L'utilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour l'analyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse

Résumé

Grossesse conduit à d'importants changements à la composition en acides gras des tissus maternels. profils lipidiques peuvent être obtenus par chromatographie en phase gazeuse pour permettre l'identification et la quantification des acides gras dans les classes de lipides individuels entre les rats nourris avec des régimes différents de graisse haute et basse pendant la grossesse.

Résumé

chromatographie en phase gazeuse (GC) est une méthode très sensible utilisée pour identifier et quantifier la teneur en acides gras des lipides des tissus, de cellules et de plasma / sérum, donnant des résultats avec une grande précision et une reproductibilité élevée. Dans les études métaboliques et nutrition GC permet l'évaluation des changements dans les concentrations d'acides gras suivants interventions ou lors des changements de l'état physiologique comme la grossesse. Extraction en phase solide (SPE) à l'aide aminopropyliques cartouches de silice permet la séparation des principales classes de lipides, y compris les triglycérides, différents phospholipides et esters de cholestérol (CE). GC combinés avec SPE a été utilisé pour analyser les variations de la composition en acides gras de la fraction CE dans le foie des rats gravides vierges et qui avaient été nourris avec des régimes différents de haute et basse en matières grasses. Il ya des effets d'interaction alimentation / grossesse importantes sur la teneur en acides gras oméga-3 et oméga-6 gras de foie CE, indiquant que les femmes enceintes ont une réponse différente à manipula alimentaireion de s'observe chez les femelles vierges.

Introduction

chromatographie en phase gazeuse (GC) est une technique bien établie utilisée pour identifier et quantifier l'incorporation des acides gras dans les piscines de lipides et les membranes cellulaires ^1,2 dans des conditions de supplémentation ou physiologiques tels que l'obésité (et maladies apparentées telles que le diabète) ou la grossesse ^{3 - 5.} Il est également adapté pour analyser les types et les quantités de matières grasses dans les aliments. Ceci est utile lors de la caractérisation des régimes expérimentaux, ainsi que veiller à ce que l'industrie alimentaire conforme à la réglementation. Par exemple, GC peut être utilisée pour confirmer l'identité et la quantité des acides gras dans un produit comme un complément alimentaire pour garantir que le marquage est correct et réglementations sont respectées à ^6,7. Analyse des acides gras peut fournir des indications précieuses sur le métabolisme des lipides dans la santé et la maladie, l'impact de la modification du régime alimentaire, et l'effet des changements dans l'état physiologique ^8. L'utilisation de GC à étudier des échantillons durant la grossesse a fourni importantedes informations sur les changements dans l'acide gras et l'homéostasie lipidique complexe ^3.

Avant la séparation chromatographique, les lipides sont généralement extraits de l'échantillon en utilisant la solubilité des lipides dans des mélanges de solvants de chloroforme et de méthanol. Le chlorure de sodium est ajouté pour faciliter la séparation du mélange en lipides aqueuse et organique contenant ^9,10 phases. Classes de lipides complexes d'intérêt peuvent être séparées de l'extrait lipidique total d'une extraction en phase solide (SPE). Cette technique de séparation élue classes de lipides en fonction de leur polarité ou affinité de liaison. Triacylglycérols (TAG) et des esters de cholestérol (CE) sont éluées en premier en tant que fraction combinée, d'autres catégories, la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), et les acides gras non estérifiés (AGNE) sont éluées en augmentant la polarité du solvant d'élution . La séparation des TAG de CE exploite la liaison de TAG seulement à une SPE cartri fraisdge, permettant CE pour être élue. TAG peut ensuite être éluée en augmentant la polarité du solvant d'élution ^9,10. Cette méthode permet à plusieurs échantillons à séparer simultanément avec un rendement plus élevé que ce qui est réalisé par chromatographie sur couche mince, ce qui signifie que la taille des échantillons relativement petits (par exemple <100 ul de plasma ou de sérum, <100 mg de tissus) peuvent être analysées ^11,12.

GC est une technique bien établie décrite dans la première des années 1950, il a été suggéré que la phase mobile dans les systèmes ensuite liquide-liquide peut être remplacé par de la vapeur. Il a d'abord été utilisée pour l'analyse de pétrole mais s'est rapidement développée dans d'autres domaines tels que l'analyse des acides aminés et la biochimie des lipides, qui est toujours d'un grand intérêt. Les progrès de l'équipement et de la technologie GC tels que le développement de colonnes capillaires des colonnes garnies utilisés précédemment a conduit à nos techniques actuelles dans laquelle les acides gras sont en mesure d'êtreséparés de manière plus efficace à des températures inférieures résultant en GC est couramment utilisé pour identifier et quantifier les acides gras dans un large éventail d'enquêtes ^13.

