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Article de méthode

Isolement des vaisseaux sanguins dérivés multipotentes précurseurs du muscle squelettique humain

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DOI :

10.3791/51195

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21 août 2014

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1Stem Cell Research Center, Department of Bioengineering and Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Nazarbayev University Research and Innovation System, Nazarbayev University, 4Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 5Department of Cell Biology, Erasmus MC Stem Cell Institute, 6OHSU Center for Regenerative Medicine, Oregon Health & Science University, 7Centre for Cardiovascular Science and MRC Centre for Regenerative Medicine, Queen's Medical Research Institute and University of Edinburgh, 8David Geffen School of Medicine and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 9Stem Cell Research Center, Department of Orthopedic Surgery and McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

Dans cet article

Résumé

Les vaisseaux sanguins à l'intérieur du squelette port musculaire plusieurs populations de précurseurs multi-lignée humaine qui sont idéales pour les applications de régénération. Cette méthode permet l'isolement de purification simultanée de trois populations de cellules précurseurs pluripotentes respectivement à partir de trois couches de structure des vaisseaux sanguins: les cellules myogéniques endotheliales de l'intima, média de péricytes et les cellules de l'adventice de l'adventice.

Résumé

Depuis la découverte de cellules souches stromales / mésenchymateuses (CSM), l'identité d'origine et la localisation des cellules souches mésenchymateuses ont été obscurcies par leur isolement rétrospective en culture. Récemment, en utilisant le tri de cellules activé par fluorescence (FACS), nous et d'autres chercheurs ont identifié et purifié de façon prospective les trois sous-populations de cellules précurseurs pluripotentes associées à la vascularisation du muscle squelettique humain. Ces trois populations de cellules: les cellules endothéliales myogéniques (CEM), les péricytes (PC), et les cellules de l'adventice (ACS), sont localisés respectivement aux trois couches structurelles des vaisseaux sanguins: intima, les médias, et l'adventice. Tous ces cellules souches humaines vaisseaux sanguins dérivés (hBVSC) les populations non seulement expriment des marqueurs de MSC classiques mais possèdent également des potentiels de développement du mésoderme similaires à MSC typiques. Auparavant, CEM, PC, et les CA ont été isolés au moyen de protocoles distincts et caractérisé par la suite dans des études séparées. La prot d'isolement courantocol, grâce à des modifications au processus d'isolement et des ajustements dans les marqueurs de surface cellulaire sélectifs, nous permet de purifier simultanément les trois sous-populations hBVSC par FACS à partir d'une seule biopsie musculaire humaine. Cette nouvelle méthode permettra non seulement de simplifier l'isolement de plusieurs sous-populations de BVSC mais aussi faciliter futures applications cliniques de hBVSCs à des fins thérapeutiques distincts.

Introduction

Muscle squelettique humain a été considéré comme une source cliniquement intéressante de cellules souches / progénitrices. Le muscle squelettique contient pas seulement commis progéniteurs myogéniques myoblastes squelettiques, mais aussi des cellules souches myogéniques primitives, y compris les cellules satellites et les cellules souches dérivées du muscle (MDSC) 1. L'utilisation de cellules humaines dérivées du muscle souches / progénitrices, autologues ou allogéniques, en médecine régénérative a été étudiée dans des modèles animaux précliniques et des essais cliniques. Les applications de régénération des cellules souches / progénitrices musculaires vont de la régénération du muscle dystrophique dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) pour la réparation de patients blessés dans le cœur des patients avec crise cardiaque.

Depuis la découverte de souches de cellules mésenchymateuses / stromales (CSM) et d'autres populations de cellules précurseurs pluripotentes, comprenant des cellules de moelle osseuse dérivées multipotentes progénitrices adultes (PCMA) et les cellules souches du tissu adipeux (ADSCs), souches adultes /cellules souches ont été étudiées à ce jour 1-9. Néanmoins, leur identité et à la localisation native in situ ont été obscurcies par les méthodes d'isolement rétrospective. Récemment, en utilisant la cellule activé par fluorescence (FACS), nous et d'autres groupes avons prospectivement identifiés et trois populations de cellules précurseur multipotentes purifiés à partir de vaisseaux sanguins dans le muscle squelettique humain et plusieurs autres organes: les cellules endothéliales myogéniques (CEM), les péricytes (PC), et les cellules de l'adventice (AC) 10. Ces trois sous-populations de cellules souches vaisseaux sanguins humaines dérivées (hBVSCs) se retrouvent respectivement dans les trois couches de structure des vaisseaux sanguins: intima, la média et adventice. Plus précisément, les CEM et les PC sont détectés dans les microvaisseaux capillaires et tout AC sont localisés dans la couche de l'adventice des artères et des veines plus larges. Chaque sous-ensemble de cellules précurseurs exprime une combinaison unique d'antigènes de surface cellulaire CEM: (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -), et AC (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).

