Génération efficace d'origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

Résumé

Ici, nous vous présentons notre méthode établie pour reprogrammer des cellules somatiques humaines dans CSPi humaines sans transgène avec le virus de Sendai, qui montre des résultats cohérents et une efficacité accrues.

Résumé

Il ya quelques années, la mise en place de cellules souches pluripotentes humaines induites (CISP) a inauguré une nouvelle ère dans le domaine biomédical. Les usages potentiels des CSPi humaines comprennent la modélisation pathogenèse des maladies génétiques humaines, la thérapie cellulaire autologue après la correction de gène, et le dépistage des drogues personnalisé en fournissant une source de cellules pertinentes et des symptômes spécifiques du patient. Cependant, il existe de nombreux obstacles à surmonter, par exemple en éliminant le facteur de reprogrammation expression transgène qui reste après la production de iPSCs humains. Plus important encore, l'expression du transgène résiduelle dans CSPi humaines indifférenciées pourrait entraver différenciations propres et égarer l'interprétation de la maladie pertinents dans les phénotypes in vitro. Avec cette raison, sans l'intégration et / ou CSPi humaines libre transgènes ont été développés en utilisant plusieurs méthodes, telles que l'adénovirus, le système de piggyBac, vecteur minicercle, vecteurs épisomiques, la livraison directe des protéines et la synthèse de l'ARNm. Cependant, l'efficacité de reprogramming utilisant des méthodes sans rapprochement est très faible dans la plupart des cas.

Ici, nous présentons une méthode pour isoler CSPi humaines en utilisant Sendai-virus (virus à ARN) du système de reprogrammation base. Cette méthode de reprogrammation montre des résultats cohérents et de haute efficacité de manière rentable.

Introduction

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont une capacité d'auto-renouvellement in vitro et ont pluripotence, qui pourrait être potentiellement utile pour la modélisation de la maladie, pour le criblage de médicaments, et de développer des thérapies à base de cellules pour traiter les maladies et les blessures des tissus. Toutefois, les CSEh ont une limitation pour la thérapie de remplacement de la cellule en raison de barrières immunologiques, oncologiques et éthiques, et à étudier les gènes liés à la maladie, les CSEh spécifiques à la maladie ont pu être isolés par diagnostic pré-implantatoire génétique (DPI) des approches, mais il est encore techniquement difficile et les dons d'embryons sont assez rares. Ces problèmes sont liés au progrès de la biologie des cellules souches, ce qui a conduit à la mise au point de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs).

CSPi humaines sont génétiquement reprogrammées à partir de cellules somatiques humaines adultes et abritent souches caractéristiques de cellules pluripotentes comme similaires à CSEh, qui les rend une source utile pour la médecine régénérative, comme ddécouverte de tapis, la modélisation des maladies et de thérapie cellulaire chez un patient spécifique de manière ^1,2.

Jusqu'à présent, il existe plusieurs méthodes pour générer des CSPi humaines, y compris le virus médiation (rétrovirus et adénovirus) ^3, non-virus médiation (système de BAC et les vecteurs de transfection) ⁴ transductions de gènes et de protéines système de livraison ^5-7.

Même si une livraison de gènes du virus médiée peut assurer un certain niveau d'efficacité, des vecteurs viraux peuvent laisser l'empreinte génétique, car ils s'intègrent dans les chromosomes de l'hôte pour exprimer des gènes de reprogrammation d'une manière incontrôlée. Même lorsque l'intégration virale de facteurs de transcription peut activer ou inactiver les gènes de l'hôte ^8, il peut provoquer une aberration génétique inattendu et le risque de tumorigenèse ^5,9. D'autre part, l'introduction directe de protéines ou d'ARN dans les cellules somatiques ont été rapportés, mais ils ont quelques inconvénients tels que main-d'œuvre, transf répétéeection, et le faible niveau de la reprogrammation de ^7,10. Même adénovirus épisomique et sans intégration, virus adéno-associés, et les vecteurs plasmidiques sont encore relativement moins efficace ^11. Pour ces raisons, il est plausible de choisir non-intégration des méthodes de reprogrammation avec une grande efficacité de la production iPSC et moins d'anomalies génétiques. Dans cette étude, nous utilisons une reprogrammation base Sendai-virus. Ce procédé est connu pour être non-intégrés dans le génome de l'hôte et produit constamment iPSCs humains sans intégration du transgène.

