. Retirez les lentilles et les vaisseaux sanguins à l’aide d’une pince incurvée.
  5. Transférer les rétines isolées dans un tube réactionnel de 1,5 ml contenant la solution de papaïne (fournie par le kit de dissociation de la papaïne).
  6. Incuber les rétines dans la solution de papaïne pendant 30-60 min dans un bain-marie ou un shaker (400 rpm) à 37 °C.
    1. Pendant que les rétines couvent dans la solution de papaïne, pipetter 1 ml de solution d’ovomucoïde dans un tube réactionnel de 15 ml (étiquette « 1 »).
    2. Ajouter 60 μl de DNase I (10 mg/ml) + 60 μl de solution d’ovomucoïde (fournie par le kit) + 520 μl d’EBSS dans un tube de réaction de 15 ml (étiquette « 2 »).
  7. Après incubation de la papaïne, transférer la solution de papaïne contenant les rétines partiellement digérées dans le tube réactionnel « 2 ».
  8. À l’aide d’une pipette polie au feu, effectuez une dissociation mécanique (10x de haut en bas).
  9. Pipetter la suspension à cellule unique au tube de réaction « 1 ». Essayez de générer 2 couches en superposant doucement la suspension cellulaire sur la solution ovomucoïde.
  10. Centrifuger pendant 5 min à 300 x g (environ 1 300 tr/min).
  11. Jetez le surnageant et ressuscitez les cellules dans 500 μl de tampon MACS.

3. Tri des cellules à l’aide du tri des cellules associées magnétiques (MACS)

  1. Ajouter x μl d’anticorps anti-CD73 pour le rat aux 500 μl afin d’atteindre une concentration finale de 10 μg/ml.
  2. Incuber 5 min sur la glace.
  3. Remplissez le tube de réaction de 15 ml à 10 ml avec un tampon MACS et centrifugez-le pendant 5 min à une vitesse de 300 x g.
  4. Retirez le surnageant.
  5. Ressusciter la pastille dans un tampon MACS de 480 μl et ajouter 120 μl de microbilles d’IgG anti-rat de chèvre.
  6. Incuber 15 min sur la glace; ne pas agiter, secouer ou mélanger.
  7. Remplissez le tube de réaction de 15 ml à 5 ml avec un tampon MACS et centrifugez-le pendant 5 min à 300 x g.
  8. Lorsque le tube de réaction est centrifugé:
    1. Ajustez une colonne LS dans le support magnétique.
    2. Placez le filtre de préséparation au-dessus de la colonne LS.
    3. Hydrater le filtre de préséparation et la colonne LS avec un tampon MACS de 3 ml et recueillir le tampon MACS dans le tube de lavage (W).
  9. Retirez le surnageant.
  10. Ressusciter la pastille dans un tampon MACS de 500 μl.
  11. Chargez la suspension cellulaire de 500 μl dans le filtre, puis ajoutez 1 ml de tampon MACS au filtre et collectez la fraction négative dans le tube de réaction de fraction négative (-).
  12. Ensuite, ajoutez 3 x 3 ml de tampon MACS à la colonne pour laver les cellules qui ne sont pas liées à la colonne
  13. Une fois que ces 9 ml sont à travers la colonne LS, retirez la colonne du support magnétique et installez-la sur le dessus du tube de réaction de fraction positive (+).
  14. Chargez rapidement 5 ml de tampon MACS dans la colonne LS et placez le piston dans la colonne LS et appuyez dessus jusqu’à ce que la mémoire tampon entière soit à travers la colonne.
  15. Centrifuger le tube réactionnel contenant la fraction positive pendant 5 min à 300 x g.
  16. Retirer le surnageant, le ressusciter dans 500 μl de tampon MACS et le maintenir à 4 °C.
  17. Comptez la quantité totale de cellules à l’aide d’un dispositif de comptage de cellules commun.
  18. Préparer une suspension cellulaire à partir de la fraction triée positive contenant 2 x 105 cellules/μl dans un tampon MACS et la maintenir à 4 °C