Une caractérisation supplémentaire de ces sous-ensembles de hBVSC a révélé que les trois populations de cellules précurseurs possèdent des potentiels de développement de cellules souches mésenchymateuses mésodermiques similaires typiques, y compris la myogenèse squelettique, l'ostéogenèse, la chondrogenèse, et l'adipogenèse. Tous les sous-ensembles hBVSC présentent également des marqueurs de MSC classiques, y compris CD44, CD73, CD90, CD105 et, fraîchement et dans la culture. Ensemble, ces éléments de preuve faveur de l'origine vasculaire des cellules souches mésenchymateuses. En outre, les capacités thérapeutiques de CEM, les PC, et les CA ont récemment été démontré dans des études séparées. CEM triés à partir de biopsies musculaires humaines adultes ont été présentés pour régénérer les muscles blessés et dystrophiques squelettiques et la réparation blessés myocarde plus efficacement que les myoblastes squelettiques et vasculaire endocellules épithélial (ECS). Ont également été montré PC purifiés provenant de différents organes humains pour réparer / régénérer les muscles squelettiques blessés et dystrophiques et de contribuer à la piscine des cellules satellites 13-16. Très récemment, nous avons démontré que les PC issus de muscle squelettique humain réparer efficacement le myocarde infarctus par effet paracrine indirecte et interactions cellulaires directes 17. CA, d'autre part, ont été directement isolé à partir de vaisseaux sanguins ou explantées purifié par FACS de tissu adipeux et le muscle squelettique humain. Un effet pro-angiogénique notable de CA a été démontrée chez la souris des membres postérieurs modèle d'ischémie 19. En outre, les CA ont également été montré pour réparer le myocarde infarci plus efficacement que les cellules souches mésenchymateuses classiques, indiquant le potentiel thérapeutique solide de CA dans la réparation de tissu ischémique 20.

Les subventions du protocole de purification courants simultanés, purification prospective de CEM, les PC, etCA de la vascularisation d'un seul squelette biopsie musculaire humaine. Cela nous permet d'étudier et / ou choisir la sous-population de hBVSC optimale à des fins thérapeutiques distincts. En outre, cette nouvelle technique élargit encore le répertoire de cellules souches / progénitrices qui peuvent être dérivées à partir de muscle squelettique humain, ce qui en fait une source de cellules précurseurs pluripotentes idéal pour la médecine régénératrice.

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Protocole

1. Muscle traitement biopsie

  1. Conserver biopsie musculaire squelettique humain sur de la glace dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de 5% de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (P / S) pendant le transport.
  2. Après la réception de la biopsie musculaire, retirer l'échantillon du récipient de transport et le laver deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) additionné de solution d'antibiotique-antifongique 2% (A / A) dans des conditions stériles.
  3. Retirez le joint adipeux et du tissu conjonctif avec des ciseaux et des pinces stériles dans DMEM additionné de 2% A / A.
  4. Enlever les grands vaisseaux sanguins sous la dissection microscope, puis couper l'échantillon de muscle en petits morceaux (<1 cm 2 en taille).
  5. Préserver pièces musculaires coupées (<5 grammes) dans 20 ml de milieu de conservation (PM; DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% P / S) à 4 ℃ pour un maximum de 5 jours.

