Cellule étiquetage et l'injection dans le développement embryonnaires coeurs de souris

Résumé

Nous décrivons une série de méthodes pour injecter des colorants, des vecteurs d'ADN, des virus et des cellules, afin de contrôler à la fois le destin des cellules et le phénotype des cellules endogènes et greffés dérivés de cellules embryonnaires ou pluripotentes à l'intérieur des embryons de souris au jour embryonnaire (E) de 9,5 et les étapes ultérieures de développement.

Résumé

Test du sort des souches cellulaires dérivés embryonnaires pluripotentes ou dans les protocoles in vitro a conduit à des résultats controversés qui ne reflètent pas nécessairement leur potentiel in vivo. De préférence, ces cellules doivent être placées dans un environnement approprié embryonnaire afin d'acquérir leur phénotype défini. En outre, la lignée cellulaire de traçage études chez la souris après marquage des cellules avec des colorants ou des vecteurs rétroviraux est resté la plupart du temps limitée à des embryons de souris à un stade précoce avec les organes encore peu développées. Pour surmonter ces limitations, nous avons conçu des protocoles de micro-injection standard et échographie médiation pour injecter différents agents dans les régions ciblées du cœur dans des embryons de souris à E9.5 et stades de développement. Explants ou embryons embryonnaires sont ensuite cultivées ou à gauche pour développer in utero. Ces agents comprennent des colorants fluorescents, des virus, des shRNA ou des cellules souches progénitrices dérivées de cellules. Nos approches permettent la préservation de la function de l'organe tout en surveillant la migration et le devenir des cellules marquées et / ou injectées. Ces technologies peuvent être étendues à d'autres organes et seront très utiles pour aborder des questions biologiques clés en biologie du développement.

Introduction

Il ya plus d'une décennie, les cellules souches embryonnaires humaines (HuESCs) ont été obtenues à partir de blastocystes humains ^1. Depuis lors, ces cellules ont fait l'objet d'un important domaine de recherche qui porte sur des questions non satisfaits en biologie du développement humain. HuESCs ont en outre fourni des espoirs en médecine régénérative. Au cours des dernières années, les cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) ont été générés à partir de cellules somatiques du patient spécifique, en fournissant des modèles de maladie génétique ^2. Beaucoup dans les protocoles in vitro pour la différenciation des cellules souches pluripotentes embryonnaires ou induites vers différentes lignées cellulaires, y compris les lignées de coeur ^3, ont été rapportés. Les cellules différenciées sont souvent phénotypées par analyse de l'ARN et l'expression de la protéine, une immunocoloration, et / ou dans des tests fonctionnels in vitro. Cependant, les dérivés pluripotent de cellules souches doivent être placées dans un environnement approprié embryonnaire afin de vérifier si elles acquièrent entièrement la cell sort de leurs homologues embryonnaires et si ils récapitulent la véritable fonction in vivo en réponse à des signaux régionaux. Alors que l'ingénierie tissulaire est prometteuse, elle ne fournit pas encore tous les repères connus et inconnus de la bonne in vivo développement des tissus embryonnaires ^4,5.

étiquetage portable avec des colorants ou des vecteurs rétroviraux dans les embryons, y compris les embryons de souris, ont apporté des informations importantes sur l'origine embryonnaire des lignées de cellules au cours du développement cardiaque ^6. Par exemple, la teinture injection dans l'espace péricardique d'embryons de souris ex vivo, suivie par la culture in vitro des coeurs isolés, a été utilisé pour marquer des cellules épicardiques et leurs descendants ^7. Cependant, colorant et l'étiquetage des cellules rétroviral ont été principalement appliqué à des embryons de souris au début avec les organes encore peu développés, ou des embryons de poulet, qui sont plus facilement accessibles ^8. Une exception est le cerveau, ce qui est plus facile à une cible dans l'embryos ^9,10. Une telle approche n'a pas encore été appliquée au coeur de la souris embryonnaire battre.

Pour compléter l'étiquetage direct avec des colorants ou des virus et d'effectuer le suivi dans la lignée des embryons plus avancés de souris de scène et de souris adultes, l'approche de marquage des cellules a été associée à l'analyse de souris transgéniques à l'aide de la technologie Cre / Lox. L'approche Cre / Lox ¹¹ dispose cependant quelques limitations dues à la spécificité spatio-temporelle des régions régulatrices génomiques utilisés pour diriger l'expression de la recombinase, et l'efficacité de la recombinaison Cre / Lox ^12. En outre, cette approche ne répond pas pleinement aux questions spécifiques d'acquisition axée sur la migration des cellules du destin cellulaire, car il ne peut marquer un précurseur après activation de la région régulatrice utilisée pour conduire l'expression Cre. Il peut également ne s'applique pas aux embryons humains à des questions éthiques évidentes.

