Article de méthode

Conception et analyse du comportement de préférence de température et de son rythme circadien chez la drosophile

DOI :

10.3791/51097

⸱

13 janvier 2014

 ,  , 
1The Visual Systems Group, Division of Pediatric Ophthalmology, Cincinnati Childrens Hospital Medical Center, 2PRESTO, JST

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons récemment identifié une nouvelle drosophile circadienne, le rythme de préférence de température (TPR), dans lequel la température préférée chez les mouches augmente pendant la journée et tombe pendant la nuit. TPR est régulé indépendamment d’une autre sortie circadienne, l’activité locomoteur. Nous décrivons ici la conception et l’analyse de TPR chez la drosophile.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’horloge circadienne régule de nombreux aspects de la vie, y compris le sommeil, l’activité locomoteur et les rythmes de température corporelle (BTR)1,2. Nous avons récemment identifié une nouvelle sortie circadienne de drosophile, appelée le rythme de préférence de température (TPR), dans lequel la température préférée chez les mouches augmente pendant la journée et tombe pendant la nuit 3. Étonnamment, la TPR et l’activité locomotrice sont contrôlées par des neurones circadiens distincts3. L’activité locomotrice de la drosophile est une production comportementale circadienne bien connue et a fourni de fortes contributions à la découverte de nombreux gènes et mécanismes de l’horloge circadienne des mammifères conservés4. Par conséquent, la compréhension de TPR mènera à l’identification des mécanismes circadiens moléculaires et cellulaires jusqu’ici inconnus. Ici, nous décrivons comment effectuer et analyser le test TPR. Cette technique permet non seulement de disséquer les mécanismes moléculaires et neuronaux de la TPR, mais fournit également de nouvelles informations sur les mécanismes fondamentaux des fonctions cérébrales qui intègrent différents signaux environnementaux et régulent les comportements des animaux. En outre, nos données récemment publiées suggèrent que la mouche TPR partage des caractéristiques avec le mammifère BTR3. Les drosophiles sont des ectothermes, dans lesquels la température corporelle est généralement régulée par le comportement. Par conséquent, TPR est une stratégie utilisée pour générer une température corporelle rythmique chez ces mouches5-8. Nous croyons qu’une exploration plus approfondie de la Drosophile TPR facilitera la caractérisation des mécanismes sous-jacents au contrôle de la température corporelle chez les animaux.

Introduction

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La température est un indice environnemental omniprésent. Les animaux présentent une variété de comportements afin d’éviter les températures nocives et d’en rechercher des confortables. La drosophile présente un comportement de préférence de température robuste6,7. Lorsque les mouches sont libérées dans un gradient de température de 18-32 °C, les mouches évitent les températures chaudes et froides et choisissent finalement une température préférée de 25 °C le matin3. Les capteurs de température chaude sont un ensemble de neurones thermosensoriaux, neurones AC, qui expriment le canal de potentiel de récepteur transitoire de la drosophile (TPR), TRPA16,9. Les capteurs de température froide sont situés dans les 3èmes segments antennaux, car l’ablation des 3èmes segments antennaux provoque l’absence d’évitement de température froide6. Récemment, la protéine TRPP Brivido (Brv) a été identifiée10. Puisque Brv est exprimé dans les 3èmes segments antennaux et négocie la détection du froid, Brv est une molécule de détection à froid possible, qui est critique pour le comportement de préférence de température. En somme, les mouches utilisent ces deux capteurs de température pour éviter les températures chaudes et froides et trouver une température préférée.

Alors que les mammifères génèrent de la chaleur pour réguler leur température corporelle, les ectothermes adaptent généralement leur température corporelle à la température ambiante11. Certains ectothermes sont connus pour présenter un comportement quotidien de TPR qui est considéré comme une stratégie pour les ectothermes pour réguler leur BTR12. Pour déterminer si les mouches ont exhibé TPR, nous avons répété l’analyse comportementale de préférence de température à divers points pendant une durée de 24 heures. Nous avons constaté que la drosophile présente un TPR quotidien, qui est faible le matin et élevé le soir et suit un modèle similaire à celui du BTR chez l’homme13.