2 Muscle Dissociation et cellules d'isolement

  1. Le jour de l'isolement des cellules, enlever des morceaux de muscles de PM et laver deux fois dans du PBS additionné de 2% P / S. Pour rendre la solution de digestion et de type I, type II et de type IV collagénases (100 mg / ml) fraîchement en PM.
  2. Hacher finement et hacher mécaniquement morceaux de muscle avec des ciseaux et des pinces stériles dans une boîte de Pétri avec une petite quantité de PM jusqu'à ce que la solution passe 10 ml pipette sérologique sans coagulation. Retirer le tissu adipeux et le tissu conjonctif résiduel lors de ce processus. Utilisez au moins 8-10 grammes de muscle adulte ou 2 grammes de muscle fœtal pour chaque isolement cellulaire.
  3. Transfert 4-5 grammes de muscle adulte haché 20 ml (ou 2 grammes de muscle fœtal haché dans 10 ml) DELA solution de digestion avec une pipette sérologique de 10 ml. Digérer pour 50 - 60 minutes à 37 ℃ sur un agitateur orbital à 70 à 80 tours par minute. D'optimiser le rendement de la cellule et la préservation de l'antigène de surface en ajustant le temps de digestion et / ou la vitesse d'agitation en conséquence sur la base de la quantitéde tissu. Observer l'état de la digestion toutes les 15-20 minutes jusqu'à ce que la turbidité disparaît presque.
  4. Vigoureusement la pipette le tissu digéré 3-5 fois avec une pipette sérologique de 10 ml. Ajouter la même quantité de PM pour arrêter la réaction et puis centrifuger à 400 g pendant 4 min.
  5. Retirez délicatement le surnageant; remettre en suspension la pastille avec 10 ml h à laver, et ensuite filtré à travers un tamis cellulaire de 100 um.
  6. Centrifuger à 400 g pendant 4 min et retirez délicatement le surnageant. granulés de remettre en suspension dans un tampon de lyse des érythrocytes (155 mM de NH 4 Cl, 10 mM de KHCO 3, 0,1 mm EDTA), filtrer à travers un tamis de 70 um de la cellule pour obtenir une suspension cellulaire unique, puis incuber pendant 10 min à température ambiante. Filtrer à travers un tamis cellulaire de 70 m de nouveau le cas échéant on observe une précipitation.
  7. Centrifuger à 400 g pendant 4 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 ml de PBS. Compter le nombre de cellules. Obtenir un total d'au moins 5 millions de cellules pour le tri de cellules. Diluer le single suspension cellulaire à moins de 5 millions de cellules par ml avec du PBS pour la coloration. Sortez 50-100 ul de la suspension cellulaire et divisée en 11 tubes pour les colorations de contrôle (contrôle sans tache, témoins négatifs, et d'une seule couleur de contrôles positifs).

3. cellulaire étiquetage et de tri

  1. Incuber la suspension de cellules individuelles pendant 10 min à 4 ℃ dans le sérum de souris (dilué à 1:10 dans du PBS) pour bloquer le but, si nécessaire.
  2. Ajouter CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, et CD146-FITC (tous 1: 100) dans la suspension cellulaire unique et incuber pendant 20 min à 4 ℃. Pour le contrôle négatif, ajouter des concentrations équivalentes de APC-APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE, et des anticorps IgG isotype conjugués au FITC et incuber pendant 20 min à 4 ℃. Pour une seule couleur contrôles positifs, ajouter des concentrations équivalentes de CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, et CD146-FITC individuellement dans chaque tube et incuber pendant 20 min à 4 ℃.
  3. Après incubation, Centrifuger à 400 g pendant 4 min à laver. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 - 2 ml de milieu DMEM additionné de 5% de FBS et 1% de P / S. La concentration finale de la suspension cellulaire doit être inférieure à 5 millions de cellules par ml. Ajouter 7-AAD (1: 100) et incuber pendant 15 min à température ambiante pendant exclusion mort cellulaire. Pour le contrôle négatif et d'une seule couleur témoins positifs, des pastilles de cellules remise en suspension dans 0,5 ml de DMEM additionné de 5% de FBS et 1% de P / S.
  4. Transférer toutes les suspensions cellulaires à fond rond de flux de polystyrène cytométrie tubes. Préparer des tubes de prélèvement de cellules (chaque tube est pré-remplie avec 500 pi de milieu de culture approprié: MPM pour CEM; EGM-2 pour PC, support CA pour CA). Des suspensions de cellules de transport sur de la glace à la trieuse de cellules.
  5. Suspensions cellulaires sur Exécuter dans le trieur de cellules dans l'ordre de la commande sans tache, contrôles négatifs, une seule couleur contrôles positifs, et la suspension de cellules principale tout en ajustant l'intensité du laser, compensation de canal, et la population de cellules gating rigoureusement afin de maximiser cellule purity (s'il vous plaît se référer à des articles publiés par Jupiter et d'autres revues pour plus de détails de la cytométrie de flux).
  6. Recueillir des populations de cellules désirées dans les tubes de collecte appropriés. Magasin cellules recueillies à 4 ℃ sinon ensemencement immédiatement.

