Nous introduisons une méthode chirurgicale pour induire expérimental d'ischémie / reperfusion (I / R) des blessures pour simuler un infarctus du myocarde (IM) dans les modèles de souris qui permet une plus grande clarté dans le positionnement de la ligature sur l'artère interventriculaire antérieure gauche (LAD) d'augmenter la reproductibilité d'expériences MI chez la souris.
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Article de méthode
Un modèle murin d'ischémie myocardique-reperfusion par ligature de l'artère interventriculaire antérieure
Dans cet article
Résumé
Résumé
Infarctus du myocarde aigu ou chronique (MI) sont des événements cardiovasculaires résultant de taux élevés de morbidité et de mortalité. Établir les mécanismes pathologiques à l'œuvre lors MI et le développement d'approches thérapeutiques efficaces exige une méthodologie reproductible pour simuler l'incidence clinique et refléter les modifications physiopathologiques associés à MI. Ici, nous décrivons un procédé chirurgical pour induire MI dans des modèles de souris qui peut être utilisée pour court terme d'ischémie-reperfusion (I / R) des blessures ainsi que la ligature permanente. L'avantage majeur de cette méthode est de faciliter la localisation de l'artère descendante antérieure gauche (LAD) pour permettre la ligation précise de cette artère pour induire une ischémie dans le ventricule gauche du cœur de souris. Le positionnement précis de la ligature sur la DAL augmente la reproductibilité de la taille de l'infarctus et produit des résultats plus fiables ainsi. Une plus grande précision dans le placement de la ligature d'améliorer les approches chirurgicales standard pour simuler MI chez la souris, tmari de réduire le nombre d'animaux de laboratoire nécessaires pour les études statistiquement pertinentes et d'améliorer notre compréhension des mécanismes produisant une dysfonction cardiaque après un infarctus. Ce modèle murin d'infarctus du myocarde est également utile pour le test préclinique de traitements ciblant la lésion myocardique après un IM.
Introduction
Des modèles animaux de l'infarctus du myocarde (MI) sont importants dans la recherche de la physiopathologie complexe de maladie cardiaque ischémique 1. Ischémie-reperfusion (I / R) des blessures est un contributeur majeur de la lésion myocardique généré pendant MI. La blessure de l'ischémie initiale produite par occlusion de la circulation coronaire peut être réduite chez les patients MI par l'utilisation de l'angioplastie pour restaurer la perfusion en temps opportun. Bien que cette intervention a considérablement réduit le nombre de décès dus aux infarctus aigu du myocarde, la restauration du flux sanguin dans les résultats de la zone ischémique dans I / R blessures qui conduit à la mort des cardiomyocytes. Cette perte de masse myocardique contribue à la diminution du débit cardiaque et de la progression vers l'insuffisance cardiaque. Ainsi, l'étude des mécanismes qui conduisent à la mort des cardiomyocytes de I / R blessures est une ligne importante de l'enquête dans la recherche cardiovasculaire. Ligature coronaire chirurgicale est une technique expérimentale utile pour induire des modèles de MI dans différents types d'animaux, y cong le rat, le chien et le cochon. Publications dans des laboratoires différents ont mis en place différentes méthodes sur la mise en place du modèle de coeur de souris de I / R blessures 2,3. Afin de mieux comprendre ces mécanismes, nous devons avoir accès à des modèles animaux fiables qui peuvent se reproduire plusieurs aspects de MI pathologie. Le développement de ces modèles est également essentielle pour tester des approches thérapeutiques pour le traitement de l'IM et de blessures I / R associé.