4. Transplantation de cellules précurseurs de photorécepteurs triées par MAC dans la rétine de la souris

  1. Assurez-vous d’avoir toutes les solutions suivantes prêtes : 1 ml de PBS ou d’HBSS stérile, 10 μl de DNAse I, 1-2 ml stérile désioniséH2O,aliquotes des fractions de suspension cellulaire à 4 °C.
  2. Anesthésier la souris adulte(c.-à-d. âgée de 2 à 4 mois) avec une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de médetomidine (0,01 mg/10 g de poids corporel), de kétamine (0,75 mg/10 g de poids corporel). Ensuite, faites une injection sous-cutanée de buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel) pour soulager la douleur.
  3. Dilater les pupilles avec une goutte de phényléphrine 2,5%-Tropicamide 0,5%.
  4. Fixez la souris dans le support de tête de souris et placez-la au microscope stéréoscopique.
  5. Appliquez une goutte de gel visidique pour éviter le dessèchement de l’œil.
  6. Faire un petit trou à la frontière entre la sclérotique et la cornée (respectivement ora serrata)à l’aide d’une aiguille stérile de 30 G 1/2.
  7. Coupez une glissière de couverture commune en petits morceaux (environ 5 mm x 5 mm) à l’aide d’un stylo diamant, placez l’une de ces pièces sur le dessus de la cornée, permettant une visualisation directe de la rétine.
  8. Rincer la seringue microlitres préstérisée plusieurs fois avec de l’eau désionisée.
  9. Chargez la seringue microlitre avec 1 μl de suspension cellulaire, dirigez l’aiguille tangentiellement à travers la conjonctive et la sclérotique et placez-la sous contrôle visuel dans la moitié nasale de la rétine.
  10. Percer doucement un trou dans la rétine jusqu’à atteindre l’espace sous-rétinien, injecter la suspension cellulaire dans l’espace sous-rétinien.
  11. Observez le décollement bulleux de la rétine, qui doit être uniforme, couvrant environ 1/4 de l’espace rétinien sans aucun saignement.
  12. Retirez doucement la seringue, le trou rétinien scelle automatiquement.
  13. Rincer la seringue microlitre plusieurs fois avec de l’eau désionisée.
  14. Relâchez la souris du porte-tête.
  15. Réveillez la souris en injectant du chlorhydrate d’atipamozole pour inverser l’effet chlorhydrate de médétomidine.
  16. Placez la souris pour le temps de réveil dans une chambre sombre et chaude (environ 25 °C).
  17. Les 2 prochains jours après la transplantation, la buprénorphine (0,05 mg/kg de poids corporel) doit être administrée par injection sous-cutanée le matin et l’après-midi pour soulager la douleur.

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Résultats

Afin d’évaluer la capacité des photorécepteurs de tige à s’intégrer dans la rétine de la souris, une ligne de rapporteur de souris a été utilisée, dans laquelle GFP est entraîné par la fermeture à glissière de leucine de la rétine neurale (Nrl, Nrl-GFP) promoteur11. Nrl est le premier marqueur de photorécepteurs de tige commençant son expression à E12.5 tout au long de l’âge adulte, permettant un étiquetage spécifique des cellules photoréceptrices de tige de donneur.

Pn 4 Nrl-GFP ch...

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Discussion

La transplantation sous-rétinienne de cellules précurseurs de photorécepteurs représente un outil fiable pour réaliser l’intégration de ces cellules sensibles à la lumière dans les rétines de l’hôte en nombres significatifs1,2. Cela pourrait permettre la mise en place d’une thérapie cellulaire pour le traitement des maladies dégénératives de la rétine à l’avenir6. La population donneuse de cellules, actuellement isolée des rétines PN 4, est un mélange de différents types de cellules, à partir de laquelle seules les cell...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Nous tenons à remercier Anand Swaroop pour avoir fourni des souris Nrl-GFP, Jochen Haas pour son soutien technique et Sindy Böhme et Emely Lessmann pour l’élevage.

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, le CRTD Seed Grant Program, le SFB 655 et le ProRetina e.V. fondation, le programme d’études supérieures DIGS-BB dresde et la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Système de dissociation de la papaïneWorthington Biochemical CorporationLK003150fourni DNase I n’est pas utilisé dans la méthode
Rat purifié Anti-souris CD73, clone TY/23BD Pharmingen550738Concentration stock 0,5 mg/ml
Chèvre Anti-Rat IgG MicroBeadsMiltenyi130-048-501Volume total de 2 ml
PBSGibco10010-015Utilisé pour compter le nombre total de cellules
DNase ISigmaD5025-150KU
HBSSGibco14025050Utilisé pour la dissociation des rétines
Trypan blueSigmaFluka93595Utilisé pour compter le nombre total de cellules
VidisicDr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
DomitorPfizer76579
Kétamine 10 %Ratiopharm7538843
AntisedanPfizer76590
Phényléphrine 2,5 %-Tropicide 0,5Cliniques universitaires Dresde Pharmacie
Filtres de préséparationMiltenyi130-041-407
LS ColonnesMiltenyi130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303
Séparateur QuadroMACSMiltenyi130-090-976
Pipette Pasteur en verre poli au feuMarque74777 20La pipette' Les pointes doivent être polies au feu et autoclavées.
MACS Porte-tubes 15 mlMiltenyi130-091-052
Chambre de comptage cellulaireCarl RothT728.1
Tubes stériles de 15 mlGreiner Bio-One188271
Leica M651 MSDLeicaM651 MSDpeut être utilisé à la place de l’Olympus SZX10
Olympus SZX10peutêtre utilisé à la place du Leica M651 MSD
Stéréomicroscope inversé Olympus CKX41OlympusCKX41
Hotte de culture cellulaire Thermo Scientific MSC-AdvanceThermo Scientific51025411
1,5 ml Tube à réactionSarstedt727706400
2 ml Tube à réactionSarstedt72695
Centrifugeuse Eppendorf 5702VWR (Eppendorf)521-0733
Support de tête de sourismyNeurolab471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 inBD Pharmingen304000
Hamilton microlitre seringue 5 µ ; l, 75RNHamilton065-7634-01livré sans aiguilles
Hamilton RN aiguille spéciale 34 GHamilton065-207434émoussée, longueur 12 mm
Vannas-Tü ; bingen Ciseaux à ressort - Lames de 5 mm StraightFine Science Tools15003-08
Pince Dumont #7 - Titane BiologieFine Science Tools11272-40
Diamond penTools-tech
15 mm x 15 mm Cover slipsSparksMIC3366
 %

Références

  1. Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
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  4. Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
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  8. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
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  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

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