4. post-tri culture cellulaire

  1. Semences CEM fraîchement triées (P0) à <10 000 cellules / cm 2 dans MPM sur des plaques pré-revêtues de collagène de type I. Pour des passages ultérieure de CEM, semences 3500 - 4000 cellules / cm 2 à MPM sur plaques / flacons pré-revêtues de collagène de type I.
  2. Graine PC fraîchement triées (P0) à <20 000 cellules / cm 2 dans EGM-2 sur des plaques fraîchement enduites de gélatine à 0,2%. Pour la suite des passages d'ordinateurs, à fractionner les cellules rapport 1: 3 dans du milieu PC (DMEM supplémenté avec 20% de FBS et 1% de P / S) sur des plaques de culture en polystyrène réguliers jusqu'à ce que P2. De P3 en avant, les cellules de semences à 6.500 - 7.000 cellules / cm 2 dans le milieu de PC sur réguliers culture de polystyrène plaques / flacons.
  3. Graine fraîchement triées CA (P0) à <20 000 cellules / cm 2 dans un milieu AC (DMEM supplémenté par 20% de FBS et 1% de P / S) sur des plaques de culture en polystyrène réguliers. Pour des passages ultérieure de CA, les cellules de semences à 6.500 - 7.000 cellules / cm 2 en moyenne sur AC réguliers culture de polystyrène plaques / flacons.

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Résultats

Les paramètres de FACS sont d'abord corrigées sur la base des données obtenues à partir du témoin non coloré, des témoins négatifs, et une seule couleur témoins positifs. Après exclusion de cellules mortes, d'une suspension de cellules marqué par fluorescence est soumis à une série de sélections positives et négatives marqueurs de surface cellulaire. Tout d'abord, les cellules CD45 + sont déclenchés avant CD56 + et CD56 - les cellules sont séparées du CD45 - fracti...

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Discussion

Identification et la purification des sous-populations hBVSC représentent une avancée majeure dans la compréhension de MSC ontogenèse. Il ya des preuves croissantes indiquant l'origine périvasculaire des cellules souches mésenchymateuses et l'association entre les cellules précurseurs spécifiques de tissus et les vaisseaux sanguins 22-25. En outre, la capacité d'isoler des sous-populations homogènes de hBVSCs sida davantage la compréhension de MSC hétérogénéité et la biologie vasculaire cellule

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Déclarations de divulgation

J.H. a reçu une rémunération de Cook MyoSite, Inc. pour des services de conseil et pour les redevances reçues provenant de licences de technologie pendant la période où la recherche ci-dessus a été effectuée. Tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Alison Logar pour son excellente assistance technique avec la cytométrie de flux. Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère de la Défense (JH), la chaire J. Mankin Henry (JH), et le ministère de l'Éducation et de la Science de la République du Kazakhstan (AS). CWC a été financé en partie par la bourse pré-doctorale de l'American Heart Association (11PRE7490001). M.Corselli a été soutenu par le California Institute for Regenerative Medicine bourse de formation (TG2-01169).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Collagénase de type 1SigmaC5894Flacon stérile
Collagénase de type 2SigmaC1764Flacon stérile
de collagénase de type 4SigmaC1889Flacon stérile
Anti-humain CD34 APCBD Pharmingen555824Maintenir stérile
Anti-humain CD45 APC-Cy7BD Pharmingen557833Maintenir stérile
Anti-humain CD56 PE-Cy7BD Pharmingen  ;557747Rester stérile
Anti-humain CD144 PEBeckman CoulterA07481Maintenir stérile
Anti-humain CD146 FITCAbD SerotecMCA2141FGarder stérile
FACS Aria II Cytomètre en fluxBecton-Dickinson
EGM-2 milieu completLonzaCC-3162Pour la culture de PC (uniquement P0)
DMEM à haute teneur en glucose (1X), liquide, avec L-glutamine, sans pyruvate de sodiumInvitrogen11965Pour la culture de PC
DMEM à haute teneur en glucose (1X), liquide, avec L-glutamine, avec pyruvate de sodiumInvitrogen11995Pour la culture de MEC et de CA
Sérum fœtal de veauInvitrogen10437-028
Sérum de cheval inactivé par la chaleurInvitrogen26050-088
Pénicilline/streptomycineInvitrogen15140-122
Antibiotique-antimycosique (100X)Invitrogen15240-062
Trypsine-EDTA 0,5 % (10X)Invitrogen15400-054
Dulbecco' s PBS sans calcium et magnésiumInvitrogen14190-250
Extrait d’embryon de pouletPrécis ChimiqueCE650T-10Filtre avant utilisation

Références

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Réimpressions et autorisations

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