GC nécessite des acides gras pour être dérivé afin qu'ils puissent devenir suffisamment volatil pour être élue à des températures raisonnables sans décomposition thermique. Cela implique généralement la substitution d'un groupe fonctionnel contenant de l'hydrogène pour former des esters, des thioesters ou amides d'analyse. Les esters méthyliques sont couramment étudiés dérivés, qui sont produites par méthylation. Dans ce procédé, les liaisons ester dans les lipides complexes sont hydrolysés pour libérer les acides gras libres, qui sont transmethylated pour former des esters gras méthyliques d'acide (EMAG). Le profil résultant de FAME, déterminé par CPG, est désigné comme la composition en acides gras et peut être aisément comparé entre les différents groupes expérimentaux ^9,10. La technique permet à la fois les proportions des indiLes acides gras UAL et leurs concentrations à mesurer.

En plus de l'utilisation de CG pour la détermination des acides gras dans les études de nutrition et de l'industrie alimentaire, la technique peut être utilisée dans une large gamme de domaines d'analyse. Par exemple, les analyses environnementales par GC comprennent la mesure de la contamination des eaux par les insecticides et les analyses de sol mesurer la teneur en chlorobenzène. En toxicologie, GC a également été utilisé pour identifier les substances illicites dans l'urine et des échantillons de sang de personnes; une telle performance sportive amplificateurs ¹² et la capacité à séparer des mélanges complexes d'hydrocarbures rend cette technique populaire dans l'industrie pétrolière pour l'analyse de la pétrochimie ^12.

La grossesse est associée à des modifications importantes à la composition en acides gras des tissus maternels, en particulier dans la teneur en acides gras oméga-3 (n-3) et les acides gras oméga-6 (n-6) aci gras polyinsaturéds (AGPI) ^3. Dans la présente étude, nous illustrons l'utilisation de GC dans la mesure des acides gras en décrivant leur utilisation dans l'analyse de la composition en acides gras des tissus du foie prélevé sur des rats vierges et enceintes recevant une ration faible et élevée de graisse avec différentes sources de pétrole. Les rations expérimentales fournies ici sont une base d'huile bas régime de soja gras, un régime riche en graisses de soja à base d'huile (130,9 g Lipides totaux / kg de matière grasse totale) ou un régime à base d'huile de lin riche en graisses (130,9 g Lipides totaux / kg régime), prévue à 20 jours. La composition de ces régimes acide gras complet nutritif et ont été décrites précédemment ^14. Les régimes alimentaires d'huile de soja sont riches en acide linoléique (18:2 n-6) et contiennent un peu d'acide α-linolénique (18:3 n-3) tandis que l'alimentation de l'huile de lin est riche en acide α-linolénique. Ces régimes riches en gras représentent les différentes rations de linoléiques à α-linolénique (rations de 08h01 et 01h01, respectivement). La méthode d'isolement des classes de lipides individuels et l'analyse par GC est nousll établi et validé, et a été publié antérieurement ¹⁰ mais sans la description technique détaillée trouvé ici.

Protocole

Une. Procédures animales

1. Tous les travaux des animaux doit être effectué en conformité avec les bureaux à domicile des animaux (Scientific Procedures) Act (1986).
2. Compagnon de rats Wistar âgés de 10 semaines par reproduction monogame, et confirmer la grossesse par l'apparition d'un bouchon vaginal. Enregistrer ce que le jour 1 de la gestation, et commencer régime expérimental. Pour les femelles vierges, accueillir chaque rat individuel, et commencer régime expérimental.
3. Après avoir nourri les régimes expérimentaux pendant 20 jours euthanasier les rats par asphyxie au _CO2, suivie par dislocation cervicale.
4. Utilisez une pince de dissection et ciseaux pour exposer la cavité abdominale et exciser le foie en coupant les ligaments qui relient le foie au diaphragme, paroi antérieure de l'abdomen, l'estomac et le duodénum. Lavez le foie dans du PBS et congeler dans l'azote liquide avant de le ranger à -80 ° C.

2. Préparation d'un lipide extrait total ⁹

1. Ajouter Molecultamis ar (à remplir 1/10 de récipient de solvant) à tous les solvants pour créer solvants «sèches». Effectuer tous les travaux solvant dans une hotte.
2. Couper environ 100 mg foie congelé et peser. Placez le tissu dans un tube dans un seau à glace et ajouter 0,8 ml de glace froide NaCl à 0,9%. Homogénéiser le tissu.
3. Ajouter étalons internes dissous dans 1 ml / mg de chloroforme anhydre et de methanol (2:1, v / v) contenant de l'hydroxytoluène butylé (BHT, 50 mg / l) comme anti-oxydant. Pour 100 mg de foie de rat ajouter 100 ug de la norme CE (Cholesteryl heptadécanoate 17:00) Attention:. Chloroforme et le BHT sont dangereux.
4. Ajouter 5,0 ml de chloroforme sec: méthanol (2:1, v / v) contenant du BHT (50 mg / L).
5. Ajouter 1,0 ml de NaCl 1 M, bien mélanger au vortex jusqu'à ce que le mélange ressemble uniforme. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine.
6. Centrifuger à 1000 g pendant 10 min, bas frein à la température ambiante.
7. Recueillir inférieurephase en utilisant une pipette Pasteur en verre, transférer dans un nouveau tube en verre avec bouchon à vis et sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine.

