Nous avons établi un modèle de glioblastome orthotopique corticale chez la souris pour intravitale microscopie à deux photons qui récapitule les contraintes biophysiques normalement en jeu au cours de la croissance de la tumeur. Une fenêtre en verre chronique remplaçant le crâne au-dessus de la tumeur permet le suivi de la progression de la tumeur au cours du temps par microscopie à deux photons.
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Article de méthode
Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le glioblastome multiforme (GBM) est la forme la plus agressive des tumeurs cérébrales avec aucun des traitements curatifs disponibles à ce jour.
Les modèles murins de cette pathologie reposent sur l'injection d'une suspension de cellules de gliome dans le parenchyme du cerveau suite à une incision de la dure-mère. Alors que les cellules doivent être injectés superficiellement pour être accessible à intravitale microscopie à deux photons, injections superficielles ne parviennent pas à récapituler les conditions physiopathologiques. En effet, s'échappant par le tube d'injection plupart des cellules tumorales parviennent de l'espace extra-dural où ils se détendent anormalement rapide en l'absence de contraintes mécaniques du parenchyme.
Nos améliorations consistent non seulement dans l'implantation focalement un sphéroïde de gliome, plutôt que l'injection d'une suspension de cellules de gliome dans les couches superficielles du cortex cérébral, mais aussi dans le colmatage du site d'injection par un dextrane gel hémi-bourrelet réticulé qui est collée à la surrounding parenchyme et scellé dure-mère avec cyanoacrylate. Au total, ces mesures imposent l'expansion physiologique et l'infiltration des cellules tumorales à l'intérieur du parenchyme cérébral. Craniotomie a été finalement fermé par une fenêtre en verre collée sur le crâne pour permettre l'imagerie chronique pendant des semaines en l'absence de développement de tissu cicatriciel.
Profitant d'animaux transgéniques fluorescentes greffées avec des cellules tumorales fluorescentes, nous avons montré que la dynamique des interactions qui se produisent entre les cellules de gliome, les neurones (par exemple souris Thy1-PCP) et vasculaire (mis en évidence par une injection intraveineuse d'un colorant fluorescent) peuvent être visualisés par intravitale microscopie à deux photons au cours de la progression de la maladie.
La possibilité à l'image d'une tumeur à la résolution microscopique dans un environnement cérébrale peu compromis représente une amélioration de modèles animaux GBM actuelles qui devraient bénéficier le domaine de la neuro-oncologie et de dépistage des drogues.
Introduction
Le glioblastome multiforme apparaît comme la forme la plus agressive de tumeur cérébrale chez les adultes avec une survie médiane de 12 mois et un taux de survie à 5 ans de 5%. Gestion clinique repose sur la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie souvent utilisé en combinaison. Cependant, les effets de ces traitements restent palliatifs 1-3.
Jusqu'à présent, la plupart des études de neuro-oncologie reposent sur des techniques qui ne sont en mesure de fournir une vision statique et exécutées sur de grandes cohortes de tumeurs des animaux portant sacrifiés à différents points dans le temps (voir par exemple 4,5). Le développement récent de méthodes de suivi basé sur l'imagerie intravitale permet d'étudier la croissance des gliomes et les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement physiopathologique sur le même animal au fil du temps. Cela ouvre la voie à pièce exclusive de l'information qui était jusqu'ici irréalisable 6. Les animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents dans les cellules d'intérêt peuvent être utiliséd pour étudier les interactions spécifiques entre les cellules tumorales et par exemple les neurones dans le présent document.
Au cours de la dernière décennie, intravitale microscopie à deux photons 7 est devenu un standard de l'or dans les études de neuro-oncologie fondamentales et des essais précliniques 8,9 pour sa capacité à effectuer observation intravitale profonde de cerveau de souris (> 500 um en dessous de la dure-mère) avec une résolution spatiale micrométrique 10. Utilisation intravitale microscopie à deux photons avec des modèles animaux orthotopique implantés avec une fenêtre crânienne 11 chronique, il est possible de suivre la progression de la tumeur au cours du temps sur le même 9,12 de la souris.