Compte tenu de ces limitations, nous avons conçu une série de nouveaux protocoles pour injecter une variété d'agents de marquage de cellules tels que des colorants fluorescents, des virus, des modulateurs de l'expression génique tels que des shRNA et des vecteurs d'étiquetage de la cellule à base d'ADN, ou des cellules dans l'embryon de souris à E9.5 et des stades ultérieurs de développement dans les régions ciblées de l' cœur.

Les injections d'ADN / cellulaires utilisent une loupe binoculaire et un dispositif de micro-injection simple combinée avec la culture ex vivo embryon jusqu'à 48 h, ou le cœur isolé ou de la culture des explants embryonnaires pendant 48-72 h. Nous présentons également un protocole de micro-injection ultrasons médiation dans les coeurs de souris embryonnaires in utero. Cette technique permet de suivre l'évolution des embryons ¹³ et permet à long terme de suivi des injectates et / ou des cellules marquées.

Nous avons constaté que ces approches préservent la fonction de l'organe et fournissent un environnement plus représentatif de l'essai in vitro du potentiel des cellules souches. Il offre également la possibilité de suivre la migrationde marqué et / ou injecté des cellules de contrôler leur destin. En fin de compte, ce qui devrait donner une meilleure compréhension de la structuration du tissu régional et processus biologiques essentiels.

Protocole

1. Préparation

procédures animales

Obtenir l'approbation d'un comité d'éthique animale et suivre les directives institutionnelles pour le travail avec le virus, HuESC et / ou iPSC (le cas échéant) la manipulation de la souris, ainsi que, l'obtention d'embryons de souris, et effectuer une chirurgie de la souris. Pour les accouplements heures, le jour de la fiche est considéré comme le jour embryonnaire (E) 0,5 / 0,5 jours post-coït.

1. les aiguilles de microinjection:
   Ex utero microinjection, tirer des pipettes en verre (tubes diamètre borosilicate capillaires externes 1,2 mm) à l'aide d'un extracteur de pipette / biseauteur pour obtenir une um de diamètre de pointe interne 1 ou 10 et une forme pointue et conique pointe à injecter de l'ADN ou des cellules, respectivement. Pour les injections d'échographie médiation, l'utilisation adaptée des aiguilles stériles, ayant un diamètre extérieur / intérieur (OD / ID) de 1,14 mm mm/0.53, avec une pointe 50/35 um OD / ID.
2. Des boîtes de Petri remplies de silicium:
   Préparer le silicium, comme décrit dans le manuel. Remplirune boîte de Petri d'un diamètre de verre propre de 60 mm avec une couche d'élastomère d'environ 1 cm. Éviter les bulles d'air.
3. Instruments:
   Gardez tous les instruments chirurgicaux stériles avant et pendant la procédure.
4. préparation d'ADN:
   Ajouter 3 pg d'ADN et 12 pi Opti-MEM dans un tube. Ajouter 3 pi Lipofectamine 2000 et 12 pi Opti-MEM dans un autre tube. Incuber pendant 5 min à température ambiante et mélanger les deux solutions. Utiliser immédiatement.
5. Préparation des cellules:
   Préparer une suspension de 10 ⁶ cellules / ml de DMEM (milieu de Eagle de Dulbecco, haute teneur en glucose et du sérum de rat à 50%). 50 ul de la suspension cellulaire finale est suffisant pour 8 à 10 embryons.
6. Teindre préparation:
   Utilisez le fluorescente verte CDCFDA-SE à 25 mg / ml de DMSO. Préparer 20 aliquotes et conserver à -20 ° C. Diluer 1:100 / 1:200 dans une solution saline stérile ou STP avant l'utilisation.
7. préparation de virus:
   Utilisez une PGK-GFP exprimant lentivirus 3 ^e génération commercial avec un titre de 10 ~ ⁹ -10 ¹⁰ transducing unités / ml de DMEM. Pour la préparation des lentivirus, voir Tiscornia et al. ¹⁴ Porter un équipement de protection individuelle et utiliser en toute sécurité et éliminer le virus.

