L'utilisation de puces microfluidiques pour l'imagerie en direct et l'étude des réponses blessures en Drosophila Larves

Résumé

Larves de drosophile sont un système de modèle intéressant pour l'imagerie en direct en raison de leur cuticule translucide et la génétique puissants. Ce protocole décrit la façon d'utiliser un dispositif de PDMS à une seule couche, appelée la «puce de larve» pour l'imagerie en temps réel de processus cellulaires dans les neurones du ^3ème stade larvaire chez la drosophile.

Résumé

Imagerie en temps réel est une technique importante pour l'étude des processus biologiques cellulaires, mais cela peut être difficile d'animaux vivants. La cuticule translucide de la larve de drosophile en fait un organisme modèle attrayant pour les études d'imagerie en direct. Cependant, un défi important pour les techniques d'imagerie en direct est d'immobiliser de façon non invasive et positionner un animal sur le microscope. Ce protocole présente une méthode simple et facile à utiliser pour immobiliser et imagerie larves de drosophile sur un polydiméthylsiloxane (PDMS) de dispositif microfluidique, que nous appelons la «puce de larve. La puce de larve est constitué d'un PDMS microchambre de bien ajusté qui est fixée à une lamelle de verre mince, qui, lors de l'application d'un vide par l'intermédiaire d'une seringue, immobilise l'animal et apporte structures ventrales tels que le cordon nerveux, les nerfs segmentaires, et le corps muscles de la paroi, à proximité de la lamelle. Cela permet d'imagerie à haute résolution, et, surtout, évite l'utilisation d'anesthetics et des produits chimiques, ce qui facilite l'étude d'un grand nombre de processus physiologiques. Etant donné que les larves de récupérer facilement l'immobilisation, ils peuvent être facilement soumises à de multiples sessions d'imagerie. Cela permet des études longitudinales plus de cours à temps allant de quelques heures à quelques jours. Ce protocole décrit étape par étape comment préparer la puce et la façon d'utiliser la puce pour l'imagerie en direct d'événements neuronaux dans 3 ^ème stade larvaire. Ces événements comprennent le transport rapide des organites dans les axones, les réponses de calcium à des blessures et des études time-lapse de la traite des protéines photo-convertible sur de longues distances et des échelles de temps. Une autre application de la puce est d'étudier et de régénération des réponses dégénératives à des lésions axonales, de sorte que la seconde partie de ce protocole décrit une procédure nouvelle et simple pour blesser axones dans les nerfs périphériques par un écrasement du nerf segmentaire.

Introduction

La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été utilisé comme un organisme modèle pour plus de 100 ans, et a prouvé contribué à définir la signalisation fondamentale et voies de développement qui sont conservées des invertébrés à l'homme. Imagerie en temps réel est une approche importante pour l'étude des mécanismes cellulaires, et le plan de corps simple et cuticule translucide de la larve de drosophile en fait un système attrayant pour l'imagerie en temps réel, d'autant plus qu'il existe de nombreux outils génétiques disponibles pour l'expression de protéines par fluorescence marqués dans des types cellulaires spécifiques.

Un défi important pour les techniques d'imagerie en direct est d'immobiliser de façon non invasive et positionner un animal pour la microscopie. Méthodes d'immobilisation classiques comprennent ^1,2 dissection ou l'utilisation de chloroforme, qui tous deux tuer l'animal. Les anesthésiques de l'éther ⁴ isofluorane et ^5-8 ont également été utilisés. Alors que les anesthésiques offrent de nombreux avantages, Ils inhibent également l'activité neuronale et la physiologie importante (y compris les battements du cœur) ^9-11, peuvent donc affecter le processus étudié et créer un stress sur l'animal. Il ya aussi des problèmes de sécurité des personnes pour travailler avec de l'éther et isofluorane.

Nous avons développé une méthode sans drogue pour immobiliser larves de drosophile dans un dispositif microfluidique couche de PDMS unique, que nous appelons la «puce de larve» ^12. Ce protocole décrit comment obtenir ou de faire la puce de larve, et comment l'utiliser pour l'imagerie en direct en début de scène stade larvaire ^{3 ème.} La puce est composée d'une microchambre de formes complémentaires, qui, lors de l'application d'un vide par l'intermédiaire d'une seringue, immobilise l'animal par l'intermédiaire d'une force mécanique douce. La méthode d'immobilisation apporte structures ventrales tels que le cordon nerveux, les nerfs segmentaires, et muscles de la paroi du corps, à proximité de la lamelle de verre. Cela permet d'imagerie à haute résolution de ces structures avec aper numérique hauteture (fort grossissement) objectifs.

Les avantages de la puce de larve par rapport aux autres techniques classiques comprennent les suivantes: (i) l'utilisation de la puce de larve remplace l'utilisation de produits chimiques, ce qui permet pour l'imagerie in vivo d'animaux non anesthésiés. (Ii) Les larves de récupérer immédiatement après la sortie de la puce (par opposition à une période de récupération de 2 heures pour isofluorane ^8,13). Cela permet pour l'imagerie sur des échelles de temps larges, allant de millisecondes à quelques minutes, des heures et des jours. (Iii) L'utilisation de PDMS, qui est un matériau perméable aux gaz, permet de diffusion en continu d'oxygène / air provenant de l'environnement dans le corps de chenille. (Iv) La puce est sûr et facile à utiliser, et (v) il est réutilisable et peut être fabriqué à un coût minime.

En plus des instructions pour l'utilisation de la puce de larve, ce protocole fournira plusieurs exemples de son utilisation pour étudier les événements neuronaux dans 3 ^ème stade larvaire. Il s'agit notamment de l'imagerie en direct de Axonal le transport, les réponses de calcium à des blessures et des études time-lapse de la traite des protéines photo-convertible sur de longues distances et des échelles de temps.

Une autre application de la puce est d'étudier les réponses neuronales à des lésions axonales. Pour cette une procédure supplémentaire est décrit (en partie 3) pour blesser axones dans les nerfs périphériques par un écrasement du nerf segmentaire. Ce test simple peut être réalisée à la fois rapidement et de façon reproductible sous un stéréomicroscope à dissection standard, ce qui permet un grand nombre d'animaux devant être traités en même temps. Réponses cellulaires à la blessure peuvent être étudiés par imagerie en temps réel dans la puce de la larve.

Protocole

Une. Faire la puce PDMS

Pour faire une puce de PDMS du moule SU-8, suivez les étapes 1.1 à 1.7. Si une puce est à portée de main, mais doit assemblé pour l'utilisation, passez à l'étape 1.8.