L'un des inconvénients majeurs de ces modèles animaux précédemment publiés est cependant qu'ils n'imitent pas les contraintes physiques qui régissent l'évolution de la tumeur comme la dure-mère n'est pas scellé après l'injection de la suspension de cellules 9,13,14. cellules de gliome peuvent fuir dans leespace extradural transformer un modèle de gliome orthotopique en un hétérotopique.
Le modèle animal présenté ici consiste dans l'injection d'un sphéroïde de cellules de gliome fluorescents dans le cortex cérébral, à une profondeur de 200 pm, suivie par la fermeture de la dure-mère avec un dextrane gel hémi-bourrelet réticulé et de la colle d'histo-compatible . La croissance de la tumeur est alors limité au parenchyme cérébral qui maintient contraintes physiques physiopathologiques. Une fenêtre de verre chronique implanté au-dessus de la tumeur permet un accès facile pour optique intravitale microscopie à deux photons. L'utilisation d'animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents dans les cellules d'intérêt, il est possible d'effectuer un suivi de la croissance des gliomes au fil du temps et à étudier son interaction avec son micro-environnement (ici avec les neurones et le système vasculaire en surbrillance avec des dextranes fluorescents).
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées en conformité avec la législation française et en conformité avec la directive du Conseil communautaire européen du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE) pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. La recherche sur les animaux a été autorisé par la Direction Départementale des Services Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licence D-13-055-21) et approuvé par le comité d'éthique de la Provence Côte d'Azur n ° 14 (Projet 87-04122012) .
1. Sphéroïdes Préparation
- Préparation des boîtes de Petri enrobées d'agarose
- Mélanger 1 g d'agarose dans 100 ml de milieu de culture de cellules non supplémenté avec du sérum bovin fœtal. Utilisation d'un four à micro-ondes (850 watts pendant 40 secondes, puis 3 x 15 sec; agiter la solution entre chaque séance de micro-ondes) à faire bouillir la solution et pour dissoudre complètement l'agarose. Autoclave cette solution d'agarose à 1% pendant 20 min à 120 ° C pour assurer la stéri. lité Note: Prenez soin de dissoudre complètement le agarose avant le protocole de l'autoclave. Inhomogénéité peut compromettre la formation de sphéroïdes.
- Une fois récupéré à partir de l'autoclave, verser 10 ml de la solution d'agarose à 1% dans 100 x 20 mm boîtes de Pétri. Laisser le boîtes de Pétri de 20 min à température ambiante pour permettre à la solution d'agarose à 1% à solidifier.
- Ajouter 10 ml de PBS-dessus de l'agarose pour maintenir l'humidité. Sceller le couvercle des boîtes de Pétri agarose revêtues en les enveloppant avec du parafilm pour éviter l'évaporation. Boîtes de Pétri peuvent être stockés jusqu'à 2 mois à 4 ° C si bien humidifié par la couche PBS.
- Culture sphéroïde
- Dans un flacon de 75 cm2, la culture des cellules de gliome dans leur milieu recommandé que d'une monocouche.
- Remplacer le PBS à partir de l'une d'agarose revêtues boîte de Petri de 1% par 1,5 ml de "milieu préconditionné" prélevés dans la fiole contenant la monocouche 2D de cellules de gliomes.
- Retirer le milieu de la fiole contenant la monocouche 2D de cellules de gliome.
- Rincer délicatement la monocouche avec 10 ml de PBS.
- Ajouter 2 ml de 0,05% d'une solution de trypsine / EDTA et incuber le ballon à 4 min à 37 ° C. Remarque: Le temps d'incubation peut varier en fonction de la lignée cellulaire utilisée.
- Ajouter 8 ml de milieu de culture pour arrêter l'action de la trypsine, rincer doucement la suspension de cellules. Remarque: Prenez soin de ne pas expulser l'air dans la suspension cellulaire car elle augmente la mort cellulaire.
- Mettre 6 ml de la suspension cellulaire dans un flacon stérile.
- Centrifuger le flacon 4 min à 800 rpm.