Chez la drosophile, il y a ~ 150 neurones d’horloge dans le cerveau. Les neurones de l’horloge qui régulent l’activité locomotrice sont appelés oscillateurs M et E. Cependant, fait intéressant, les oscillateurs M et E ne régulent pas TPR, au lieu de cela, nous avons montré que les neurones d’horloge DN2 dans le cerveau régulent TPR mais pas l’activité locomoteur. Ces données indiquent que TPR est réglé indépendamment de l’activité locomotrice. Notamment, le BTR des mammifères est également régulé indépendamment de l’activité locomoteur. Les études d’ablation chez le rat montrent que le BTR est contrôlé par des neurones SCN spécifiques qui ciblent un sous-ensemble différent de neurones de la zone subparventriculaire que ceux qui contrôlent l’activité locomotrice14. Par conséquent, nos données considèrent la possibilité que le BTR des mammifères et le TPR de la mouche soient conservés de manière évolutionnelle3, car le TTR de la mouche et le BTR des mammifères présentent des rythmes de température dépendant de l’horloge circadienne, qui sont régulés indépendamment de l’activité locomoteur.

Ici, nous décrivons les détails de la façon d’analyser le test comportemental TPR chez la drosophile. Cette méthode permet d’enquêter non seulement sur le mécanisme moléculaire et les circuits neuronaux de TPR, mais aussi sur la façon dont le cerveau intègre différents indices environnementaux et horloges biologiques internes.