1. Mélanger 45 g de base PDMS et 4,5 g d'agent (ratio 10:1) durcissement d'un kit PDMS dans un petit récipient en plastique jetable et les mélanger soigneusement à l'aide d'un bâtonnet en plastique.
2. Placer le récipient dans un récipient sous vide (par exemple un dessiccateur) pendant 10 min pour éliminer les bulles.
3. Placer le moule SU-8 sur le fond d'un plat de 150 mm de diamètre en plastique et verser lentement le mélange sur le moule PDMS. Prenez soin de ne pas générer des bulles tout en versant les PDMS.
4. Guérir les PDMS dans un four (ou incubateur) à 650 ° C pendant 4 heures.
5. Retirer le moule PDMS/SU-8 guéri du four et le laisser refroidir pendant quelques minutes.
6. En utilisant une lame de rasoir, couper les PDMS durci le long du bord du moule SU-8 et le détacher de SU-8 moule.
7. Divisez la dalle de PDMSen PDMS puces individuelles en utilisant une lame de rasoir.
8. En utilisant une aiguille 21 G de distribution, percer un trou dans le port de vide (représenté sur la figure 1A) de la puce PDMS.
9. Prenez une aiguille 23 G de distribution et tordre l'aiguille de sa base à quelques reprises pour casser l'aiguille pointe hors du moyeu de verrouillage.
10. Insérer la pointe d'aiguille de 23 G dans un petit morceau de tube de polyethylene de sorte que le tube recouvre au moins un millimètre de l'aiguille. Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour couper l'excès de tube loin de l'aiguille. Cela crée un anneau en plastique autour d'une extrémité de l'aiguille, ce qui va créer un joint d'étanchéité lorsqu'il est inséré dans l'orifice d'admission de vide.
11. Pour une utilisation avec un microscope inversé (figures 1B et 2A-B): insérer la pointe d'aiguille 23 G dans le trou de l'orifice d'aspiration. Pour une utilisation avec un microscope droit (figures 1C et 2C-D): percer un deuxième trou sur le côté de la puce PDMS 21 G DispeNsing aiguille; ce trou donnera accès au premier trou sur le côté. Ensuite, insérez la pointe de l'aiguille 23 G avec une bague de tuyau dans le trou latéral. Placez un morceau de ruban adhésif double face sur le dessus de la puce PDMS pour sceller le trou du haut (figure 1C).
12. Prenez un morceau de tube en polyéthylène qui est d'environ 20 cm de longueur. Connecter un côté du tube à l'extrémité de l'aiguille qui est insérée dans l'orifice de vide.
13. Branchez l'autre extrémité du tube à l'un des ports d'une vanne 3 voies (voir '3-way robinet »dans la liste des matières)
14. Attacher une seringue de 20 ml dans l'un des deux ports restants. Le dernier orifice est ouvert à l'environnement.

2. Utiliser le chip Larve pour l'imagerie en direct

1. Nettoyez la puce PDMS avec du ruban adhésif transparent. Fixez un morceau de ruban adhésif à la partie inférieure de la puce. Assurez-vous que la bande est en contact avec toute la surface de PDMS, puis décoller le ruban.
2. Répétez l'étape ci-dessus 2-3x pour s'assurer qu'il n'yn'y a pas de particules ou de l'huile (retenues à partir d'expériences antérieures) sur la surface de la puce PDMS. Depuis la puce PDMS est réutilisable, il est très important pour éliminer les résidus d'huile car il peut affecter l'adhérence de PDMS à verre et entraîner l'insuffisance étanchéité.
3. Transfert tôt (c'est à dire la recherche de nourriture) 3 ^e stade larvaire à une boîte de Pétri contenant de l'eau. (Les larves de stade larvaire butinage ^{3 e} sont dans l'aliment, plutôt que du côté de la fiole de culture). Baigner les larves dans l'eau pour éliminer le milieu de culture.
4. Prenez une lamelle de verre propre et placer une petite goutte d'huile sur les halocarbures 700 en son centre.
5. En utilisant des pinces, prendre doucement un chiffon propre, en début de scène 3 ^e stade larvaire de l'eau (la larve doit être ~ 3,5-4 mm de longueur). Placez l'animal brièvement sur une lingette ou une serviette en papier léger pour enlever l'excès d'eau, puis placez-le sur la goutte d'huile. La chute doit être assez petit de sorte que la trachée du larves sont pas revêtue. Laissez la station de larvey sur la goutte d'huile pendant 10 sec.
6. Retirer la larve de la goutte d'huile, puis placez-le sur une lamelle de verre propre.
7. Transférer la larve à l'autre lamelle de verre propre. Cette étape élimine l'excès de sébum.
8. Faites attention à l'orientation de la larve. Pour imager la moelle épinière et les nerfs segmentaires de neurones, la face ventrale de la larve doit s'asseoir sur la lamelle. Sa face dorsale, caractérisé par deux tubes trachéaux longitudinales, devrait faire face vers le haut. Note: ceci est l'orientation la larve préfère naturellement.
9. Placez délicatement la puce PDMS sur le dessus de la larve. La chenille doit être aligné sur le centre du milieu de la microchambre, avec sa orientée vers l'orifice de vide queue. Veillez à ce que la larve ne touche pas les bords de la chambre. Ceci est particulièrement important pour les terminaux antérieure et postérieure de la trachée. Remarque: cette étape est le mieux fait sous une loupe binoculaire.
10. Poussez la puce PDMS contre la lamelle de verre pour obtenir une bonne étanchéité. Assurez-vous que la larve est entièrementclos par la microchambre lorsque la puce PDMS est en contact avec la lamelle de verre.
11. Commuter la vanne à 3 voies de telle sorte que la seringue peut aspirer de l'air à partir de la microchambre PDMS (à travers le tube) pour créer un vide.
12. Avec une main, maintenez la lamelle puce PDMS / verre fermement. Utilisez l'autre main pour tirer le piston de la seringue. Retirer 2-2,5 ml d'air, jusqu'à sentir une résistance dans la poignée de seringue, pour créer le vide. Le vide produit un joint étanche entre la puce PDMS, de l'huile, et des interfaces de la lamelle et limite la mobilité de la larve.
13. Commuter la vanne hors tension de telle sorte que la puce PDMS est isolé de la seringue et de l'environnement. En conséquence, un niveau de vide relativement stable est maintenue dans la microchambre sans qu'il soit nécessaire pour maintenir le piston de la seringue.
14. Vérifiez la larve sous le stéréoscope pour s'assurer que le corps de l'animal entier est placé à l'intérieur de la microchambre, et que l'animal est immobile. La trachée doit être visible. Le reste de l'Puce PDMS doit être en contact avec la lamelle. Note: Voir les figures 2E et 2F pour des exemples d'animaux correctement immobilisés dans la puce. Certaines orientations incorrectes sont présentés dans les figures 2G et 2H.
15. Placez la puce de larve (puce PDMS + lamelle de verre) sur le microscope. La puce de larve, la tuyauterie et la seringue doivent être manipulés avec soin pour éviter le détachement de la puce PDMS de la lamelle. Pour un microscope droit, fixer le côté «haut» de la puce à l'étape de microscope avec du ruban adhésif double-face (figure 1C).
16. Utilisez un objectif à fort grossissement (immersion d'huile, 40-63X est recommandé) pour localiser la structure (s) de l'animal d'intérêt et effectuer l'imagerie. Dans certains cas, un grossissement plus faible peut être nécessaire pour identifier la région souhaitée de formation d'image avant de passer à un plus fort grossissement.
17. Lorsque l'imagerie est terminée, libérer le vide par la vanne de commutation à la positionqui est ouvert à l'environnement.
18. Détachez la puce PDMS de la lamelle. La larve doit être immédiatement mobiles.
19. Utilisez une pince pour enlever la larve de la microchambre et placez doucement la larve sur une plaque de gélose jus de raisin pour la récupération.