2. Collection de E9.5 et E10.5 embryons pour Ex vivo Injection

1. Euthanasier une souris enceinte au jour embryonnaire 9.5 ou 10.5.
2. Stériliser la poitrine et l'abdomen de la souris avec 70% d'éthanol.
3. Faire une incision médiane ventrale pour ouvrir l'abdomen et récupérer la corne utérine à la température ambiante dans du PBS et le transférer après deux lavages PBS pour un plat de silicone remplie de Pétri avec un milieu M16.
4. Epingler la corne utérine avec des épingles insectes à la couche de silicone de sorte que le côté vascularisée de l'utérus est en bas.
5. Couper la surface de l'utérus avec une pince fine, et un plafond de la caduque à 1 mm en dessous de la surface.
6. Retirer délicatement l'embryon dans le sac jaune en étalant les murs de la caduque.
7. Stocker les embryons à 37 °; C en milieu M16 avant l'injection des cellules. Pour l'injection, chaque embryon est transféré dans le moule en silicone remplie de milieu M16 pré-chauffé à 37 ° C.

3. L'ADN cellulaire ou injection sous un stéréomicroscope

1. Remplir la pipette de verre à l'arrière avec une seringue Hamilton et secouer la pipette pour éliminer les bulles à la pointe.
2. Régler la pipette sur le support de la micro-injection; régler la pression de maintien à 50 (ADN) ou 30 (cellules) hPa, et la pression d'injection de 150 (ADN) et 300 (cellules) hPa. Réglez l'heure de l'injection de 0,2 sec (ADN) ou 0,5 sec (cellules). Ces paramètres peuvent varier légèrement en fonction du type de micro-injecteur et la pipette.
3. Pin de l'embryon vers le bas de silicone à travers le sac vitellin, sans toucher l'embryon approprié. Regarder la région du cœur et ouvrir le sac juste au-dessus de cette région.
4. Ajouter 4 broches autour de l'embryon pour empêcher tout mouvement pendant l'injection des cellules.
5. Utilisation du micromanipulateur (mis à manuel), slowly la position de la pointe de la pipette à un angle de 45 ° au-dessus du péricarde, juste au-dessus de la région du coeur qui doit être injecté (figure 1).
6. Déplacer la pipette dans la région d'intérêt et de déclencher l'injection. Prenez la pipette aussi rapidement que possible. Assurez-vous que le coeur est bien battre après injection d'ADN / cellule.

4. L'embryon, le coeur isolé, et Explantation Culture

1. Culture des embryons E9.5 à 25% de milieu M2 et du sérum de rat à 75%, supplémenté avec de la pénicilline / streptomycine, pré-chauffé à 37 ° C et oxygénée avec 40% d'O _2.
2. Ajouter 2 ml de milieu de culture dans un tube en verre de 25 ml, ajouter doucement l'embryon, et oxygéné avec 40% O ₂ avant de visser le bouchon sur le tube. Incuber jusqu'à 36 heures à 37 ° C tout en faisant tourner ou en agitant (30 tours / min).
3. Au point de temps désirée (par exemple 24 heures), disséquer le cœur avec soin pinces fines, sans toucher les cœurs, d'abord decapitating les embryons; le cœur est facile à accise en le tirant à l'aide de la voie d'éjection distale.
4. Culture du coeur isolé pour un autre 36-48 heures dans du DMEM avec 50% de FCS sur un insert Matrigel revêtu mettre dans une plaque de 12 puits. Voir Dyer et Patterson (2013) pour un protocole amélioré de la culture du cœur ^15.
5. Faire aucune explant de la région d'intérêt. A titre d'exemple, disséquer le canal auriculo-ventriculaire (AVC) et de la culture pendant 48 h sur le collagène de type 1 de ¹⁶ gel.