- Eliminer le surnageant et suspendre doucement le sédiment cellulaire dans 3 ml de milieu de culture.
- Ensemencer la suspension de cellules dans le plat préparé d'agarose revêtues de Pétri.
- Mettre la boîte de Pétri à 37 ° C dans une atmosphère de CO2 à 5% pendant 2 à 3 jours jusqu'à ce que des sphéroïdes de diamètre désiré sont formés.
2. Sphéroïde et fenêtre Implantation
- Préparation du système d'injection
- Capillaires en verre propre (1 mm de diamètre) par sonication dans 70% d'éthanol pendant 10 min. Rincer deux fois à l'eau avant mise intérieur d'un incubateur à sec.
- Tirez plusieurs capillaires de verre nettoyés avec un extracteur de pipette afin de préparer un petit stock.
- Casser le bout du capillaire tiré par grattage de l'extrémité sur un morceau de papier de soie pour obtenir une extrémité biseautée de la taille souhaitée: typiquement un diamètre externe de 300 à 350 um et un diamètre interne de 250 à 300 um. Au cours de ce processus de mise en forme, de contrôler le diamètre du capillaire à l'aide d'un macroscope dont l'oculaire est équipé d'un mira graduée.
- Connecter l'extrémité non biseautée du tube capillaire à un collecteur 3 de manière à l'aide d'un morceau de tuyau en matière plastique dont le diamètre intérieur s'adapte au diamètre extérieur du capillaire.
- L'utilisation de plastique tubing, connectez les deux autres façons de le collecteur à un 25 ul de seringue microlitre et à une seringue de 1 ml chargé avec de l'huile minérale histo-compatible.
- Réglez le sélecteur collecteur d'établir une voie entre la seringue microlitre et la seringue de 1 ml. Supprimer le piston de la seringue microlitre et injecter de l'huile minérale vers l'arrière dans la seringue microlitre jusqu'à ce qu'il s'échappe en poussant le piston de la seringue de 1 ml. Remplacer le piston de la seringue microlitre tout en prenant soin de ne pas laisser de bulles d'air dans le tube.
- Ajuster le sélecteur collecteur d'établir une voie entre le capillaire et la seringue de 1 ml. Remplir le capillaire à l'huile minérale jusqu'à ce qu'il s'échappe de la pointe tout en prenant soin de ne pas laisser de bulles d'air dans le tube.
- Ajuster le sélecteur de collecteur pour établir une connexion entre la seringue microlitre et le capillaire. Expulser environ 10 ul d'huile minérale.
- Trempez l'extrémité du capillaire dans la solution PBSet l'utilisation de la jauge de la seringue microlitre, sucer dans 5 ul de PBS dans le capillaire. A noter que le ménisque entre l'huile et du PBS est clairement visible.
- Fixer le capillaire sur un raccord sous le macroscope de la chirurgie micromanipulateur 3 axes. Ce système sera utilisé pour cibler la capillarité vers le site de l'injection sous contrôle visuel.
- Implantation sphéroïde
- Légèrement endormir la souris par inhalation d'isoflurane dans une chambre d'induction (1,5% dans l'air pendant 1 à 1,5 min).
- Anesthésier les animaux par une injection intra-péritonéale d'un mélange de kétamine / xylazine (120 mg / kg, 12 mg / kg). A noter que l'anesthésie réduit souvent la température du corps de l'animal. Il est recommandé de procéder à une chirurgie dans une pièce à 26 ° C et à garder au chaud des animaux avec un coussin chauffant thermo-régulé sous-jacent.
- Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement des yeux.
- Raser le cuir chevelu de l'animal.
- Lieul'animal dans un cadre stéréotaxique utilisant des barres d'oreilles et un embout buccal.
- Nettoyer la peau avec de la povidone iode (3% de savon, puis 10% solution).
- Faire une incision de 1 cm de long dans la direction longitudinale médiane du cuir chevelu avec un scalpel. Avec des ciseaux couper et enlever la peau au-dessus des os pariétaux.