La plupart des techniques chirurgicales actuellement disponibles pour simuler MI chez des animaux expérimentaux impliquent dissection chirurgicale dans la cavité de la poitrine afin d'exposer la artère descendante antérieure gauche (LAD) qui est ensuite fermé par une ligature pour la période de temps définie afin de produire l'événement ischémique. Alors que la ligature peut être retiré pour permettre la reperfusion ischémique de la zone de génération et d'E / R de blessure. Une limitation majeure de ces approches en ce que la position de la littérature sur la LAD n'est pas toujours fidèlement reproduit, ce quipeut conduire à une variation de la sévérité de la MI induite par cette approche. La plupart des techniques disponibles décrites que de façon générale l'emplacement approximatif de la DAL dans la paroi antérieure du cœur. Comme la ramification et la direction de la LAD peuvent varier dans chaque animal l'emplacement n'est pas toujours fixe et peut être facilement confondue 4,5, conduisant à des complications potentielles pendant la chirurgie 6. Les conséquences de la mise en place incorrecte de la ligature peut courir à partir de la variabilité de la taille de l'infarctus induit dans le ventricule gauche à compromettre complètement la spécificité du modèle. Nous présentons ici une méthode modifiée pour I / R myocardique et la ligature permanente chez les souris qui permet d'améliorer la précision de placement de la ligature sur la DAL. En appliquant des approches spécifiques pour l'incision initiale et dissection interne, ainsi que l'utilisation des manipulations de lever les oreillettes pour permettre une meilleure appréciation de la DAL et le site où il se dégage de l'aorte. Instituant laposition sur la LAD et son origine est l'occasion pour ligaturer la DAL dans un mode reproductible. Ce modèle d'infarctus I / R et la ligature permanente non seulement diminue la variation de la taille de l'infarctus après une intervention chirurgicale, il peut également diminuer l'incidence des saignements excessifs pendant le fonctionnement.
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Protocole
Ce protocole a été approuvé par l'animal et est en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) à l'Ohio State University. Toutes les politiques élaborées par le IACUC locale sont en conformité avec le Guide de l'expérimentation animale développé par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire à l'Institut National de la Santé.
1. Anesthésie et l'intubation endotrachéale
- Autoclave tous les instruments et les fournitures chirurgicales avant utilisation. Porter des gants chirurgicaux stériles, à usage unique tout au long de la procédure. Maintenir un champ stérile tout au long de la procédure. L'utilisation d'un champ stérile est suggéré mais non montré dans la vidéo pour permettre une meilleure visualisation des repères anatomiques sur la souris.
- Placer chaque souris individuellement dans une chambre d'induction et de fournir une anesthésie à l'aide de 5% d'isoflurane et d'oxygène avec un débit de 0,4 L / min jusqu'à ce que l'écoulement perte du réflexe de redressement, puis de maintenir èmee animal avec 2% d'isoflurane dans de l'oxygène à 100% avec un débit de 0,4 L / min à l'aide d'un tube de cône de pointe reliée à l'appareil d'anesthésie jusqu'à ce que le tube trachéal est en place. La machine d'anesthésie à l'isoflurane utilisé ne doit être évacué de manière appropriée et muni de filtres à charbon pour réduire au minimum l'exposition du chirurgien de fumées isoflurane pendant la procédure. La coiffe est noté, mais ne figure pas dans la vidéo pour permettre la visualisation des manipulations d'intuber la souris.
- Raser la poitrine de l'animal avec une tondeuse à cheveux de l'animal dans un emplacement différent de celui de la plate-forme d'intervention chirurgicale pour éviter la contamination de l'emplacement de chirurgie.
- Placez la souris dans une position couchée sur la plateforme de la chirurgie pour l'intubation ultérieur. Une simple petite plate-forme de la mousse de polystyrène peut servir de plate-forme d'exploitation. Couvrir la plate-forme avec un champ pré-stérilisé pour fournir une surface stérile. Placer un coussin chauffant entre la plate-forme et le drapé afin de maintenir la température du corps des souris en Surgical procédures.
- Fixez une longueur de 2-0 suture en soie d'au moins 10 cm de la plate-forme avec du ruban adhésif, puis boucle de la suture autour des incisives supérieures avant. Positionner le cône à proximité (3.2 cm) du bord de la plate-forme sur le nez de la souris. Tirez le tendu de la souris et le fixer à la plate-forme par la queue avec un morceau de ruban adhésif.