Protocole

1. Préparation de la cellule et des médias (Jour 1)

1. Culture et élargir fibroblastes humains avec du milieu DMEM contenant 10% de FBS.
2. Plate fibroblastes humains (figure 1) sur une plaque de 24 puits à la densité appropriée pour bien le jour avant la transduction.
   REMARQUE: Les dilutions en série suivantes sont recommandées (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K et 6.25K) parce que différents types de cellules ont la capacité de fixation différents.
3. Incuber les cellules pour un jour de plus dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur, assurant que les cellules ont pleinement adhéré et étendu.

2. Effectuer transduction (Jour 2)

1. Le jour de la transduction, vérifier la densité cellulaire et choisir les plus efficaces puits de la densité (figure 2). Il est préférable de choisir trois densités différentes: haute (80 ~ 90%), moyen (50 ~ 70%) et faible (20 ~ 40%).
2. Au moins 1 heure avant la transduction, aspirer le fibroblmédias ast des cellules et modifier nouveaux 300 pi de milieu de fibroblastes.
3. Supprimer un jeu de 4 différents tubes de virus Sendai de -80 ° C stockage. Décongeler chaque tube en même temps dans un bain-marie à 37 ° pendant quelques secondes, puis prendre les tubes à partir du bain d'eau. Après cela, les décongeler à la température ambiante; tubes de centrifugation à 6000 g pendant 10 secondes et les placer sur la glace jusqu'à utilisation. Ne pas réutiliser gel et de dégel du virus depuis les titres ne seront pas maintenir.
4. Ajouter les volumes de chacun des quatre tubes de virus Sendai (Oct-4, Klf-4, c-Myc et Sox-2) indiquées au tube de micro-centrifugeuse. Assurez-vous que la solution est bien mélangée par pipetage.
   Par exemple, si 50K cellules / un puits de 24 puits plaque lookwell pour la transduction:
   (Titre basé sur le certificat d'analyse de Life Technologies, peut être différent d'un lot à)
   Tube hOct-4 = 6,0 x 10 ⁷ SDI, 3 MOI = 5 pi
   Tube hSox-2 = 6,5 x 10 ⁷ SDI, 3 MOI = 4,6 μ; L
   Tube hKlf-4 = 6,3 x 10 ⁷ SDI, 3 MOI = 4,8 pi
   Tube hc-Myc = 7,8 x 10 ⁷ SDI, 3 MOI = 3,8 pi
   Total = 18.2 pi de quatre facteurs de virus mélange / un puits (50K cellules) de la plaque de 24 puits
5. Selon les densités cellulaires; ajouter 2X, 1X, 0,5 X et le volume du mélange de virus dans le puits. Secouer doucement le devant de la plaque à l'arrière, à gauche et à droite (2X: 36,4 pi de mélange de virus, 1X: 18,2 pi et 0.5X: 9,1 pi).
6. Placer les cellules dans un 37 ° C, 5% CO ₂ incubateur et incuber pendant une nuit.

3. Remplacement du milieu de culture (Jour 3 & Jour 5)

1. 24 heures après la transduction, remplacer le milieu avec 500 moyen de fibroblastes ul frais.
2. Le jour 5, changement de milieu avec les médias des fibroblastes frais.

4. Préparer des plats du MEF pour la co-culture (Jour 8)

1. Préparer les cellules MEF dans 60 boîtes de culture mm avec 10% de FBS contenait un milieu DMEM day repiquer avant le fibroblaste transduit sur cellules nourricières du MEF.
   Remarque: Nous utilisons 5 x 10 ⁵ MEF dans chaque boîte de 60 mm.