3. Induisant une blessure par écrasement du nerf de nerfs larves segmentaires

1. Suivez l'étape 2.3 ci-dessus pour isoler début étapes 3 ^e stade larvaire du génotype désiré. Comme décrit dans l'étape 2.3 baignent les larves dans l'eau pour enlever la nourriture.
2. Utilisez une station de l'anesthésie norme mouche CO _2, de CO ₂ pad maintenu sous une loupe binoculaire de dissection, pour maîtriser les larves. Les larves devrait devenir immobiles après le placement sur ​​le CO ₂ pad pendant 1-2 min.
3. Maintenant, placez une seule larve anesthésié sur une plaque de gélose jus de raisin sous la loupe binoculaire. Tournez la face ventrale de l'animal à visualiser la corde nerveuse ventrale et segmentaire des nerfs à travers la cuticule ( Figure 3). Assurez-vous que la larve est complètement immobiles.
4. Utilisation Dumostar numéro 5 pince, pincer les nerfs segmentaires bien à travers la cuticule pour 5-10 sec. Lorsque cela est fait correctement, la cuticule reste intacte et la paroi du corps n'est pas percé. Note: La blessure peut être effectuée à différentes positions le long de l'axe du corps antérieur-postérieur, aussi longtemps que le cordon ventrale du nerf, les glandes salivaires, l'intestin et ne sont pas endommagés. L'endroit le plus efficace de la blessure est vers l'extrémité du segment abdominal de ^{3 e,} comme représenté sur la figure 3D. Blessures dans ce lieu endommage les nerfs et la plupart le plus facile à reproduire sans tuer l'animal.
5. Après la blessure, tourner l'animal de telle sorte que sa face ventrale vers le bas sur la plaque de raisin. Il devrait être en mesure de déplacer sa tête et manger. Si la blessure a été un succès, alors la moitié postérieure de la larve sera paralysé.
6. Gardez les animaux blessés sur la plaque de gélose de jus de raisin à 25 ans &# 176; C pendant le temps voulu en fonction de l'objectif expérimental. Pour motoneurones, le moignon proximal commence à germer dans les 8-10 heures de blessure ^14, et le moignon distal commence à dégénérer dans 6-8 h ^15. Pour la classe IV da neurones sensoriels, le moignon proximal commence à germer dans les 4-6 heures, et le début de moignon distal à dégénérer dans 3-4 heures après la blessure. Remarque: avec les pilotes Gal4 appropriées et rapporteurs fluorescents, la germination et la dégénérescence peuvent être observés dans la puce de la larve (par exemple, voir la figure 6).

Résultats

La puce de larve est constitué d'un bloc unique couche de PDMS, (une puce de PDMS) dont la conception est décrite dans le schéma de la figure 1. (Voir aussi le fichier DXF supplémentaire pour la conception de votre propre moule). Le microchambre de larve, le port de vide, et les canaux de périmètre (figure 1A) de 140 um empreintes dans la puce PDMS. La puce est placée sur le dessus d'un début de mise en scène 3 ^e stade larvaire, qui repose sur une lamelle avec de l'huile (figures 1B et 1C). L'interface huile-glace entre la lamelle et la puce PDMS permet un joint d'étanchéité doit être créé lors de l'application d'un vide modéré. Ce joint emprisonne les larves à l'intérieur de la chambre, et depuis le début de mise en scène 3 ^ème stade larvaire est légèrement plus épaisse que la chambre, la chambre d'étanchéité crée une certaine constriction physique sur l'animal, de manière efficace et de blocage limitant son mouvement. Dans cet état immobilisé, certains ventralestructures de l'organisme, comme la corde nerveuse ventrale et segmentaire sont poussés à proximité de lamelle. Ceci est avantageux pour l'imagerie, puisque dans l'état immobilisé ces structures peuvent se situer dans la distance de travail de 40X et 63X objectifs. Après que le vide est libéré, la larve peut être facilement retiré de la microchambre, ce qui permet des expériences supplémentaires à effectuer. Cette approche d'immobilisation purement mécanique peut garder 90% des larves vivantes après des périodes d'immobilisation continue jusqu'à 1 h ^12.

Le vide est créé par une simple seringue de 20 ml, d'où l'ensemble de l'unité est facile à transporter à partir d'un stéréomicroscope, où le positionnement de la chambre est réalisée, à un microscope confocal ou d'épifluorescence, où l'imagerie est effectuée en temps réel. La seringue est raccordé à l'orifice de vide par l'intermédiaire d'un tube de polyethylene et de 23 g d'aiguilles de distribution (avec des moyeux de verrouillage enlevés), comme décrit dans les étapes 1.6 à 1.14. Pour microscopes inversés, le tubeet la seringue sont reliés par l'intermédiaire de la partie supérieure de la puce (Figures 1B, 2A, et 2B). Pour microscopes droits, ils sont connectés par l'intermédiaire d'un port du côté de la puce (figures 1C, 2C et 2D). La configuration pour microscopes inversés est un peu plus facile à utiliser. La seringue est tiré afin de créer un léger vide (d'environ 10 psi), qui se lie à l'interface huile-verre-PDMS pour former un joint étanche entre la lamelle et le dispositif de PDMS, de piégeage et d'immobilisation de la chenille à l'intérieur de la chambre.

Le placement de la larve dans la microchambre (étapes 2.7 à 2.10 dans le protocole) est essentiel pour l'immobilisation et la survie (figures 2E-H) efficace. Si l'animal est trop grand pour la chambre (figure 2G), ou si la tête ou de la trachée sont piégés entre le bord de la chambre et les couvertureslèvre (Figure 1H), alors il est peu probable de survivre à la procédure.

Ce qui suit sont quelques exemples de l'utilisation de la puce larves d'étudier diverses réponses cellulaires dans les neurones (figures 4-7, Film S1 et S2 Film).