- Fixez les pieds sur les côtés du corps avec des brins de ruban. Il est important que les membres antérieurs sont pas trop tendus, car cela peut compromettre la respiration.
- Préparer les sites chirurgicaux rasé avec de la bétadine et alcool avant du cou et de la poitrine incisions sont faites.
- Placer la plate-forme avec la tête de la souris pointant dans la direction de l'opérateur. Couper une médiane incision de la peau du col 0,5 cm. Séparer les lobes de la glande thyroïde à leur isthme pour exposer le muscle sternohyoideus où la trachée peut être vu sous le muscle.
- Retirer l'aiguille intérieure d'un trocart de calibre 18 de sorte qu'il peut être utilisé comme un intubtube d'ation. La pointe de l'aiguille peut servir de support et à 1 cm du tube externe peut servir de tube trachéal.
- Maintenez la langue de la souris avec des pinces courbes dans une main et le déplacer légèrement vers le haut. Voir la trachée à travers l'incision cervicale de la peau. Utiliser l'autre main pour insérer doucement le tube d'intubation jusqu'à ce que le tube est vu à l'intérieur de la trachée.
- Dès que le tube est dans la trachée, déplacer les pinces courbes en revanche vers le tube et rapidement retirer l'aiguille intérieure. Si le tube ne peut pas être insérée dans la trachée, le tube doit être retiré pour éviter de produire des problèmes respiratoires. Il est important de pointer le bout du tube quand il est à proximité de la gorge afin d'éviter l'insertion du tube dans l'oesophage à la place de la trachée.
2. Ventilation et fixation
- Fournir une ventilation artificielle avec un appareil respiratoire des animaux de ventilation 2% d'isoflurane dans de l'oxygène avec un taux de 0,4 L / min. Utilisez un Y-sha modifiéconnecteur pe se connecter le tube d'intubation avec le ventilateur. Le positionnement correct de la sonde trachéale peut être confirmé en jugeant l'ampliation thoracique symétrique.
- Réglez le volume de marée à 260 pi / course et taux de ventilation est de 130 coups par minute, qui peuvent être ajustées au poids du corps d'une souris particulière si nécessaire.
- Retirez le ruban adhésif sur la queue et mettre la souris doucement pour le placer dans une position latérale droite de décubitus pour la chirurgie ultérieure. Utilisez du ruban adhésif pour fixer la queue et les pattes de la plate-forme à nouveau.
- Introduire la sonde rectale pour surveiller la température du corps et ajuster le coussin chauffant pour maintenir la température aux alentours de 37 ° C.
- Fixer la sonde à la plate-forme en utilisant du ruban. Injecter bupivacaïne voie sous-cutanée au site d'incision pour engourdir la région avant l'incision est faite.
3. Thoracotomie
- Faire une incision oblique qui est d'environ 1 cm de long à un site de 2 mm de la gauchefrontière sternale dans la direction de l'endroit où la patte avant gauche rencontre le corps (environ 1-2 mm au-dessous de laquelle la jambe et le corps se joignent). La veine thoracique superficielle est près de ce site et de l'incision doit être faite de telle sorte que l'extrémité latérale de l'incision va jusqu'à, mais ne coupe pas dans la veine.
- Couper si le muscle thoracique pour exposer les nervures en dessous. Au cours de cette étape d'éviter toute blessure accidentelle de la cuve. Si le saignement ne se produit, utiliser des applicateurs de coton pour arrêter le saignement avant de passer à l'étape suivante 7.
- Visualisez les nervures et gonfler les poumons à travers la paroi de la poitrine mince et semi-transparent. Ouvrez la cage thoracique à l'aide des ciseaux chirurgicaux à faire une incision de 6-8 mm dans le troisième espace intercostal. Cette incision doit être au minimum de 2 mm du bord sternal où l'artère thoracique interne est situé. Dommages à l'artère va produire des saignements abondants qui est difficile à contrôler.