5. Démarrer co-culture de cellules transduites avec des cellules nourricières du MEF (Jour 9)

1. Avant étalement des cellules transduites, aspirer 10% de FBS contenait milieu DMEM de plats d'alimentation du MEF et ajouter frais 10% de FBS contenait milieu DMEM.
2. Supprimer le milieu à partir des fibroblastes qui sont transduites dans la plaque à 24 puits et laver les cellules une fois avec du D-PBS. Ajouter 200 ul de 0,25% de trypsine / EDTA dans les cellules de fibroblastes inThe plaque de 24 puits. Après moins de 5 minutes d'incubation avec de la trypsine / EDTA, lorsque les cellules commencent à se détacher de la plaque, de recueillir les cellules avec un milieu de croissance dans 15 ml de tube conique. Puis centrifuger les dans 6000 g pendant 4 min.
   REMARQUE: La mise en commun 2X, 1X, 0.5X et virus fibroblastes transduction est recommandé.
3. Retirez le milieu surnageant et laver à remettre en suspensionle culot cellulaire avec 5.4 ml de milieu de fibroblastes frais pour la neutralisation de la trypsine. Puis centrifuger à 135 xg les pendant 4 min.
4. Cellules de la plaque que la densité de dilution en série et commencer à co-culture avec des milieux de fibroblastes sur MEF: telle que 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 et 1/128 par 60 plat mm. Selon le taux de mort cellulaire au cours de la première semaine de la transduction, on ne peut pas besoin de diluer à 1/2 ou 1/128 densité. Mettez de côté les cellules restantes pour extraire l'ARN total comme un contrôle positif pour Transgene RT-PCR.
5. Placer des boîtes de 60 mm à 37 ° C, 5% CO ₂ incubateur pendant une nuit.

6. Flux cellules souches embryonnaires humaines à moyen et surveiller les cellules (Jour 10)

1. Le lendemain, changer de support fibroblastes aux médias ES humain avec 10 uM Y-27632. Après cela, changer moyen quotidien avec le milieu ES humain: 800 ml de DMEM/F12 + 200 ml Sérum de remplacement Knockout + 10 ml de L-Glutamine + 10 ml de 10 mM de MEM acides aminés non essentiels minimaux+ 1 ml de 2-mercaptoéthanol + 10 ng / ml de facteur de croissance basique des fibroblastes.
2. Faire un changement quotidien des médias avec les médias de nouvelles souches embryonnaires humaines. Après une semaine, vérifiez les plats une fois par 2 ~ 3 jours sous un microscope pour la formation d'amas de cellules ES colonies comme. Selon le type de cellule, la culture aura plus ou moins de temps avant colonies se trouvent.

7. Cueillette de la souches pluripotentes induites colonies cellulaires et Développer les cellules (Jour 20 ~)

1. Trois semaines après la transduction, les colonies doivent apparaître grandi bien pour la cueillette.
2. La veille de la cueillette des colonies, préparer MEF alimentation en plaque de 24 puits.
   NOTE: Nous utilisons 12,5 x 10 ⁵ MEF dans une plaque de 24 puits.
3. Le lendemain, changement de milieu de plats MEF de médias de fibroblastes de médias ES humain avec 10 uM Y-27632. Choisir manuellement une colonie à chaque fois sous le microscope dans la cueillette de capot et faire des petits bouquets de pipetage et de les transférersur fraîchement préparée MEF dishes.Try de choisir plusieurs clones.
4. Passage et développer chaque puits d'une plaque de 24 puits à une plaque à 6 puits initialement. Ensuite, à partir d'une plaque à 6 puits à une boîtes de 60 mm avant la propagation ultérieure.

8. Caractérisation des iPSCs humain (après 10 passages)

1. Immunofluorescence
   1. Plaque CSPi humaines dans la plaque et de la culture de 24 puits pendant 4-5 jours avec changement de support quotidienne.
   2. Pour commencer immunofluorescence, laver la plaque avec le D-PBS fois. Puis fixer les cellules immédiatement dans 0,4% de paraformaldéhyde pendant 30 min. Après que les laver trois fois dans du D-PBS pendant 5 min.
   3. Traiter les cellules fixées avec 0,1% de Triton X-100 solution dans du PBS pendant 15 min à température ambiante.
   4. Aspirer la solution de permeablization (0,1% triton X-100 solution), puis ajouter une solution à 0,5% de blocage de BSA pendant 1 heure à température ambiante.
   5. Effectuer une détection de Nanog, Oct-4, l'AESS (Antig embryonnaire spécifique au stadefr) et TRA-1-81 (antigène de rejet tumoral) en utilisant un anticorps anti-humain dans une solution de BSA à 0,5% (consulter le tableau matière de taux de dilution d'anticorps). Incuber l'anticorps primaire pendant 2 heures à température ambiante. Puis laver trois fois dans D-PBS pendant 5 min chacun.
   6. Vérifier en utilisant la microscopie de fluorescence, après 1 h d'incubation avec Alexa Fluor 488 anticorps IgG de chèvre anti-souris comme 2 ^ème anticorps, qui sont dilué 1:2000 dans une solution de BSA à 0,5% à la température ambiante. Colorer tous les noyaux de chacune des cellules nourricières du MEF et hiPSCs avec DAPI.
2. RT-PCR de Transgene Confirmation
   1. Extrait ARNm total de culot cellulaire en utilisant des réactifs d'extraction d'ARN.
   2. Faire une transcription inverse sur aliquotes (1 pg) de l'ARN total et l'ADNc résultant pour l'amplification PCR par transcriptase inverse.
   3. Préparer les mélanges de PCR pour contenir 2 pi de matrice d'ADNc, 10 pi de 2X PCR Master Mix, 2 pi de 2 pmol d'amorces(Avant: 1 pl et inverser: 1 pi) et 6 pi de DW. Pour détecter l'expression des gènes, faire la RT-PCR avec les amorces énumérées dans le tableau 1.
   4. Effectuer la RT-PCR avec le gène de la GAPDH comme contrôle pour l'efficacité des réactions d'amplification. Visualiser et analyser le produit de PCR par électrophorèse sur agarose-gel 1%.