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Protocole

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1. Préparation des mouches

  1. Expériences light dark (LD)
    1. Élever les mouches dans des incubateurs (25 °C/40-60 % d’humidité relative (HR)) sous des cycles légers de 12 h/foncé de 12 h (LD). L’intensité lumineuse des incubateurs est d’environ 500 à 1 000 lux.
    2. Deux incubateurs sont nécessaires pour compléter les tests de comportement sur une période de 24 heures. Les deux incubateurs doivent avoir une lumière programmable avec des fonctions ON OFF. Ils devraient également avoir des portes solides qui ne sont pas perméables à la lumière(c’est-à-dire pas de verre ou de plexiglas).
      Remarque : Un incubateur doit être désigné comme un incubateur « de jour » et réglé sur un cycle LD de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité. Le deuxième incubateur doit être désigné comme un incubateur « de nuit » et réglé à l’inverse du premier avec 12 heures d’obscurité suivie de 12 heures de lumière. L’incubateur de nuit doit être placé dans la pièce accessible dans l’obscurité, de manière à ce que les mouches connaissant des conditions nocturnes soient facilement accessibles pour les expériences.
    3. Placez les flacons de mouche dans des incubateurs de jour ou de nuit. Recueillir les mouches nouvellement écloses dans un flacon frais, 20-30 par analyse et conserver dans le même incubateur pendant 2-3 jours.
    4. Après 2-3 jours, utilisez des mouches pour le test comportemental de préférence de température.
      1. Pour les expériences de jour (Zeitgeber time (ZT) 0-12), collectez les mouches de l’incubateur de jour.
      2. Juste avant les expériences comportementales, sortez les flacons de mouche collectés de l’incubateur de jour.
      3. Pour les expériences de nuit (ZT 13-24), collectez les mouches de l’incubateur de nuit.
      4. Juste avant les expériences comportementales, sortez les flacons de mouche collectés de l’incubateur de nuit, enveloppez-les de papier d’aluminium et placez-les dans une boîte dans la pièce sombre sous une lampe rouge.
        Remarque: Étant donné que le test comportemental de préférence de température est effectué dans l’obscurité pour les expériences de nuit, l’exposition à la lumière aux mouches doit être évitée jusqu’à la fin des expériences comportementales.
        Remarque : Les mouches ne doivent pas être exposées au dioxyde de carbone le jour où les expériences doivent avoir lieu.
  2. Expériences d’obscurité constante (DD)
    1. Jour JD
      1. Un incubateur supplémentaire est nécessaire pour les expériences de jour DD, que nous appelons un incubateur de « transition » pour le reste du manuscrit. L’incubateur de transition doit être placé dans la pièce accessible dans l’obscurité, de manière à ce que les mouches connaissant des conditions de DD soient facilement accessibles pour les expériences. Un exemple d’horaire d’éclairage pour un incubateur de transition aurait la lumière allumée de 13 h à 19 h et la lumière éteinte de 19 h à 13 h(Figure 1).
      2. Recueillir les mouches qui ont été soulevées dans l’incubateur de jour. Placez les flacons volants dans l’incubateur de transition entre 13 h et 19 h, lorsque la lumière est allumée. De cette façon, les mouches sont correctement exposées à la lumière jusqu’à 19 heures, heure à laquelle la lumière s’éteint.
      3. Le lendemain, avant 13 heures, dans des conditions sombres, sortez les flacons volants de l’incubateur de transition, enveloppez-les de papier d’aluminium et placez-les dans une boîte. Gardez la boîte dans n’importe quel incubateur pendant un jour de plus.
    2. Nuit DD
      1. Recueillir les mouches qui ont été soulevées dans l’incubateur de nuit dans l’obscurité sous une lampe rouge. Ou collectez en outre les mouches lorsque la lumière de l’incubateur de nuit est allumée.
      2. Enveloppez les flacons collectés avec du papier d’aluminium dans l’obscurité chaque fois que les lumières sont éteintes et placez les flacons dans une boîte. Conservez la boîte dans n’importe quel incubateur pendant deux jours supplémentaires(Figure 1B).
        Remarque: Étant donné que le test comportemental de préférence de température est effectué dans l’obscurité pour les expériences de nuit, l’exposition à la lumière aux mouches doit être évitée jusqu’à la fin des expériences comportementales.
  3. Expériences à lumière constante (LL)
    1. Journée LL
      1. Un incubateur supplémentaire est nécessaire pour les expériences de jour LL. Cet incubateur maintient l’état LL (25 °C, 800 lux), avec la lumière allumée en continu.
      2. Recueillir les mouches qui ont été soulevées dans l’incubateur de jour. Placez les flacons de mouche dans l’incubateur LL à tout moment au cours de leur « journée ».
    2. LL Nuit
      1. Recueillir les mouches qui ont été soulevées dans l’incubateur de nuit. Transférez les flacons volants de l’incubateur de nuit à l’incubateur LL pendant le temps où la lumière dans l’incubateur de nuit est allumée.
        Remarque: Par exemple, la lumière s’éteint à 7 heures du matin dans l’incubateur de nuit. Transférez les flacons volants de l’incubateur de nuit à l’incubateur LL avant 7 heures du matin et conservez les flacons dans l’incubateur LL pendant 4 jours supplémentaires.
        Remarque: Au jour 4 dans des conditions LL, l’oscillation de l’activité locomoteur est supprimée15,16, tandis que le TPR est encore soutenu 3.

2. L’appareil pour le test comportemental de préférence de température

  1. Placez un couvercle en plexiglas (29 cm x 19,2 cm)(figure 4)sur une plaque d’aluminium.
  2. Surveillez la température de l’air entre la plaque et le couvercle. Six sondes de température sont fixées à différentes positions à l’intérieur du couvercle à l’intérieur de l’une des voies(Figure 2).
    Remarque : Assurez-vous que les sondes ne touchent ni la plaque d’aluminium ni le couvercle en plexiglas. La température de l’air doit être réglée sur un gradient de 18 à 32 °C.
  3. Placer l’appareil dans une pièce environnementale maintenue à une température de 25 °C/65 à 75 % HR. Cette pièce doit être scellée de toute lumière extérieure. Une pièce environnementale est normalement équipée de ventilateurs pour maintenir une certaine température et humidité.
    Remarque : L’air du ventilateur perturbe probablement un gradient de température stable sur l’appareil. Pour éviter cela, nous utilisons une feuille transparente qui couvre la zone entourant l’appareil.
  4. Préparez un thermomètre et un hygromètre pour vérifier la température et l’humidité dans la pièce environnementale.
    Remarque: La lumière influence la préférence de température de la drosophile3. La même intensité lumineuse doit être fournie uniformément sur l’appareil. L’intensité de nos lumières de salle environnementale est d’environ 800 lux.
    Remarque: Lorsque les expériences comportementales sont terminées, placez un tube connecté à partir du réservoir de CO2 ou alimentez-le près du trou du haut de l’appareil afin d’anesthésier et de se débarrasser des mouches.