- Insérez les rétracteurs de poitrine maison pré-stérilisés into l'incision et tirez doucement l'arrière pour ouvrir l'incision de sorte qu'il est d'environ 8-10 mm de large, en prenant soin d'éviter les poumons. Les écarteurs doivent être fixés à la plate-forme chirurgicale avec des épingles.
- A ce stade, le coeur doit être visible, cependant, le poumon sera toujours couvrir une partie du cœur. Décrochez le péricarde délicatement avec une pince courbes, le démonter, et faites glisser le tissu derrière les écarteurs. Au cours de cette manipulation du poumon se soulève et du coeur.
4. Positionnement CONT
- Localisez le DAL sur la surface du cœur à travers un microscope de dissection. Le DAL descend au milieu de la paroi cardiaque de près de la pointe du cœur à travers le ventricule gauche. Le DAL apparaît rouge vif et émet des impulsions fortement. La veine ici est parfois confondu avec le DAL, mais un bon éclairage peut aider à distinguer les deux navires. Si l'éclairage est trop lumineux, il peut être difficile d'apprécier la couleurles différences entre les navires.
- Utilisation d'un fragment de boule de coton stérile avec un diamètre d'environ 1-2 mm pour préparer la LAD pour la ligature. Placez le coton entre l'oreillette gauche et ventricule gauche, qui lèvera l'oreillette gauche et aider à exposer la LAD et de clarifier sa position. Si la DAL ne peut pas être localisé, le fragment peut être glissé plus loin dans l'oreillette gauche afin levée encore plus élevé pour révéler l'aorte où la DAL est originaire.
5. CONT ligature
- Le positionnement idéal pour la ligature est d'environ 2 mm inférieure à la pointe de l'oreillette gauche. Le tronc pulmonaire peut être utilisé comme marqueur pour identifier l'oreillette gauche. En variante, la position de la ligature peut être visualisée comme un point 1-2 mm de la ramification de la circonflexe gauche. Utilisez une pince courbes d'appliquer doucement la pression sur un site juste en dessous du point de ligature destinée. Ainsi, il sera plus facile de voir l'artère et aidera à maintenir le coeur en placeet de simplifier lier la ligature. Ne pas appliquer de pression avec la pince pour plus de 5 secondes à la fois et éviter la compression du cœur qui pourrait modifier pompage.
- Utiliser une aiguille effilée pour passer une suture de soie 6-0 sous la LAD tout en observant avec un microscope à dissection. Insérez l'aiguille dans l'artère avec une précision que l'aiguille pénétrer dans la chambre du ventricule gauche s'il est placé trop profondément ou endommager le DAL si l'aiguille est trop peu profonde. Si la banque DAL est blessé retirer l'aiguille et la suture de la DAL pour contrôler le saignement, mais si le saignement ne peut pas être contrôlée, il est préférable d'euthanasier l'animal.
- Faites un double noeud lâche avec la suture, laissant une boucle de 2-3 mm de diamètre par lequel un long morceau de tube PE-10 de 2-3 mm est placé 8.
- Serrer la boucle autour de l'artère et tubes puis fixez la boucle en liant un nœud coulant supplémentaires, en prenant soin de ne pas endommager la paroi du ventricule. Pour la ligature permanente, lier directement la LAD avec unnouer 9. Confirmer l'occlusion de LAD en vérifiant apparition d'une couleur plus pâle dans la paroi antérieure du LV qui doit apparaître en quelques secondes après la ligature.
- Retirez l'enrouleur et fermer la plaie temporairement en pinçant la peau avec une pince bulldog. La durée pendant laquelle est maintenue l'ischémie dépend de la conception de l'expérience, mais il est souvent 20, 30, 45 ou 60 min. La souris reste sur le ventilateur pendant la durée de l'occlusion de l'artère LAD.
6. Reperfusion
- Après la période d'ischémie retirer le clip de bouledogue et insérer les rétracteurs de la poitrine pour exposer la ligature. Dénouer le nœud et retirer le tube PE-10. Confirmez reperfusion en observant un retour de la couleur rose-rouge de la paroi antérieure de la LV après 15-20 sec.