Résultats

Habituellement fibroblastes infectés ne présentent pas de changements morphologiques dans plusieurs jours après la transduction du virus Sendai, mais cinq jours plus tard, ils commencent à avoir des formes différentes (Figure 1). Comme décrit dans un panneau de droite de la figure 1, les cellules n'ont pas la morphologie des fibroblastes typique plus. Ils ont une forme ronde et grand noyau de cytoplasme. Même lorsque la transduction est réalisée dans 80% de confluence cellulaire, on dir...

Discussion

Reprogrammation des cellules somatiques humaines à hiPSCs détient promesses sans précédent dans la biologie fondamentale, la médecine personnelle, et la transplantation ^12. Auparavant, les générations iPSC humaines requises virus à ADN qui a un risque d'intégration dans le génome de l'hôte, ce qui peut créer des mutations génétiques indésirables qui limitent d'autres applications cliniques telles que le développement de médicaments et de thérapies de transplantation ^13. Avec cette raiso...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit de reprogrammation CytoTune-iPS	Invitrogen	A1378002
CF-6, MEF, résistant à la néomycine, traité à la mitomycine C	Tige globale	GSC-6105M	5 x 105/6 cm ou 12,5 x 105/24 puits
Trypsine EDTA 0,25 % Trypsine avec EDTA 4Na 1X	Invitrogen	25200114
DMEM/F-12 moyen	Invitrogen	11330-032
Plaque de culture cellulaire 24 puits, à fond plat avec couvercle	BD	353935
Y-27632	TOCRIS	1254	10 μ ; M (Stock : 10 mM)
Facteur de croissance des fibroblastes basiques	LIFE TECHNOLOGIES	PHG0263	10 ng (Stock : 100 ug)
Sérum de remplacement	Gibco	10828028
Dulbecco' ; s Medium Eagle modifié (D-MEM, DMEM) (1X), liquide (haute teneur en glucose)	Invitrogen	11965118
Sérum de veau fœtal	Thermo Scientific Fermentas	SH30071.03
L-Glutamine-200 mM (100X), liquide	GIBCO	25030-081	1/100
MEM Solution d’acides aminés non essentiels, 100X	LIFE TECHNOLOGIES		1/100
2-Mercaptoéthanol (1 000X), liquide	GIBCO	21985023	1/1 000
Hausser Hémacytomètres à contraste de phase	Hausser Scientific	02-671-54
EmbryoMax 0,1 % solution de gélatine	Millipore	ES-006-B
SSEA-4	DSHB	MC-813-70	1/200
anti-Tra-1-81	Signalisation cellulaire	4745S	1/200
anticorps monoclonal Oct4 de souris	Santa Cruz	SC-5279	1/1 000
Nanog	R& D	AF1997	1/1 000
Alexa Flouor 488 chèvre anti-souris	Invitrogen	948492	1/2 000
DPBS (Dulbecco' ; s Saline tamponnée au phosphate), 1X sans calcium et magnésium	Cellgro	21-031-CV
QuantiTect Kit de Transcription Inverse	QIAGEN	205313
PCR Master Mix [2X]	Thermo Scientific Fermentas	K0171
Trizol	Invitrogen	15596018
Trap de prélèvement	NuAire	NU-301
lunette de dissection  ;	Nikon	SMZ745