3. Préparation de l’appareil en vue de son utilisation

  1. Allumer l’appareil pendant au moins 30 min afin d’établir correctement le gradient de température à la surface de la plaque(figure 3).
  2. Enduit le couvercle de l’appareil de comportement d’un hydrofuge pour empêcher les mouches d’escalader les murs ou le plafond du couvercle. Essuyez l’excès d’hydrofuge et laissez le couvercle pendant 25-30 min pour sécher.
  3. Retirez toute condensation sur la plaque d’aluminium. Placez le couvercle en plexiglas sur la plaque d’aluminium et fixez-le à l’avec six pinces en C (Figure 2).
    Remarque: Il est très important que le couvercle soit bien scellé, si nécessaire, du ruban adhésif double stick peut être utilisé.
  4. Laissez le couvercle pendant au moins 15 min. Le gradient de température de l’air entre la plaque d’aluminium et le couvercle est créé à partir de 18-32 °C.

4. Test de comportement de préférence de température

  1. Chargez les mouches dans l’espace entre la plaque d’aluminium et le couvercle en plexiglas de l’appareil à travers de petits trous au centre de chaque voie du couvercle(figures 2 et 4). Couvrez les trous avec des glissements de couverture pour empêcher les mouches de s’échapper.
  2. Pour les conditions sombres, éteignez toutes les lumières de la pièce environnementale. Une lampe rouge peut être utilisée lorsque les mouches sont placées dans l’appareil. Assurez-vous que les mouches ne sont pas exposées à des lumières à l’exception d’une lampe rouge jusqu’à ce que les expériences comportementales soient terminées.
  3. Pour chaque essai, utilisez 20 à 25 mouches adultes, qui ne doivent pas être réutilisées dans les essais ultérieurs. Le test comportemental est effectué pendant 30 min. Prenez quelques photos avec ou sans flash. Veillez à ne pas faire beaucoup de bruit ou de mouvements brusques pendant les expériences.
  4. Enregistrer la température des six sondes de l’appareil. Prenez note de la température ambiante ainsi que de l’humidité.
  5. Anesthésiez les mouches de l’appareil avec du dioxyde de carbone gazeux, desserrez les pinces, retirez le couvercle en plexiglas et retirez les mouches de la plaque. Après chaque expérience, les mouches sont jetées. Essuyez toute condensation ou humidité de la plaque. Remplacez le couvercle sur la plaque et serrez-le avec les pinces en vue de la prochaine expérience.
  6. Afin d’avoir une représentation de la préférence de température tout au long de la journée, la période de 24 heures est divisée en huit fuseaux horaires, quatre pendant la journée et quatre la nuit. Par exemple, nous utilisons ces ZT ou CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 et 22-24.
    Remarque: Puisque les variations de phénotype causées par des effets de masquage sont attendues juste après que la lumière est allumée (ZT0) ou ÉTEINTe (ZT12), nous n’examinons pas le comportement de préférence de température pendant ces périodes (ZT ou CT 0-1, 11.5-13 et 23.5-24). Au moins cinq essais doivent être effectués dans chaque fuseau horaire pour que les résultats soient statistiquement solides.

