L'expression de l'hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l'aide du système d'expression baculovirus

Résumé

Nous décrivons ici un moyen pour exprimer des antigènes de surface du virus de l'influenza correctement repliés et fonctionnels dérivés du nouveau virus H7N9 chinois dans des cellules d'insectes. La technique peut être adaptée pour exprimer ectodomaines de toutes les protéines virales ou cellulaires superficiels.

Résumé

Le système d'expression de baculovirus est un outil puissant pour l'expression de protéines recombinantes. Ici, nous l'utilisons pour produire des versions correctement repliées et glycosylés de la grippe A virus glycoprotéines de surface - l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). A titre d'exemple, nous avons choisi les protéines HA et NA exprimées par le nouveau virus H7N9 qui a récemment émergé en Chine. Cependant le protocole peut être facilement adapté pour HA et NA protéines exprimées par tout autre virus grippal A et les souches de virus B. Recombinant HA (RRS) et NA (ARN) des protéines sont des réactifs importants pour les dosages immunologiques tels que ELISPOT et ELISA, et sont également largement utilisés pour la normalisation des vaccins, découverte d'anticorps, l'isolement et la caractérisation. En outre, les molécules de NA recombinantes peuvent être utilisées pour cribler des inhibiteurs de petites molécules et sont utiles pour la caractérisation de la fonction enzymatique de la Na, ainsi que de sa sensibilité aux antiviraux. Protéines HA recombinées sont également being testés en tant que vaccins expérimentaux dans des modèles animaux, et un vaccin recombinant basé sur HA a récemment été autorisé par la FDA pour une utilisation chez l'homme. La méthode que nous décrivons ici la production de ces molécules est simple et peut faciliter la recherche dans les laboratoires de la grippe, car il permet la production de grandes quantités de protéines rapide et à faible coût. Bien que nous nous concentrons ici sur le virus de la grippe glycoprotéines de surface, cette méthode peut également être utilisé pour produire d'autres protéines virales et cellulaires de surface.

Introduction

Comme une première réponse à la récente émergence du roman H7N9 grippe souche du virus en Chine, nous avons acquis des plasmides portant les séquences génomiques de l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) des gènes des deux premiers isolats. L'utilisation de ces plasmides, nous avons pu construire rapidement des vecteurs d'expression de baculovirus recombinant pour la production de HA et NA dans des cellules d'insectes. Ce système d'expression est bien établi dans notre laboratoire et a prouvé crucial pour bon nombre de nos projets de recherche en cours ^1-8. Les cellules d'insectes sont capables de plier correctement et modif....

Protocole

Une. Génération de baculovirus recombinant

1. Clonage dans plasmides transfert baculovirus
   1. Clone H7 HA et NA N9 ectodomaine (ou tout autre gène HA ou NA) dans des plasmides de transfert pFastBac modifiés (voir introduction). Vecteurs pour HA contenant un domaine de trimérisation C-terminal et une étiquette hexahistidine, ainsi que pour NA contenant un domaine de tétramérisation N-terminal et tag hexa-histidine, ont été décrits ^1,10,11,22 (Figure 1) et peuvent être demandées les auteurs.
      Note explicative: ectodomaines HA exprimées sans un domaine de trimérisation seront pliées de manière incorrecte, ....

Résultats

Molécules HA de A/Shanghai/1/13 et A/Anhui/1/13 exprimé bien avec des rendements d'environ 20 mg / L de culture. NA molécules des deux souches ont montré des niveaux d'expression modérés allant de 0,2 mg / L de culture pour A/Shanghai/1/13 à 0,7 mg / L pour A/Anhui/1/13. Tous les quatre préparations de protéines ont très peu ou pas d'impuretés (figures 8A et B) Le fait d'être de pureté supérieur à AN qui peut s'expliquer par le niveau d'expression. A/Shanghai/1/1.......

Discussion

Bien que l'expression de virus de la grippe HA et NA protéines dans des cellules d'insectes en utilisant le système d'expression baculovirus est généralement simple, il ya plusieurs points importants à considérer. Il est important, comme indiqué dans l'introduction, que les ectodomaines de HA et NA sont exprimés en fusion avec la trimérisation ou la tétramérisation des domaines, respectivement. Ces domaines d'assurer le repliement correct des molécules généralement assistée par le domaine transmembra.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du matériel/ de l’équipement	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires/Description
du baculovirus Bac-à-Bac	Invitrogen	10359-016	Suivez les instructions du fabricant
TNM-FH insect medium	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Réactif	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrifuge filters Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Colonnes en polypropylène (5 ml)	Qiagen	34964
Efficacité maximale DH10Bac bactéries	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	pour tampons d’élution et de lavage
Cellules Sf9	ATCC	CRL-1711
High Five cellules	Invitrogen	B85502

Système d’expression