Imagerie du transport axonal rapide: La puce de larve a été utilisé pour l'image de la transport kinésine médiation de vésicules synaptiques dans les axones périphériques individuels (Figure 4 et Film S1) Le antérograde (~ 1,0 um / s) et rétrograde (~ 0,8 um / s. ) mouvement de ces vésicules peut être facilement étudiée à partir de films recueillies sur un microscope confocal à disque rotatif.

Le positionnement de l'animal pour la microchirurgie à laser:. Un neurone sensoriel dendrite a été sectionné au moyen d'un laser pulsé à colorant UV (figure 5 et le film S2) Les protocoles pour l'utilisation de tsa méthode pour la microchirurgie peut être trouvée ailleurs ^16,17. La technique d'immobilisation efficace permet de modifier rapidement les échelles de temps dans le neurone blessés, tels que les changements du calcium intracellulaire (détectées par le Ca ^{2 +} indicateur GCamp3.0 génétiquement codé ^18), à être détectées et mesurées (Figure 5).

Etude des réactions de régénération et dégénératives de blessures: Si l'animal est autorisé à se reposer entre les séances d'imagerie, la puce de larve ensuite être utilisée pour étudier les événements cellulaires qui se produisent sur ​​une large gamme d'échelles de temps. Par exemple, à la fois «régénération» et les réponses dégénératives à des lésions axonales, qui se déroulera sur une échelle de temps de 15 heures, peuvent être visualisés dans la puce de la larve (figure 6). Dans cet exemple, les axones des motoneurones octopaminergique ont été blessés par l'écrasement du nerf segmentaire (figure 3), décrite dans la partie 3 du protocole. La souche d'axone proximal,qui subit une nouvelle germination, et les axones distaux, qui forment des varicosités et deviennent alors fragmentée à travers le processus de dégénérescence wallérienne, peuvent être visualisés et étudiés à différents intervalles de temps après l'accident.

Suivi des protéines fluorescentes photoconvertible au fil du temps in vivo: Le développement de protéines fluorescentes photoconvertible, dont la fluorescence change de manière irréversible lors de l'exposition à la lumière UV) permet d'étiqueter spécifiquement un sous-ensemble de protéines dans une cellule, et de suivre le sort des protéines marquées au fil du temps ^{19 , 20.} Cette technique est le plus souvent effectuée dans une culture de cellules, cependant, avec la puce de larve, on peut suivre les protéines photoconvertible codés génétiquement dans des cellules déterminées in vivo. A titre d'exemple, nous montrons que la protéine α-Denda2-tubuline fusion, exprimée en classe IV da neurones sensoriels, peut être photoconverted dans les corps cellulaires (figures 7A et B). Le transport des protéines photoconverted peut ensuite être suivi dans le temps: dans les deux jours nous avons pu détecter une quantité importante de protéine photoconverted dans les terminaisons axonales des neurones sensoriels, qui se situent d'environ 1 mm à une distance à partir de l'emplacement d'origine dans le corps de la cellule (Figures 7A et 7 C).

Tous les exemples décrits (figures 7.4 et Films S1 et S2) ont été imagées en utilisant un système confocal à disque rotatif, constitué par un dispositif de balayage de Nipkow CSU10 et une caméra C9100-50 EMCCD, montés sur un observateur Axio à 63X (1,5 NA) Objectif de l'huile, et entraîné en utilisant un logiciel d'acquisition Volocity.

Figure 1. dessins schématiques pour l'utilisation de la puce de larve.
(A) La puce de chenille est constitué de la puce PDMS, indiqué en bleu clair, collé sur une lamelle de verre. La puce contient 140 um d'épaisseur canaux microfluidiques, indiquées en blanc. Le microchambre centrale est conçue pour s'adapter parfaitement mis en scène un début de 3 ^e stade larve de drosophile (caricaturé en vert clair). Un fichier DXF contenant dimensions exactes qui peuvent être utilisés pour concevoir le moule est fourni de données supplémentaires. Barre d'échelle = 1,5 mm. (BC) Side-vues de schémas pour le chargement d'une larve dans une puce de larve. La larve se trouve face ventrale vers le bas sur une lamelle, et son corps se trouve dans la 140 um profonde microchambre. Une seringue de 20 ml est relié à l'orifice d'admission de vide et est utilisé pour induire un léger vide. L'interface huile-PDMS-verre halocarbures est tenu par le vide dans un joint étanche, ce qui limite la larve dans la microchambre. Ce sceau est facilement réversibleen relâchant la pression de la seringue, après quoi l'animal reprend immédiatement la motilité. Pour microscopes droits (B), le vide de la seringue est relié par l'intermédiaire d'un tube de polyéthylène-50 à partir du sommet de la puce. Pour microscopes inversés (C), ces connexions sont faites à partir du côté de la puce, tandis que le 'top' de la puce est fixé à la platine du microscope par un adhésif double face.