3. La séparation des classes de lipides par extraction en phase solide (SPE) ¹⁰

1. Connecter le réservoir SPE à une pompe à vide et placer aminopropyl cartouche de silice SPE sur le réservoir.
2. Placer le nouveau tube de verre à bouchon à vis TAG marqué CE et dans le rack de réservoir dans la colonne de recueillir première fraction.
3. Dissoudre l'extrait total de lipides dans 1,0 ml de chloroforme sec et vortex.
4. Appliquer l'échantillon à la colonne à l'aide d'une pipette Pasteur en verre et laisser couler à travers dans le tube à bouchon à vis par gravité. Si d'autres gouttes tombent, retirer le liquide restant sous vide.
5. Éluer la fraction de TAG et CE sous vide, laver la colonne avec 2 x 1,0 ml lavages de chloroforme sec.
6. Lorsque tout le liquide est retiré, sécher le TAG et CE fractionnementn sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine.
7. Placer le nouveau bouchon à vis tube de verre PC marqué dans le bac du réservoir sous la colonne.
8. Éluer la fraction de PC sous vide avec addition de 2 x 1,0 ml de chloroforme sec: methanol (60:40, v / v) jusqu'à ce que tout le liquide est enlevé de la colonne.
9. Retirez et fraction de PC sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine.
10. Placez un nouveau bouchon à vis tube de verre PE marqué dans le bac de réservoir et éluer la fraction de PE avec l'addition de 1,0 ml de méthanol sec sous vide.
11. Retirez et fraction de PE sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine.
12. Placer le nouveau tube de verre à bouchon vissé marqué AGNE dans le bac de réservoir et éluer la fraction AGNE sous vide par l'addition de 2 x 1,0 ml lavages de chloroforme sec: méthanol: acide acétique glacial. (100:2:2, v / v / v) Attention: L'acide acétique glacial est dangereux.
13. Retirer fraction recueillie AGNE et sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine.
14. Placez une nouvelle cartouche SPE de silice aminopropylé sur le réservoir de SPE et placer un tube de verre à bouchon vissé dans le bac du réservoir sous la cartouche de collecte des déchets.
15. Laver la colonne avec 3 lavages d'hexane sec sous vide, puis un lavage de 1,0 ml finale par gravité. Ne laissez pas la cartouche à devenir sec (tourner les chaînes de la colonne de la cartouche à une position fermée lorsque le niveau de l'hexane est proche de la matrice de la cartouche). Attention: L'hexane est dangereux.
16. Remplacer le tube de déchets avec le tube de verre nouvelle vis-bouchon de marquage CE.
17. Dissoudre le TAG et CE fraction séchée (préparé à l'étape 3.6) dans 1,0 ml d'hexane sec et vortex. Appliquer à la colonne en utilisant une pipette Pasteur en verre et laisser s'égoutter à travers sous gravity.
18. Si d'autres gouttes tombent, retirer le liquide restant sous vide.
19. Sous vide, laver la colonne avec 2 x 1,0 ml d'hexane sec lavages pour éluer CE et fraction recueillie sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine.
20. Placer le nouveau tube de verre à bouchon à vis TAG marqué dans le bac de réservoir et élution TAG avec l'ajout de 2 x 1,0 ml d'hexane sec lavages: méthanol: acétate d'éthyle (100:5:5) sous vide.
21. Fraction recueillie à sec sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C à ce stade pour une semaine. Attention: l'acétate d'éthyle est dangereux.

4. Préparation de FAME de CE ¹⁰

1. Ajouter 0,5 ml de toluène sec à la fraction de la CE séparé (recueillies à l'étape 3.19) et vortex. Attention: Le toluène est dangereux.
2. Préparer le réactif de méthylation (méthanol sec avec 2% (v/ V) de H ₂ SO _4), dont 1,0 ml est requis par échantillon. Distribuer le volume de méthanol sec en verre ou en matière plastique adéquate avec couvercle et ajouter la quantité requise de H ₂ SO _4, goutte à goutte, puis mélanger par inversion. Attention: L'acide sulfurique est dangereux.
3. Ajouter 1,0 ml de réactif de méthylation pour les échantillons dissous dans du toluène sec, boucher les tubes en toute sécurité, et mélanger doucement.
4. Chauffer les échantillons pendant 2 heures à 50 ° C.
5. Après 2 h retirer les tubes de la chaleur. Une fois ajouter fraîche 1,0 ml de solution (0,25 M _KHCO3 0.5MK ₂ CO ₃₎ Attention neutralisants:. Bicarbonate de potassium et de carbonate de potassium sont dangereux.
6. Ajouter 1,0 ml d'hexane sec et vortex.
7. Centrifuger à 250 g pendant 2 min, faible frein à la température ambiante.
8. Recueillir la phase supérieure, qui contient le FAME, et transférer dans un nouveau bouchon à vis tube non de verre jetable.
9. Sécher le FAME recueillis en vertu del'azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant une semaine.