5. Injection guidée par échographie dans le coeur je n utero

1. Configuration de la machine à ultrasons et micro-injecteur:
   1. Utilisez le système d'échographie à haute résolution avec un transducteur de 40 MHz et installation de micro-injection sur un rail.
   2. Réglez le volume d'injection sur le micro-injecteur à 69 nl par injection. Consultez le manuel de micro-injection du fabricant pour la programmation du micro-injecteur.
2. Préparation de la microiconfiguration njection et injection:
   1. Placer une micropipette de verre dans le micro-injecteur. Pour assurer l'efficacité d'injection, la première couche du côté intérieur de la pipette avec de l'huile minérale par aspiration jusqu'au volume maximum. Puis éjecter l'huile à nouveau, laissant 1-2 mm d'huile dans l'aiguille.
   2. Aspirer le produit à injecter jusqu'à volume maximum est atteint. Veillez à ne pas toucher les surfaces avec la pointe de l'aiguille car cela émousser la pointe et faire une injection plus difficile.
   3. Pour stabiliser la corne utérine contenant les embryons lors de l'injection, utiliser un plat modifié Petri avec un trou au milieu (2,5 cm de diamètre), recouverte d'une membrane de silicone mince avec une petite fente découpée dans le centre, et le positionner au-dessus du site d'incision . Stabiliser la boîte de Pétri sur la table de manipulation de la souris en plaçant 3-4 touffes d'argile sous les bords de la coupelle.
3. procédure d'injection:
   1. Raser l'abdomen d'une souris enceinte (au stade embryonnaire désiré) avant anesthésiesie pour enlever les poils. Traiter l'abdomen avec un agent de l'épilation chimique pour enlever les poils résiduelle et stériliser à 70% d'éthanol.
   2. Anesthésier une souris enceinte avec de l'oxygène / isoflurane via un masque facial. Utilisation 3-5% d'isoflurane dans de l'oxygène à 100% pendant l'anesthésie initiale, suivie par de 1 à 1,5% pendant le reste de la procédure. Assurez-vous que la souris est correctement anesthésié en pinçant doucement ses pattes et / ou la queue.
   3. Placez le décubitus dorsal de la souris sur la table de manipulation de la souris (mis à chauffer à 37 ° C) et couvrir les yeux avec un lubrifiant pour éviter la déshydratation de la cornée.
   4. Appliquer le gel d'électrode sur les électrodes et collez les pattes aux électrodes pour surveiller le rythme cardiaque, le rythme respiratoire, et l'ECG. Positionner un thermomètre rectal pour surveiller la température du corps.
   5. Vérifiez d'abord que la souris est enceinte en visualisant et en comptant les embryons par ultrasons. Appliquer un gel à ultrasons sur l'abdomen et positionner la tête de balayage au-dessus de la vessie. Par souci de cohérence, de visualiser la vessie premier,et compter les embryons in gauche et droite cornes utérines, à partir de la position de la vessie. Veiller à ce que les cœurs embryonnaires battent normalement.
   6. Si la souris est enceinte, placez la boîte de Pétri au-dessus du futur site de l'incision avec de l'argile. Appuyez sur le plat légèrement sur l'abdomen ainsi que le plat est en contact direct.
   7. Retirer le plat et stériliser à nouveau l'abdomen. Faire une incision médiane ventrale 1,5-2 cm, environ 0,75-1 cm au-dessus du vagin, d'ouvrir l'abdomen et du péritoine. Éviter les blessures aux organes internes.
   8. Extérioriser la gauche ou la corne utérine droite avec une pince, tirez-le doucement à travers la membrane de silicium du plat, et de stabiliser le plat sur la terre battue de nouveau. Empêcher vaste tirant ou manipulation, car cela peut provoquer des saignements des vaisseaux utérins et la mort prématurée de la femme et / ou d'embryons.
   9. Compter les embryons de nouveau pour assurer la tenue de dossiers adéquate des embryons qui ont été injectés.
   10. Appliquer le gel d'ultrasons sur le uterine cornes à l'image du cœur et pour prévenir la déshydratation.
   11. L'image du premier embryon à injecter. Vérifiez battement normal du coeur embryonnaire et tenir des registres de l'orientation crânio-caudale et gauche-droite de l'embryon. Si nécessaire, repositionner la corne utérine légèrement pour assurer une orientation correcte. Si cela s'avère difficile, passer à la prochaine embryon.
   12. Perforer l'utérus soigneusement avec l'aiguille de micro-injection pour positionner l'aiguille à un angle de 45 ° au-dessus de l'embryon, légèrement en dehors du péricarde (Figure 3). Pour l'étiquetage des cellules épicardiques, l'image du coeur en vue de quatre chambre et positionner l'aiguille de sorte qu'il pointe vers la gorge auriculo-ventriculaire (Figure 3). Si l'angle doit être ajusté, retirez l'aiguille, et repositionner. Ne pas ajuster l'angle de l'aiguille dans l'utérus, ce qui risque de casser l'aiguille. Éviter de percer d'autres tissus, tels que les membres ou le placenta.
   13. Déplacer l'aiguillesur la paroi péricardique et percer avec un mouvement doux, mais rapide. En général, il y aura une certaine résistance, mais le déplacement de l'aiguille trop rapide peut provoquer la pointe de l'aiguille à percer le cœur lui-même. La pointe devrait se retrouver dans l'espace péricardique de la gorge auriculo-ventriculaire. Dans le cas d'une hémorragie péricardique, les globules sera visible en tant que motif de neige comme le blanc. Si c'est le cas, arrêtez l'injection de l'embryon et de passer à un autre embryon.
   14. Injecter le produit à injecter. Injecter au maximum 700 nl dans l'espace péricardique pour éviter l'effet négatif sur le développement de coeurs. Surveillance de l'injection proprement dite par une légère enflure, temporelle du péricarde.
   15. Après l'injection, retirez l'aiguille et confirment que le produit à injecter peut encore être éjecté de s'assurer que l'aiguille n'a pas été bouché par des fragments de tissus.
   16. Repositionner la table de manipulation de l'image et injecter la prochaine embryon. Maintenir le nombre d'embryons injectés au maximum à 3-4 (dans une corne utérine) pour empêcherétendu l'anesthésie, pour permettre embryons de contrôle dans la corne utérine opposée, et de veiller à ce que la procédure n'a pas perturbé le développement embryonnaire.
   17. Après l'injection le nombre désiré d'embryons, éliminer le gel échographique excès et placez doucement la corne utérine dans l'abdomen dans sa position correcte.
   18. Fermer l'abdomen de la mère à l'aide d'une couche de fil de suture pour le péritoine et les muscles abdominaux, et une seconde couche de fil de suture à la peau.
   19. Injecter la souris avec la première dose de médicaments contre la douleur. Utilisez une injection de 0,05-0,1 mg / kg buprénorphine 15 minutes avant de mettre fin à l'anesthésie et trois injections supplémentaires avec des intervalles de 12 h.
   20. Cesser l'anesthésie et surveiller la souris pour la récupération adéquate de la procédure. Maison de la souris enceinte dans une cage individuelle pour la durée souhaitée de suivi.