Figure 2. Images de puces PDMS et le positionnement correct de la larve.
(AD). Photographies montrant PDMS puces pour microscopes inversés et verticaux. Le G pointe de l'aiguille 23 de distribution a été inséré dans l'orifice de vide, qui permet une connexion via un tube à vide (seringue). Barre d'échelle = 1,5 mm. (EH). de drosophile immobilisé. E et F montrent des exemples d'animaux correctement immobilisés. Le petit animal dans F est préférable si plusieurs images sur des échelles de temps de temps (> 12 h) seront effectuées. G montre un animal qui est trop grand, et H montre un petit animal qui est mal positionné. Barre d'échelle = 1,5 mm. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 3. Écrasement du nerf blessure des nerfs segmentaires larves de drosophile.
(A) de bande dessinée de l'essai par écrasement du nerf. Les nerfs segmentaires dans un ^e 3 (B) Vue de système nerveux larvaire d'un animal disséqué 20 heures après écrasement du nerf. Immunocoloration pour les membranes neuronales avec des anticorps anti-HRP (rouge) met en évidence les lobes du cerveau, chaîne nerveuse ventrale et longs nerfs segmentaires qui contiennent motoneurone et les axones des neurones sensoriels. Un sous-ensemble des motoneurones individuels sont étiquetés par l'expression de la SAMU mCD8-GFP (vert) de conduite avec le pilote m12-Gal4. Les corps cellulaires et les dendrites de ces neurones se trouvent dans le cordon nerveux ventral, tandis que leurs axones projettent de muscles de la paroi du corps par les nerfs segmentaires. (Ce-ci conduit également l'expression de GFP dans le muscle 12 pour chaque hemisegment larvaire, qui, ensemble, peuvent être considérés comme des rayures antéro-postérieur de chaque côté de l'animal). La zone endommagée par l'écrasement est souligné en pointillés bleus. Barre d'échelle = 70 um. (C) Gros point de vue des axones endommagés, 20 heures après l'accident. Gauche: laaxone proximal a subi la germination et une nouvelle croissance. Droite: l'axone distal est fragmenté, avec peu de GFP reste, en raison de la dégénérescence wallérienne et élimination des débris. Barre d'échelle = 10 um. (D) Images de la écrasement du nerf dans un début de 3 ^e stade larvaire. La flèche rouge à la corde nerveuse ventrale. L'emplacement de l'écrasement est vers le bas de la troisième tronçon, tel que décrit dans le texte Protocol (protocole 3). Les images de D ont été initialement publiés dans J. Cell Biol 191, 211-223, doi:.. 10,1083 (2010) Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 4. Imagerie time-lapse du transport axonal des vésicules synaptiques peptidergiques. L'rat peptide natriurétique auriculaire ANF marqué à la GFP, UAS-GFP ^ANF-21, a été exprimée dans les motoneurones spécifiques en utilisant le pilote veille-RRa-Gal4 ^22. Imagerie en temps réel de nerfs segmentaires révèle le transport rapide d'ANF-GFP étiqueté vésicules peptidergiques dans les axones. Voir aussi Film S1. (A) des cadres uniques de axones des neurones moteurs de l'imagerie en direct time-lapse. Les flèches vertes, rouges et bleues indiquent les exemples des antérograde, vésicules stationnaires et rétrogrades, respectivement. Barre d'échelle = 5 um. (A ') des échéances individuelles du film ont été fusionnés à l'aide ImageJ. (B) Un kymographe généré par imagerie time-lapse de transports ANF-GFP, a été généré à partir d'une collection d'images uniques couvrant une minute de temps d'imagerie utilisant le «Multiple Kymographe 'plug-in pour ImageJ ^23. (C) Quantification des vitesses moyennes de segments, qui ont été calculées à partir des pentes des traces segmentés en kymographs. La barre verte présentationvitesse ts antérograde segmentaire (n = 543) et la barre bleue présente vitesse rétrograde segmentaire (n = 548) des vésicules de 10 kymographs. (D) Quantification de la densité de particules. densité des particules a été mesurée par le nombre de antérograde (montré dans la barre verte), des particules immobiles (montré dans la barre rouge) et rétrogrades (montré dans la barre bleue) par 100 um de longueur de l'axone de 10 kymographs. Les données de cette figure ont également été publiés précédemment dans Ghannad-Rezaie et al, PLoS One 7 (1), e29869, doi:. 0.1371/journal.pone.0029869 (2012).

Figure 5. Utilisation de la puce de larve pour la microchirurgie à laser et l'imagerie du calcium.
Une dendrite d'un neurone sensoriel classe IV est découpée par des impulsions laser à haute puissance d'une UV laser à colorant pulsé. Les protocoles pour l'utilisation de ce procédé pour la microchirurgie se trouvent ailleurs ^16. L'immobilisation efficace dans la puce de larve permet des changements rapides dans les niveaux de calcium intracellulaire pour être étudiés par imagerie en temps réel. Dans cet exemple, l'indicateur de calcium GCaMP3.0 génétiquement codé a été exprimé dans la catégorie IV dendritique arborisation (C4da) des neurones sensoriels en utilisant le pilote PPK-Gal4. (A) des images de Time-Lapse de l'intensité de GCaMP3.0 étaient fausses de couleur selon la couleur échelle d'intensité pour indiquer les changements de l'intensité au fil du temps. Images individuelles ont été extraites de la vidéo time-lapse (Film S2) une image sur un microscope confocal à disque rotatif à 5 images / sec. (B) Quantification de la dynamique de calcium en réponse à la microchirurgie au laser. Le facteur de variation normalisée de soma GCaMP3.0 intensité de fluorescence (ΔF/F0) des neurones individuels a été tracée en fonction du temps (n = 7, représenté en gris). Le ΔF/F0 moyenne était représenté en orange. On a observé l'augmentation du pic de l'intensité de GCaMP3.0 entre 1-2 sec après une blessure. Arrière-plan a été soustraite de l'intensité de fluorescence G-CaMP3.0 brut. Les données de cette figure ont également été publiés précédemment dans Ghannad-Rezaie et al, (2012) PLoS One 7 (1):. E29869. doi: 10.1371/journal.pone.0029869 ^12.

Figure 6. Imaging bourgeonnement axonal et la dégénérescence en utilisant la puce de larve. Images confocales représentatives du moignon proximal (à gauche) et moignon distal (à droite) des axones des neurones moteurs octopaminergique à différents moments après l'écrasement du nerf. Les images ont été prises à des emplacements similaires comme le montre la figure 3C. Ces neurones sont marquées par l'expression d'un transgène UAS-mCD8-DP conduite en utilisant le Tdc2-Gal4 ^24,25 conducteur. Les corps cellulaires de ces neurones se trouvent dans le nerf ventrale cordon ^24. Trois axones individuels peuvent être vus dans un seul nerf segmentaire, et sont facilement résolus les uns des autres. Ceci est une situation idéale pour l'étude des événements cellulaires individuelles, telles que la fragmentation des axones en dégénérescence, qui est complète en 15 heures pour ces neurones. Les images ont été obtenues à partir d'animaux vivants à l'aide de la puce de larve à 63X grossissement sur un microscope confocal à disque rotatif. Barres d'échelle = 10 um pour panneaux de gauche (souches proximales) et 20 um pour les panneaux droits (souches distales). Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 7. Utilisation de la larvepuce pour suivre des protéines fluorescentes photoconverted sur de longues distances et temps dans les animaux vivants.
Dans cet exemple, une protéine de fusion de la protéine fluorescente photoconvertible Dendra2 ^19, fusionné à α-tubuline, est exprimée à partir d'un transgène UAS-Dendra2-α-tubuline de classe IV arborisation dendritique (C4da) des neurones sensoriels, en utilisant le pilote ppk-Gal4 ^26. (A) Représentation schématique de l'expérience de photoconversion. Les corps cellulaires des neurones C4da se trouvent dans la périphérie et s'étendent axones à travers les nerfs segmentaires pour former terminaisons synaptiques dans le cordon nerveux. Le Dendra2-α-tubuline l'intérieur d'un sous-ensemble de corps cellulaires à la moitié postérieure de l'animal est soumis à une phototransformation par éclairage UV pendant 6 s à l'aide d'un filtre DAPI standard avec une lampe Hg (de bande de gauche). Après un temps, le Dendra2-α-tubuline photoconverted peut être détecté dans les terminaisons synaptiques dans le cordon nerveux ventral. Cela indique que la protéine de tubuline a été Tranarboré sur une longue distance (de ~ 1-2 mm). Images barre d'échelle = 1 mm (B) Exemples de Dendra2-α-tubuline dans un corps cellulaire des neurones sensoriels de classe IV avant et après photoconversion. Barre d'échelle = 5 um. (C) des exemples d'images de terminaisons synaptiques pour la classe IV neurones sensoriels à 0 h ou soit 48 heures après photoconversion de corps cellulaires. L'aspect particulier de photoconverted Dendra2-α-tubuline dans les terminaisons synaptiques après le temps implique que la protéine a voyagé dans le corps de la cellule à l'axone terminal. Photoconversion et l'imagerie à tous les points dans le temps a été menée dans la puce de la larve. Barre d'échelle = 15 um. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Film S1. du microchirurgie au laser et l'imagerie calcique d'un neurone C4da. Un laser UV pulsé a été utilisé pour sectionner une primbranche dendritique aire. Laser résection induit une augmentation rapide de l'intensité GCaMP, qui a débuté sur le site de la blessure et a voyagé sur le corps de la cellule. SAMU-GCaMP3.0 ¹⁸ a été exprimé en utilisant le pilote spécifique PPK-Gal4 C4da ^26. Les films étaient fausses couleurs pour indiquer les niveaux d'intensité relative des GCaMP3.0. L'imagerie time-lapse a été réalisée avec disque tournant microscopie confocale à 5 images / sec.