- Laissez la suture en place si 2% de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) et coloration au bleu seront effectuées après la reperfusion. Si la coloration n'est pas nécessaire, la suture peut be éliminée.
- Le temps de reperfusion dépend de la conception de l'expérience, qui s'étend généralement de 1 h à 24 h.
7. Poitrine fermeture et Soins postopératoires
- Fermez la cavité thoracique par couture fermé l'incision dans l'espace intercostal 3 ème 4-0 suture de soie. Il est important que les poumons sont clairs de la suture et ne deviennent pas piégés comme la 3 ème et 4 ème nervures sont suturées. Tout en liant les nœuds de suture, il est utile d'appliquer une légère pression sur la poitrine avec le porte-aiguille afin de minimiser tout l'air de la pièce qui pourrait être piégé dans la cavité thoracique.
- Fermez toutes les couches de muscles avec des sutures continues à l'aide de soie 4-0. Utilisez fils de nylon pour fermer la peau avec une suture continue. En variante, la peau peut être fermée avec une suture interrompue.
- Lorsque la suture est cessez complète le flux de l'isoflurane en oxygène continue à couler. Une fois que la souris se déplace ses moustaches ou la queue il, should commencer à faire des tentatives pour respirer spontanément. Retirez la souris du ventilateur avec le tube d'intubation toujours conservés dans la trachée.
- Observez attentivement l'animal jusqu'à ce que la souris reprend une respiration normale, puis extubation la souris. Le tube doit être retiré lentement pour éviter l'aspiration de sécrétions de la cavité orale.
- Confirmez la souris n'est pas du tout une détresse respiratoire en l'observant pour un autre 3-5 min avant de le retourner dans une cage. Si des signes de déshydratation sont observés après la chirurgie, de fournir jusqu'à 0,5 ml de solution saline stérile par injection intrapéritonéale.
- Pour l'analgésie post-opératoire, administrer un analgésique opioïde (buprénorphine, 0,1 mg / kg) sous-cutanée (SC) avant que l'animal est ambulatoire et ensuite fournir une dose supplémentaire chaque 4-6 h pour le 24 heures suivant. Vérifiez les signes de détresse des animaux à 12 h après la chirurgie. Simulation de l'infarctus du myocarde en utilisant la chirurgie de survie nécessite une évaluation de la douleur et de la détresse après la récupération de la surgery. La meilleure pratique acceptée actuelle est de fournir une analgésie pour les 24 premières heures suivant une procédure invasive avec des doses supplémentaires donnés comme justifié en raison de la perte de poids ou des signes de douleur. Pour la ligature permanente, le poids corporel doit être suivi chaque jour pour aider à évaluer le rétablissement de l'animal.
- L'ibuprofène (Motrin), un médicament anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) avec des anti-inflammatoires, analgésiques et antipyrétiques, ou d'autres AINS, peut être prévue dans l'eau potable de l'animal comme une solution à 0,2 mg / ml pour deux jours avant la chirurgie et jusqu'à un 7 jours après la chirurgie dans le long avec le buprénorphine pour gérer tout supplémentaire douleur / détresse.
8. Mesures de myocarde taille de l'infarctus
- Anesthésier et intuber la souris à la fin du temps de reperfusion souhaitée. Coupez la peau de la poitrine sur la ligne médiane de la xiphoïde. Ouvrir l'abdomen et le diaphragme au-dessous de la cage thoracique et des deux côtés de la ligne claviculaire.
- Exposer le coeur et puis re-ligaturer la DAL au même endroit. Cathétériser l'aorte ainsi 10% bleu de phtalocyanine peut être lentement injecté directement dans l'aorte pour colorer le coeur pour la délimitation de la zone ischémique de la zone non ischémique 10.
- Rapidement exciser le coeur et le laver à 30 mM de KCl (solution de chlorure de potassium) de cesser les battements du cœur et permettre le sectionnement plus cohérente. Geler le cœur pendant au moins 4 heures à -20 ° C et couper le coeur en tranches de 1 mm en utilisant une matrice de coeur dispositif 11 de sectionnement.
