Microscopie optique quantitative: mesure de biophysique cellulaire Caractéristiques avec un microscope optique standard

Résumé

Nous décrivons l’utilisation d’un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, du volume et de la densité cellulaires grâce à une combinaison d’imagerie en champ clair et en contraste interférentiel différentiel.

Résumé

Nous décrivons l'utilisation d'un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume et la densité sur des échantillons cellulaires grâce à une combinaison de champ lumineux et contraste d'interférence différentiel imagerie. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d'effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC) pour déterminer le volume. NIQPM est basé sur un modèle simplifié de propagation de l'onde, appelée l'approximation paraxiale, avec trois hypothèses sous-jacentes: faible ouverture numérique (NA), éclairage faible diffusion, et la faible absorption de la lumière par l'échantillon. Heureusement, les échantillons cellulaires non colorées répondent à ces hypothèses et un éclairage faible NA est facile à réaliser sur des microscopes commerciaux. HTDIC est utilisé pour obtenir des informations volumétrique de par-focus DIC imagerie sous haute illumin NAconditions ation. Illumination NA élevé permet une meilleure découpe de l'éprouvette le long de l'axe optique. Transformée de Hilbert de traitement sur l'image DIC empile améliore considérablement les algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimen en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l'intensité de l'échantillon à partir de celles du fond. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique utilisant des microscopes "off-the-shelf". Il existe deux principales limitations de ces méthodes: lente z-stack temps d'acquisition sur les étendues commerciales abroge actuellement l'enquête de phénomènes plus rapidement que 1 image / minute, et d'autre part, des effets de diffraction limitent l'utilité de NIQPM et HTDIC à des objets de 0,2 à 10 (NIQPM) et 20 (HTDIC) um de diamètre, respectivement. Par conséquent, les spécimens et son temps associé dynamique d'intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l'utilisation de ces méthodes. Excitant, cellula plus fixespécimens r sont facilement étudiées avec ces méthodes.

Introduction

L'utilisation de la microscopie optique est désormais omniprésent dans l'enquête des organismes cellulaires. En raison de leur faible absorption et faible diffusion propriétés endogènes sur le spectre optique visible, les cellules n'affectent pas fortement l'amplitude des ondes optiques qui les traversent et donc apparaissent semi quand imagé avec des microscopes de champ lumineux standard. Échantillons cellulaires font, cependant, ralentissent ondes optiques qui transitent par eux d'une manière qui est linéairement liée à la quantité de masse volumique locale dans une région particulière de l'espace à travers lequel la lumière se déplace. L&#....

Protocole

Une. Microscope Spécifications

Pour faire de l'imagerie dans le bon mode microscope devrait avoir les caractéristiques suivantes:

1. Posséder à la fois contraste interférentiel différentiel (DIC) et fond clair (BF) contraste.
2. Avoir un mouvement d'axe z commandé par ordinateur.
3. Avoir un diaphragme d'ouverture réglable pour faire varier l'ouverture numérique de la lentille de condenseur. Une ouverture avec une règle graduée ou lecture électronique est nécessaire de connaître la valeur de l'ouverture numérique. L'ouverture numérique devrait se situer entre 0,1 pour NIQPM à 0,9 (ou ultérieur....

Résultats

Corriger éclairage de l'échantillon lors de l'acquisition de l'image par-focus est essentielle à la mise en œuvre réussie de la NIQPM un Algorithmes HTDIC nd. Dans la figure 2, nous illustrons éclairage basse et haute NA sous deux DIC et lumineux contraste de champ pour une sphère de polystyrène et le colorectal ligne de cellules d'adénocarcinome humain SW620. Figures 2A, 2C, 2I, et 2K démontrent imagerie optimale pour NIQPM. Figures 2F, 2H, 2N,.......

Discussion

En général, NIQPM est une technique de diffraction limitée validée sur le chemin optique des longueurs allant de 0,25 à 44,7. La validation a été effectuée sur n = 1,596 sphères de polystyrène de diamètre allant de 0,11 à 9,8 um en suspension dans Fluoromount G (données non présentées). Les cellules possèdent chemin longueurs optiques qui vont de près de 0-7.

Lorsque la mesure de la distribution de la densité d'un échantillon, on peut constater que l'image de pseudo DIC semble bien a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope Zeiss Axio Imager 2	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Allemagne	Microscope Axio Imager D2
Filtre vert (&lambda ; = 540 ± ; 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Filtre vert
SlideBook 5.5	software Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Logiciel d’acquisition d’images
Polystyrene microsphères	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Sphères en polystyrène
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Supports de montage