Film S2. du transport axonal rapide d'ANF-GFP dans les motoneurones.
Le rat peptide natriurétique auriculaire ANF marqué à la GFP, UAS-GFP ^ANF-21, a été exprimé dans les motoneurones spécifiques en utilisant le pilote veille-RRa-Gal4 ^22. Le transport de ces vésicules à l'intérieur peptidergiques nerfs segmentaires de larves a été imagée sur la puce de larve à 300 msec / cadre à l'aide d'un microscope confocal à disque rotatif.

Figure 1 supplémentaire (fichier DXF)
fichier DXF pour le silicium fabrication de moules. Le fichier est conçu pour le négatif masque de résine photosensible (masque sombre déposé SU-8) sur une tranche de 4 pouces de silicium. La deuxième ligne contient 5 moules pour la fabrication des puces de larve utilisés dans ce protocole. Chacune de ces puces (en ligne 2) contiennent une chambre ~ 5,4 mm x 1,5 mm conçu pour s'adapter à un 3 ^ème stade larvaire au stade précoce. La première ligne (ligne 1) contient une chambre plus grande (~ 5,4 mm x 2 mm), tandis que la troisième ligne (ligne 3) contient une chambre plus petite (~ 4.4mm x 1.5mm). Ceux-ci peuvent être utilisés avec des larves de tailles plus grandes et plus petites, respectivement. Barre d'échelle = 2 mm.

Discussion

Faire ou l'obtention de la puce de larve:

La puce de la larve se compose d'un bloc de PDMS (appelée la «puce PDMS ') fixée à une lamelle de verre. Le protocole décrit à l'étape 1 de la procédure de fabrication et d'utilisation des copeaux de larve, en supposant un moule SU-8 est disponible. Le moule SU-8 est microfabriqué en motif par photolithographie par une épaisse couche de résine photosensible SU-8 de 140 um sur une plaquette de silicium (pour les détails voir Ghannad-Rezaie et al. ^12). Comme la microfabrication de la moule SU-8 nécessite un accès à de l'équipement spécialisé, nous vous conseillons de commander à partir d'une installation de microfabrication (p. ex. L'installation LNF à l'Université du Michigan ^14), ou d'une fonderie en leur envoyant la conception de la puce qui est fourni comme un dossier complémentaire. Si l'on veut changer la conception de la puce PDMS (par exemple pour une utilisation avec des larves de différentes tailles), un logiciel de CAO qui gère les fichiers DXF (Autocad par exemple) peuvent être utilisés. Un SU-8 moule peut également être faite en interne suivant les instructions de Mondal et al. ²⁷ Beaucoup de lecteurs peuvent trouver pratique d'obtenir simplement une puce de PDMS de l'échantillon à tester la technique avant de fabriquer leurs propres puces. Ce sera mis à disposition gratuitement sur demande.

L'utilisation de la «puce larve" microfluidique pour l'imagerie en direct:

Procédé d'immobilisation dans la puce de larve évite l'utilisation d'anesthésiques, et comporte à la place la pression, via l'application d'un vide, pour restreindre le mouvement de l'animal. Alors que les animaux peuvent survivre immobilisation dans la puce pour plusieurs heures ^12, une période d'immobilisation plus courte (5-15 min) est recommandé. C'est assez de temps pour l'imagerie de nombreux événements cellulaires d'intérêt, y compris les modifications du calcium intracellulaire, ou le transport axonal rapide. C'est aussi un temps suffisant pour les manipulations souhaitées dans les animaux vivants, comme le laser à base de microchirurgie, photoblanchiment, et photoconversion.

Pour étudier les événements longitudinalement sur une période de temps plus longue chez un seul animal, les animaux peuvent être placés dans la puce et imagés plusieurs fois, séparées par des périodes de repos. plaques d'agar jus de raisin sont idéales pour se reposer entre les séances d'imagerie, car ils fournissent une source de nourriture facile et de l'humidité. Plusieurs sessions d'imagerie affectent la survie des larves à un degré, puisque chaque session comporte un certain risque pour endommager l'animal (voir partie 2 en dépannage, ci-dessous). Les animaux peuvent être imagés en routine> 5 fois au cours de deux jours, avec un taux de survie supérieur à 50%. Comme les animaux ne sont pas anesthésiés, ils sont en bonne santé et mobiles, immédiatement après la libération de la dépression dans la puce. Il n'y a donc pas besoin de temps de récupération entre les séances d'imagerie, de sorte que l'intervalle de temps entre des sessions est flexible et peut être adapté aux objectifs de l'expérience.

Dépannage:

C'est la technique la plus courantepoursuit avec le morceau de larve et solutions recommandées sont les suivantes:

(1) L'animal se déplace trop. Trop de mobilité peut interférer avec les objectifs d'imagerie. Les raisons les plus communes pour ce dans la puce de la larve sont a) l'animal est trop petit pour la puce, ou b) la dépression appliquée lors de l'étape d'immobilisation est compromise. La puce de larve décrite dans ce protocole est conçu pour le début de mise en scène 3 ^e stade larvaire. La taille optimale de l'animal est de 3,5 à 4 mm de longueur (selon l'axe antéro-postérieur). Afin de s'assurer que la pression de vide est suffisante, retirer la seringue de 2 à 2,5 ml, ou jusqu'à sentir une résistance dans la poignée. Une indication que le vide fonctionne est que les petites bulles dans le canal périmétrique peuvent être vus se déplaçant lentement vers la source de vide. Une autre indication est que la lamelle doit toujours voyager avec la puce lorsque la puce est levé par le haut (et c'est la méthode recommandée pour le transport de la chambreune fois que les larves est positionné et le vide est présent). Le vide peut être compromise si il existe des fissures dans le tube, ou si il est de l'huile dans le tube. Ceci peut être facilement traitée par le remplacement de la 23 G distribution pointe de l'aiguille et de polyéthylène-50 tubes (de 01.06 à 01.14 étapes).