- Avec une lame de scalpel retirez délicatement le périoste au-dessus du crâne. Appliquez généreusement cyanoacrylate sur le dessus de l'os de générer une surface rugueuse pour l'adhésion de ciment plus tard.
- Percer l'os pariétal sous un macroscope chirurgicale pour générer une craniotomie de 4 mm de diamètre. Généreusement ajouter du PBS glacé contenant pénicilline (1000 U / ml) et Streptomicin (1 mg / ml) au cours de toute la procédure d'empêcher le chauffage. Retirez les petits fragments d'os avec une pince et une gaze stérile humide. Prenez soin de percer au moins 1 mm à une distance de sutures crâniennes pariétales pour éviter les hémorragies.
- Mince de l'os à la frontière de la craniotomie, où la vitre de verre sera scellé. Le but est de eeiller tard plane positionnement de la fenêtre en verre avec une surface de contact maximale entre le cerveau et le verre. Retirer lentement l'os en utilisant une pince et nettoyer la dure-mère exposée à la solution de PBS.
- Prenez un tour lamelle de verre de 5 mm de diamètre, le nettoyer avec de l'alcool et le sécher avec du papier absorbant. Essayez d'utiliser la lamelle comme un couvercle pour la craniotomie et confirmer qu'une grande surface plane du cerveau entre en contact avec le verre. Si nécessaire enlever la lamelle à plus d'amincir les os latéraux. Continuez jusqu'à ce que le cerveau peut se pressé plat si appuyant légèrement sur la lamelle, une fois en place.
- Nettoyer à nouveau la lamelle avec de l'alcool, le sécher avec du papier absorbant, et enregistrez-le dehors.
- Avec une aiguille de calibre 26 de faire un trou dans la dure-mère dans le centre de la craniotomie en évitant toutefois les principaux vaisseaux sanguins. Assurez-vous de ne pas endommager le parenchyme cérébral que le but de cette étape est juste d'ouvrir la dure-mère.
- Nettoyez délicatement la dure-mère wième solution PBS pour éliminer le sang hémorragique. Couvrir avec un morceau de papier de soie, tout en préparant l'injection sphéroïde.
- Avec le système d'injection sphéroïde préparé à l'étape 2.1, aspirer un montage du diamètre intérieur du capillaire (environ 200 à 250 um) de la boîte de Pétri préparé à l'étape 1.2 sphéroïde ronde. Sphéroïde devrait venir avec environ 5 milieu de culture de pi. Il devrait tomber à la pointe de la capillarité sous son poids.
- Retirer le papier de soie humide utilisé pour couvrir la craniotomie et positionner l'animal dans le système d'injection.
- Abaissez la pipette d'injection jusqu'à ce qu'il touche le trou fait dans la dure-mère. Ensuite, abaisser à nouveau par 250 um. Attendez 30 secondes.
- Injecter lentement le sphéroïde à l'aide du piston de la seringue microlitre (2-3 ul) tout en pompant le liquide en excès d'une mince feuille de papier de soie. Attendez 30 secondes, puis soulevez délicatement la pipette d'injection de 50 um vers la surface. Attendez encore 30 secondes et s'acquitt la procédure de levage par étapes de 50 um jusqu'à la surface. Les temps d'attente évite l'extraction de l'ellipsoïde qui collerait à la pipette.
- Confirmer la présence de l'ellipsoïde dans le cerveau à l'aide d'un macroscope de fluorescence.
- Mélanger 100-300 diamètre um réticulés billes de gel de dextran avec une solution de PBS dans une boîte de Pétri. Attendez 1min et pêcher quelques perles hydratées. Placez-les sur l'os adjacent à la craniotomie.
- Sous le contrôle macroscopique, choisissez l'une perle avec un diamètre similaire à la taille de l'ouverture dure-mère. Couper le dextrane bille de gel réticulé à l'aide de deux demi-pinces.
- Placez délicatement un gel de dextran hémi-perle réticulé dans le trou d'injection avec la face convexe vers le sphéroïde. Prenez soin de ne pas enlever le sphéroïde et appuyez doucement vers le bas jusqu'à la frontière de l'concave entrer en contact avec la dure-mère environnante.