- Incuber tranches de coeur avec 2% TTC à 37 ° C pendant 40 min. La zone de l'infarctus est délimité comme une zone blanche en tissu viable tache rouge.
- Fixer les coupes colorées à 10% de formaldéhyde durant la nuit, ce qui permettra d'augmenter le contraste entre la zone de l'infarctus et le tissu normal. Photographier les tranches et calculer la zone à risque (AAR), la zone non ischémique et la zone de l'infarctus en utilisant le logiciel ImageJ.
9. Mesure des niveaux d'enzymes cardiaques
Mesurer la troponine cardiaque I (cTnI) les niveaux dans le sérum des souris par l'obtention à partir de sang de la veine porte, puis en isolant le sérum par centrifugation. Les taux sériques de troponine Ic sont alors déterminées par un test rapide cTnI quantitative 12.
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Résultats
Après 24 heures de reperfusion, l'analyse de la taille de l'infarctus et la zone à risque (AAR), par phthalo colorant bleu et chlorure de triphényl tétrazolium (TTC), la ligature de l'artère interventriculaire antérieure peut être confirmée par l'observation de blanchiment d'distale de tissu myocardique à la suture ainsi que le dysfonctionnement de la paroi antérieure. Reperfusion peut être vérifiée par le retour de la couleur rouge pour le tissu myocardique et la démonstration d'une certaine rep...
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Discussion
Modèles d'ischémie-reperfusion du myocarde de souris sont une méthode efficace pour la recherche cardiovasculaire de simuler une maladie cardiaque aiguë ou chronique clinique 13,14. Des efforts importants ont été utilisée pour développer et affiner les approches chirurgicales qui produisent les événements ischémiques et des lésions de reperfusion dans les coeurs de plusieurs types d'animaux différents. Bien qu'il existe des avantages particuliers à l'utilisation de différents systèmes d'an...
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Déclarations de divulgation
Dr Noah Weisleder est un fondateur et directeur scientifique de TRIM-édecine, Inc.
Remerciements
Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national de l'arthrite et de l'appareil locomoteur et de Skin Diseases, une partie des Instituts nationaux de la santé, en vertu Prix Nombre R01-AR063084. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| PhysioSuite avec RightTemp Réchauffement Homéothermique | Kent Scientific Corp | PS-RT | |
| Source lumineuse | Zeiss | KL 1500 Souris LCD | |
| Heart Slicer Matrix | Zivic Miller | HSMS001-1 | |
| Micro Tray - Base, Couvercle, & Tapis (6,0 x 10 x 0,75) | Outils scientifiques fins | 6100A | |
| Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium | Sigma Aldrich | T8877 | |
| Buprénorphine (Buprenex injectable) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| bupivacaïne | Hospira | NDC 0409-1163-01 | |
| Isoflurane | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| Bétadine Soultion ; | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Troponine cardiaque de souris T(cTnT) ELISA | Kamiya Biomedical Company | KT-58997 | |
| Ciseaux fins | Outils scientifiques fins | 14040-10 | |
| Dumont #5 Forceps | Outils scientifiques fins | 11251-30 | |
| Dumont #3 Pinces | Outils scientifiques fins | 11231-30 | |
| Castroviejo Micro Porte-aiguilles | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Porte-aiguille allongé mince | Outils de science fine | 12005-15 | |
| Porte-aiguille à poignée ronde | Outils de science fine | 12075-12 | |
| Stéréoscope trinoculaire Omano | Microscope.com | OM99-V6 | |
| SB2 Support de perche avec bras universel | Microscope.com | V6 | |
| , 0,5 mm, 1/16 po Y | Kent Scientific Corp | RSP05T16 | |
| Systèmes d’anesthésie pour rongeurs et petits animaux | VetEquip, Inc | 901807 | |
| 4-0 suture conique en soie | Sharpoint&trade ; Produits | DC-2515N | |
| 6-0 soie cône suture | Sharpoint&trade ; Produits | DC-2150N |
Références
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Réimpressions et autorisations