(2) L'animal meurt après l'imagerie dans la puce. La procédure est destinée à provoquer un minimum de stress sur l'animal, et les animaux de génotype sauvage ont un taux de survie> 90%, même après une heure d'immobilisation sur la puce ^12. Depuis certains génotypes peuvent être moins résistants au stress de la puce, vérifiez d'abord que les animaux de type sauvage (par exemple, Canton S) survivent à la technique d'immobilisation. a) La cause la plus fréquente de létalité est un mauvais positionnement de la larve (voir les figures 2G-H). Si des parties de la cuticule, la tête ou de la trachée ne sont pas entièrement à l'intérieur de la chambre, alors ils peuvent être endommagés lors de l'immobilisation, et unelarve qui est trop grand pour la puce (> 4 mm) est moins de chances de survivre. b) A cause moins fréquente de la létalité est l'utilisation d'une trop forte pression ou sous vide lors du chargement de la puce. Lorsqu'il est correctement positionné dans la puce, la pression générée par le vide est bien toléré. Cependant pression excessive, soit à partir du vide ou dans la phase initiale de mise en place de l'animal peut être un problème. Il est préférable d'apprendre le degré de pression nécessaire empiriquement par des essais de type sauvage larves de la bonne taille. c) Si trop d'huile sur les halocarbures couvre la trachée de l'animal l'animal peut potentiellement avoir des problèmes avec la survie à long terme. L'huile joue plusieurs rôles importants dans la puce: il est important pour la création du vide, au cours de l'optique d'imagerie, et elle s'oppose à la dessiccation dans la puce. Cependant huile excessive doit être évitée. (Ceci peut également conduire à l'huile dans le tube et d'une seringue, ce qui compromet le vide). Les couches de protocole proposées juste le côté ventral de la larve à l'huile, puis reDéplace le curseur excès d'huile par le placement de la larve sur une lamelle propre avant de le transférer à la lamelle finale pour l'imagerie. d) la phototoxicité peut être vécue de la session d'imagerie. Comme avec n'importe quelle application de l'imagerie en direct, il est idéal à utiliser de courtes durées d'exposition avec une faible lumière laser d'intensité, ce qui est le mieux réalisé en utilisant une caméra très sensible ou détecteur. Essayez de réduire l'éclairage à la lumière UV, y compris la lumière à large spectre créée par les sources de lumière de mercure.

D'autres questions et orientations futures:

Comme cette méthode n'utilise pas les anesthésiques, le cœur de l'animal continue à battre. Cela crée une certaine mobilité inévitable, ce qui affecte l'imagerie dans certains endroits plus que d'autres. Les exemples ici montrent que le cordon ventral de nerf, nerfs segmentaires, et la paroi du corps peuvent être facilement visualisés sans ingérence de la pulsation. Dans les cas où le rythme cardiaque affecte l'imagerie, les mouvements réguliers peuvent parfois être corrigées pour tenir avecdans le logiciel d'analyse (par exemple, le stabilisateur d'image plugin ImageJ). Cela fonctionne bien lorsque des objets individuels se déplacent sur une échelle de temps rapide (par exemple ~ 1 um / s pour le transport axonal rapide) ou sur une échelle de temps très lent (minutes à quelques heures). Toutefois, lorsque l'objet (s) d'intérêt se déplacent avec une gamme de vitesses et les directions, il peut être plus difficile à corriger le rythme cardiaque induite par les mouvements.

Un autre problème est légère variabilité dans l'optique de l'animal à animal, ou entre plusieurs sessions d'imagerie du même animal dans la puce. Le plus profond de l'objet d'intérêt est dans l'animal, plus cette variation sera. Nerfs segmentaires et la corde nerveuse ventrale sont normalement trop profondément dans l'animal, puis à être imprimé sur un microscope ordinaire. Cependant la pression légère connu dans la puce de larve pousse ces structures très proche de la cuticule et lamelle. La distance exacte de ces structures de la lamelle aura de petites variations de trIAL à un procès. La variation pour des objets près de la cuticule, tels que les corps cellulaires des neurones sensoriels, est inférieure. Il est donc important, en particulier pour effectuer des mesures d'intensité, d'utiliser un grand nombre d'animaux et des essais indépendants pour tenir compte de la variabilité dans l'optique.

Bien que les exemples présentés ici ont porté sur les processus dans les neurones, l'approche doit être possible d'imager toute structure dans l'animal qui peut être mis dans la profondeur de focalisation de l'objectif du microscope. Cela comprend la cuticule, les muscles de la paroi du corps, et leurs NMJs. Trachée sur la face ventrale de l'animal et éventuellement des parties du tube digestif peuvent également être imagés. L'animal peut également être positionné avec sa face dorsale vers la lamelle couvre-objet pour une imagerie à court terme de structures proches de la surface dorsale. La capacité de structures d'image de profondeur à l'intérieur de l'animal est limitée par la distance de travail de l'objectif de microscope utilisé. Des structures telles que imdisques aginal sont inaccessibles à fort grossissement (par exemple 40X) objectifs.

Les puces de larve décrites dans ce protocole sont conçus pour les larves au début 3 ^ème étape larvaire (allant de la taille de 3,5 à 4 mm). Cependant de nombreuses questions intéressantes nécessitent imagerie à différents stades larvaires. Des puces plus petites pour accueillir 2 larves de ^deuxième stade, ou plus grandes, pour accueillir fin ³ e stades peuvent être facilement conçus selon le même principe. (Figure supplémentaire 1 contient un fichier DXF facilement modifiables pour la fabrication de moules en silicone avec des tailles de chambre altérées). Le principe simple de la joint réversible pourrait même être appliquée à d'autres organismes tels que C. elegans ou le poisson-zèbre, avec la variante principale étant la taille de la chambre. Une orientation future utile est de concevoir une puce qui peut immobiliser de nombreux animaux à la fois, d'utiliser à des fins de dépistage. Toutefois, pour cela, la conception devrait être significativement différentde l'appareil actuel, où les questions de positionnement de l'animal dans la puce doit être traitée pour chaque animal de façon indépendante.

L'essai d'écrasement du nerf pour étudier les réponses des blessures dans les nerfs périphériques larvaires:

Le test par écrasement du nerf décrit ici pour les nerfs segmentaires larvaires est une méthode simple pour introduire une blessure à axones périphériques chez la drosophile. Avantages de cette méthode: a) il est simple à réaliser avec des outils standards trouvés dans un laboratoire de Drosophila (CO ₂ de source et pince stéréoscopique), b) il peut être effectué rapidement pour de nombreux animaux, ce qui rend l'analyse biochimique des cordons nerveux après une blessure réalisable ^14, c) les réponses cellulaires et moléculaires à cette blessure sont hautement reproductibles ^14,15,28 et peuvent être utilisés pour découvrir des procédés qui sont également importantes dans les neurones de vertébrés ^29,30.