- Mettre une goutte de colle cyanoacrylate sur une lame de verre; tremper la pointe d'un cure-dent dans la drop pour prendre une petite quantité de colle. Sceller rapidement les bords de l'hémi-gel de dextrane réticulé bourrelet à la dure-mère adjacent par estampage colle autour. Prenez soin d'effectuer des mouvements rapides et précis afin d'éviter le collage du dextran gel semi-perle réticulé au cure-dent. Éviter l'excès de colle qui peut se propager et d'empêcher sinon empêcher imagerie fois séché. Attendez 2 min pour que la colle sèche, puis nettoyer la craniotomie et l'os environnant avec une solution PBS.
- Fenêtre implantation
- Mettez le diamètre de 5 mm ronde lamelle dessus de la craniotomie (voir 2.2.12). Les bords de la lamelle doit être amincie sur le crâne à l'extérieur de la craniotomie. La lamelle couvre-objet doit être en contact avec la dure-mère et l'os sur les bords amincis. Il est très important d'avoir un contact direct entre la dure-mère et la lamelle de verre contraire tissu cicatriciel peut se développer et d'entraver la clarté optique.
- Avec un tissu, d'absorber la PBS sur ee bords de lamelle sorte que la solution ne couvre pas entièrement la craniotomie lors de l'application d'une faible pression dans le centre de la lamelle. De cette manière, l'os, le verre et le cerveau sont collées ensemble sur le côté de la région d'intérêt.
- Maintenir une faible pression au niveau du centre de la lamelle couvre-objet avec une pince tout en appliquant doucement cyanoacrylate à la frontière entre l'os et la lamelle couvre-objet. La colle spontanément se propager jusqu'à l'interface avec une solution de PBS. Solution agira comme une barrière donné le caractère hydrophobe de la colle. Étanchéité devrait être effective en moins d'une minute, mais prendre un soin extrême de ne pas bouger la lamelle jusqu'à ce qu'il soit fixé. Ce serait par ailleurs entraîner une fuite de cyanoacrylate sur la dure-mère donc conduire à un échec de la chirurgie.
- Dans le cas de la colle se serait répandue sur le dessus du verre, enlever à l'aide d'une lame micro-scalpel en faisant des mouvements en spirale comme il peut autrement réduire la clarté optique. Attention à ne pas casser la lamelle de verre During la procédure en raison d'une pression excessive.
- Consolider la fixation de verre par application d'un ciment dentaire sur les bords de la lamelle vers le crâne adjacent. Assurez-vous de couvrir le crâne exposé ensemble jusqu'à ce que le cuir chevelu. Utilisation de ciment supplémentaire, construire des parois latérales autour de la lamelle pour créer le pool nécessaire pour l'immersion de l'objectif. Le ciment dentaire permet de guérir en moins de 10 min.
3. Soins post-opératoires et préparation pour l'imagerie
- Soins post-opératoires
- Retirez la souris du cadre stéréotaxique, injecter Dexamethazon (0,2 mg / kg) et Rimadyl (5 mg / kg) sc sur les régions pelviennes et la déposer dans une cage avec un tissu nid chaud.
- Surveillance de l'animal jusqu'à ce que les effets de l'anesthésie ont disparu. En général de 2 à 3 heures après la chirurgie, les souris sont entièrement mobile. Assurez-vous que l'animal a un accès facile à la nourriture et de l'eau. Fournir à l'animal avec de l'agarose contenant du glucose (agarose3%, glucose 3%).
- Surveiller le poids de l'animal tous les jours et injecter Dexamethazon (0,2 mg / kg) et Rimadyl (5 mg / kg) sc pour la première 10d après la chirurgie. Pour des raisons éthiques, euthanasier les souris lorsque la perte dépasse 15% de son poids initial. La pression intracrânienne augmente avec la taille de la tumeur conduisant à une déficience motrice pour l'animal. Cette lignée cellulaire tumorale est dépendante et se produit à divers délais après l'intervention chirurgicale. Une attention particulière doit être prise pour caractériser le critère de l'expérience avec la lignée cellulaire utilisée.