Résultats

En utilisant les protocoles d'injection décrites ci-dessus, les cellules peuvent être marquées et / ou injectées dans le cœur de souris embryonnaires. Comme preuve de concept, plusieurs exemples sont présentés dans lequel le protocole d'injection et ex vivo AVC explant, coeur isolé, ou la culture d'embryons ont été combinées ensemble (figure 1).

La figure 1 montre la préparation de l'embryon avant l'injection des cellules. L'embryon de E9.5 est reti...

Discussion

Les ex vivo protocoles d'injection intra-cardiaques décrits ci-dessus sont conçus pour préserver la fonction myocardique pendant au moins 48 heures à la mi-étape (E9.5-E11.5) des embryons de souris. Ces approches permettent d'injection pour l'injection dans l'espace ciblée de l'ADN ou des cellules. Les quelques exemples présentés dans les figures 1-3 fournissent une preuve de concept pour délimiter ex vivo et in vivo des mécanismes moléculaires des processus de déve...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Setups/Hardware
40 MHz Transducteur	VisualSonics	MS550S
Microinjecteur	VisualSonics
Microinjecteur	Eppendorf	5242
Micromanipulateur  ;	Eppendorf	5171
Azote			nécessaire à la pressurisation de l’injecteur
Système de rail	Rotateur
	pour faire pivoter un tube de verre avec des embryons à l’intérieur de l’incubateur
			C
stéréomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Tubes capillaires en borosilicate	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-&mu ; m diamètre extérieur
Extracteur de pipette	Sutter	Modèle P87
Aiguilles de micro-injection	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1,14 mm/53 mm, avec 50/35 &mu ; seringues Hamilton à embout OD/ID
;
Boîtes			10 cm de diamètre
Huile minérale	Sigma	M8410
Membrane en silicone	Visualsonics		4,3 x 4,3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet Un
épilatoire	Nair
(Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Gel à ultrasons	Aquasonic
		NDC 12496-0757-1	0,05-0,1 mg/kg dans une solution saline
Autre
Élastomère de silicone	Dow Corning	Sylgard 184
Pétridishes en verre	Outils scientifiques		60 mm de diamètre
	Outils < sciences fines	26002-20strong
>Milieux et réactifs de culture
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco' s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	glycémie élevée et sérum de rat à 50 %
M16 medium	Sigma	M7292
sérum pour rat	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycine	Life Technologies	15140-12
oxygène 40 %	Liquide		d’air nécessaire pour oxygéner le milieu de culture embryonnaire
Sérum de	veau fœtalFisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagène de type I	BD	354236	à enrober les boîtes de culture pour culture d’explants
Boîtes de culture	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Sondes moléculaires	C1165	25 mg/ml de DMSO. Conserver à -20 ° ;C. Diluer 1:100-200 dans une solution saline avant utilisation.
Lentivirus exprimant PGK-GFP  ;			~8E9 unités de transduction/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019