D'autres méthodes de blesser neurones est de focusa laser de forte puissance, par exemple un pulsé UV ou laser femtoseconde, de rompre un axone par microchirurgie au laser ^17,31-33. La puce de larve est une méthode idéale pour positionner l'animal à cette microchirurgie. Toutefois, en raison des différences mineures dans l'optique entre les essais, décrits ci-dessus, la méthode basée sur le laser peut être plus difficile à reproduire dans les larves, en particulier dans les nerfs segmentaires larvaires. En outre, le laser à base de lésion axonale nécessite plus de temps pour positionner chaque animal, est par conséquent plus difficile à mener sur une grande échelle (avec un grand nombre d'animaux).

Dépannage:

Le problème technique le plus couramment rencontré de la écrasement du nerf est mort de dommages aux organes internes. Lorsque la conduite de l'écrasement, il est important de ne pas pincer le cordon ventral nerveux, les glandes salivaires, ou les intestins. Il est également important de ne pas percer la cuticule. Ces questions sont à éviter en mettant la pince à un angle de 45 ° par rapport à la surfac cuticulee (voir la figure 3).

La qualité de la pince a un grand impact sur l'efficacité de l'écrasement et la survie après. Nous vous recommandons nombre Dumostar 5 forceps. Pour conserver leur netteté, les pinces doivent être manipulés avec soin, pas utilisées à d'autres fins, et remplacés une fois qu'ils deviennent émoussée ou tordue.

La taille de l'animal peut également influer sur l'efficacité de l'écrasement. Les petits animaux (moins de 3 mm de longueur) sont beaucoup moins susceptibles de survivre à la blessure. Avec de grands animaux, (errant ³ e stades), il est plus difficile de repérer les nerfs et éviter d'endommager les grandes glandes salivaires et les intestins, et il ya moins de temps pour étudier les réponses des blessures avant la nymphose. L'écrasement du nerf est le plus efficacement réalisée au début ^du stade larvaire 3 ^rd (qui sont ~ 3 à 4,5 mm de longueur le long de l'axe antéro-postérieur).

La source de nourriture que l'animal est relevée sur pourrait influer sur l'force de la cuticule et la survie après la cohue. Il est recommandé d'élever des animaux dans les aliments fabriqués à partir d'une recette standard levure-glucose.

La meilleure méthode pour apprendre à faire la cohue est effectivement de pratiquer de nombreux animaux, d'abord avec l'objectif principal de la réalisation de survie (et pas la nymphose) 24 heures après l'écrasement. Les débutants ont normalement un faible taux de survie (par exemple 10%), mais une fois la technique apprise, les taux de survie peut atteindre ~ 90%.

D'autres questions et orientations futures:

L'essai d'écrasement fournit une méthode puissante pour étudier la germination de l'axone proximal au site de la lésion et la dégénérescence des axones et des synapses distales au site de la lésion. Bien que les taux de dégénérescence varie entre les différents types de neurones différents, ils sont hautement reproductibles pour un type de neurone donné, en fournissant témoigne de la reproductibilité de l'analyse de dommage.

En revanche, la "régénération" bourgeonnementréponse observée dans les axones proximaux est plus difficile à étudier. Tous les axones dans le nerf segmentaire lancer une vaste germination à proximité du site de lésion (par exemple, voir la figure 6 et figure 3). Toutefois, la mesure de la germination peut varier entre les neurones, et est difficile à quantifier. Un degré similaire et de la variabilité dans la germination peuvent être observées après des lésions focales plus de motoneurones simples dans les nerfs segmentaires introduites en utilisant un UV laser à colorant pulsé. Nous interprétons que la directionnalité nondiscriminate de la germination est due à l'absence de signaux de guidage dans les nerfs segmentaires. En revanche, les axones des neurones sensoriels blessés par laser à proximité de leurs corps cellulaires sont soumis à une nouvelle croissance axonale dans la même direction que l'axone perdu ^34. Axones dans cette région de l'animal sont probablement exposés à des informations de position plus précise l'orientation des axones. L'environnement dans les nerfs segmentaires est peu probable d'avoir beaucoup resemblanCE pour l'environnement que les axones origine navigué au cours de leur orientation dans l'embryon, donc on ne s'attend pas à avoir des informations pour guider axones.

Une autre limite de l'étude de la régénération en utilisant l'analyse par écrasement du nerf segmentaire est que les axones sensoriels et motoneurones blessés ont encore une grande distance à couvrir (0,25-1 mm) pour atteindre leur cible, et un laps de temps limité (<3 jours) avant les subit animales nymphose. Une étude récente a identifié une manipulation génétique du récepteur de l'hormone prothoraciotropic qui triple la durée de la 3 ^e stade larvaire ^35. Cette manipulation permettra de prolonger la période de temps pour étudier la récupération et la dégénérescence des neurones après un traumatisme important, à 9 au lieu de 3 jours. Cela peut être assez longue pour observer de nouveaux événements, tels que la reconnexion d'un axone blessé avec sa cible post-synaptique, en particulier si la lésion est induite près de la fin synaptique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube en polyéthylène de 0,5 mm	Fisher Scientific	14-170-11B	Tube en polyéthylène, D.E. = 0,023 po de diamètre extérieur = 0,038 po
Tube en polyuréthane de 1 mm	Fisher Scientific	BB521-63	Tube en polyuréthane, D.E. = 0,063 po de diamètre extérieur = 0,125 po
Connecteur de barbelé à cannelé	Bio Rad	732-8300	Connecteur de 0,8 mm de barbelé à cannelé
Robinet d’arrêt à 3 voies	Bio Rad	732-8104	Valve à visser pour seringue
Seringue (20 ml)	Fisher Scientific	14-817-33	Seringue à visser de 20 ml pour le vide générateur
Aiguilles de distribution, 23 G (0,4 mm de diamètre intérieur, 0,6 mm de diamètre extérieur)	McMaster-Carr	75165A684	Aiguille pour raccord de sortie
Aiguilles de distribution, 21 G, (0,6 mm de diamètre intérieur, 0,8 mm de diamètre extérieur)	McMaster-Carr	75165A679	Aiguille pour raccordement de sortie
Huile d’halocarbure	Sigma	H8898	Huile d’halocarbure 700
Dumostar Numéro 5 Pince	Roboz	RS-498	Pour l’écrasement des nerfs
Kit PDMS (Base et agent de durcissement)	Ellsworth	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit
Lamelles en verre	Fisher Scientific	12-544-C	24 mm x 40 mm (épaisseur selon la recommandation pour votre objectif de microscope)
Gobelet en plastique jetable (9 oz)
			d’agitateur à café en plastique
Lame de
Plaques			d’agar au jus de raisinVoir http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 pour la recette