- Préparation pour l'imagerie
- Légèrement endormir la souris par inhalation d'isoflurane dans une chambre d'induction (1,5% dans l'air pour 1 à 1,5 min).
- Anesthésier les animaux par une injection intra-péritonéale d'un mélange de kétamine / xylazine (100 mg / kg, 10 mg / kg). Cette anesthésie permet généralement 45 min d'observation. Pour effectuer les séances d'imagerie plus, la souris est placé sous inhalation continue de l'isoflurane dansair (0,25-0,75%).
- Appliquer une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement des yeux.
- Mettez l'animal sur un cadre stéréotaxique et bloquer le crâne avec les earbars.
- Pour visualiser les vaisseaux sanguins, un colorant fluorescent peut être injecté par voie intraveineuse.
- Si la fenêtre est sale, il peut être nettoyé en retirant doucement les débris avec une lame mince et le coin d'un tissu. Ne pas utiliser d'alcool pour nettoyer la fenêtre comme il n'est pas toujours compatible avec un ciment dentaire et il peut refroidir le cerveau en dessous de la fenêtre.
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Résultats
Une fois que le protocole opératoire est réalisée (figure 1), les animaux peuvent être observés par microscopie de fluorescence au fil des semaines jusqu'au sacrifice. Une réaction inflammatoire peut être observée après la chirurgie qui disparaît dans une ou deux semaines. La croissance tumorale peut être observé par différentes techniques de microscopie à fluorescence et dont macroscopie microscopie biphotonique (Figure 2). Exemple images représentées ici ont été réalisées sur un m...
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Discussion
Cette approche permet l'utilisation de méthodes d'imagerie optique pour surveiller au fil des jours et des semaines, la croissance d'un gliome orthotopique implanté. Le même animal peut ensuite être soumis à pratiquement n'importe quelle modalité d'imagerie cérébrale au cours de la pathologie; encore la préparation spécifique microscopie à deux photons offre l'occasion unique de parvenir à la résolution subcellulaire dans le cerveau de l'animal vivant. Notre protocole présente l'avantage ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Les auteurs remercient chaleureusement le Dr KK Fenrich, le Dr MC. Amoureux, P. Weber et A. Jaouen pour des discussions utiles; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, le personnel de l'animalerie à IBDML et le personnel de la plate-forme d'imagerie PicSIL à IBDM pour le support technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national du cancer du (INCA-DGOS-INSERM6038) à GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) à FD, par des bourses de la Fédération de la Recherche Médicale et Cancéropôle PACA CR.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Perceuse | Dremel (Allemagne) | 398 | n’importe quelle perceuse chirurgicale à os de haute qualité suffirait |
| Fraise de perceuse (#1/4 Carbure Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | également vendu par Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Pince à épiler Dumont M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Ciment dentaire | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Capillaires en verre sans filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Seringue d’un microlitre (25 & micro ; l) | Hamilton (États-Unis) | 702 | |
| Micromanipulateur | World Precision Instruments (États-Unis) | Kite-R | |
| (robinet d’arrêt 3 voies - Luer lock) | World Precision Instruments (États-Unis) | 14035-10 | |
| Cadre stéréotaxique (adaptateur de souris) | World Precision Instruments (États-Unis) | 502063 | |
| Lamelles en verre | Warner Instruments (États-Unis) | CS-5R (64-0700) | |
| Gel de dextran réticulé (Sephadex) G50 Coarse 100-300 & micro ; Bobines disponibles | auprès de différents fournisseurs, y compris Sigma (Allemagne) | ||
| Pommade oculaire | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Macroscope à fluorescence | Leica MZFLIII (Allemagne) | également vendu par d’autres sociétés | |
| Microscope à deux photons | Zeiss LSM 7MP (Allemagne) | également vendu par d’autres sociétés (Nikon, &hellip ;) | |
| Laser femtoseconde accordable infrarouge (Maï ;-Taï ;) | Spectra Physics (USA) | vendu aussi par d’autres sociétés |
Références
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