5. Analyse des données

  1. Calculez le gradient de température comme suit : Déterminez où les sondes de température sont placées en fonction des deux règles placées sur les côtés supérieur et inférieur du couvercle en plexiglas le long des bords(Figure 2A).
  2. Le gradient de température entre les sondes de température est estimé linéaire. En fonction de l’emplacement des sondes de température, ainsi que de leurs températures enregistrées correspondantes, tracez des lignes représentant chaque degré de température dans la position appropriée sur les images. Comptez le nombre de mouches situées dans chaque intervalle de degrés. Exclure les mouches sur les murs ou le plafond de la couverture.
  3. Calculez le pourcentage de mouches dans chaque plage de température de chaque voie. Une température moyenne préférée est calculée en additionnant les produits du pourcentage de mouches et de la température de chaque intervalle, comme indiqué ci-dessous:
    % de mouches x 18,5 °C + % de mouches x 19,5 °C + % de mouches x 20,5 °C ....+ % de mouches x 31,5 °C + % de mouches x 32,5 °C.
  4. Calculer la température moyenne préférée dans chaque fuseau horaire : le comportement de préférence de température est effectué >5 fois au cours de chaque fuseau horaire (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 et 22-24). Pour calculer la température moyenne préférée dans chaque fuseau horaire, la température moyenne préférée de chaque essai est calculée ensemble. Les barres d’erreur s.e.m. sont égales à l’erreur entre les essais.

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Résultats

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Un exemple du rythme de préférence de température est illustré à la figure 5. Si la procédure de comportement est effectuée avec succès, les mouches doivent présenter un TPR dans lequel elles préfèrent une température basse le matin et une température plus élevée le soir. L’augmentation de ~1-1,5 °C pendant la journée dans la préférence de température doit être observée au cours de la journée, quel que soit le fond génétique, puisque nous avons montré que w1118, yw et can...

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Discussion

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Ici, nous illustrant les détails de l’appareil comportemental de préférence de température et l’analyse du comportement TPR. La drosophile montre les dispositifs saillants, robustes, et reproductibles de TPR horloge-commandé. Cependant, nos données suggèrent qu’au moins deux facteurs, lumière ambiante et âge, perturbent de manière significative les phénotypes comportementaux de TPR.

Nous observons que la lumière affecte de manière significative la préférence de température chez la...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il n’y a rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous sommes reconnaissants aux Drs Aravinthan Samuel et Marc Gershow qui ont aidé à développer la version initiale de l’appareil comportemental et Matthew Batie qui a modifié l’appareil comportemental. Cette recherche a été soutenue par la subvention fiduciaire de l’Hôpital pour enfants de Cincinnati, JST/PRESTO, March of Dimes et NIH R01 GM107582 à F.N.H.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bright Lab Jr. SafelightAmazon#B00013J8UYLumière rouge pour les pièces sombres
Rain XSOPUSHydrofuge : Appliquez le couvercle en plexiglas
C-ClampHome Depot
Température/hygromètreFisher15-077-963
Appareils PeltierTE Technology, Inc.HP-127-1.4-1.15-71P
ThermomètreFlukeFluke 52II
Contrôleur de paillasseOven Industries5R6-570-15R et 5R6-570-24R
Sonde de capteur de températureOven IndustriesTR67-32
Générique 480 Watt ATXalimentation système de refroidissement par ordinateur
MCR220-QP-RES Dual 120 mm Radiateur avec réservoir  ;Système de refroidissement d’ordinateurSwiftech
Pompe 12V DC en ligne MCP350Système de refroidissement d’ordinateurSwiftech
Refroidisseur de carte graphique MCW50de refroidissement d’ordinateurSwiftech
Ventilateur SY1225SL12SH Scythe Kaze-Jyunide refroidissement d’ordinateurPC Crazy
Produits Système Système

Références

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Réimpressions et autorisations

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Mots-clés

Rythme de pr f rence thermiqueHorloge circadienne de DrosophilaEssai de gradient de temp ratureConfiguration du dispositif PeltierAnalyse comportementale des mouchesCartographie des neurones circadiensMesure de la pr f rence thermiqueProtocole de contr le environnementalM thode de collecte de donn estude des circuits neuronaux

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