5. Retrait du cholestérol libre contamination de FAME CE ¹⁴

(Sans cholestérol peut contaminer l'échantillon; voir la figure 1 pour les traces exemple de chromatographie avec et sans enlèvement de cholestérol).

1. Placer un tube de déchets dans le réservoir de SPE et de placer une cartouche SPE de gel de silice sur le réservoir.
2. Laver la colonne avec 3 x 1 ml d'hexane sec lavages sous vide et 1 x 1 ml par gravité.
3. Retirer lavages de déchets et ajouter nouveau tube de déchets dans le réservoir.
4. Dissoudre FAME CE dans 1 ml d'hexane sec, vortex.
5. Appliquer à la colonne en utilisant une pipette Pasteur en verre et laisser s'égoutter par gravité à travers.
6. Laver la colonne avec 3 x 1 ml d'hexane lavages sous vide.
7. Retirer lavages de déchets et placez nouveau tube non bouchon à vis en réservoir de l'étiquette FAME CE.
8. Éluer l'FAME CE avec 2 x 1 ml d'hexane sec: l'éther éthylique (95:5 v / v) lavages.
9. Sécher sous azote à 40 ° C. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C à ce stade pour une semaine. Attention: l'éther de diéthyle est dangereux.

6. Transfert de FAME en GC Auto Sampler Vial

1. Ajouter 75 ul hexane sec à déguster, vortex, et de les transférer à un GC échantillon automatique flacon.
2. Ajouter un autre 75 pi hexane sec à déguster, vortex et transférer à la même GC échantillon automatique flacon. Les échantillons peuvent être bouchés et conservés à -20 ° C, à ce stade pendant un mois.

7. Analyse utilisant la chromatographie en phase gazeuse ¹⁴

1. Analyser FAME sur un chromatographe en phase gazeuse. Exemple mis en place: 30 mx 0,25 um x 0,25 mm BPX-70 fusionné colonne capillaire de silice avec un protocole de température:
   Température initiale de 115 ° C, maintenez 2 min, rampe de 10 ° C / min à 200 ° C, maintenez 18,5 min, rampe de 60 ° C / min à 245 ° C, hde 4 min.
   Colonne: hélium gaz, le taux de 1,0 débit, la pression et la vitesse de 14,6 29.
   Injecteur: Température = 300 ° C.
   Détecteur: flux d'hydrogène 40.0, flux d'air 184,0, maquillage hélium de gaz, débit 45,0, température = 300 ° C.
2. Réglez rapport de division, le cas échéant (par exemple 25:1 pour l'analyse des FAME CE).
3. Déterminer l'aire de chaque pic en utilisant un logiciel approprié et d'identifier les points de gloire en comparaison avec les normes. Voir la figure 2 par exemple des chromatogrammes.
4. Utiliser l'aire sous les pics de données pour calculer la contribution des acides gras individuels en tant que pourcentage des acides gras totaux.
5. Calculer les concentrations absolues des acides gras en divisant la surface de référence interne par la quantité ajoutée. Diviser la superficie de chaque acide gras par ce résultat pour obtenir des concentrations absolues de chaque acide gras à l'intérieur de la quantité de tissu utilisé.

Résultats

Le succès de ce procédé dépend de la suite du protocole de précision et de nettoyage utilisant des solvants et des réactifs de façon à réduire le «bruit» et la contamination qui peut apparaître sur un chromatogramme. Les échantillons contaminés sont plus difficiles à analyser, ce qui réduit la précision de l'aire sous la courbe de calculs. Si le protocole est suivi avec succès un chromatogramme avec des pics symétriques, claires et bien définies, avec un bruit de fond minimal doit être obtenue, comme illustré sur

Discussion

Chromatographie en phase gazeuse est une technique exacte à utiliser pour l'analyse d'acide gras, et sa reproductibilité élevée juge cette technique convient pour les analyses cliniques. Colonnes de CPG appropriées doivent être utilisées pour permettre l'identification d'acides gras d'intérêt, avec des colonnes disponibles présentant des variations de la polarité de la phase stationnaire, la longueur de la colonne et le diamètre intérieur. L'utilisation d'une colonne capillaire en silice fond...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Méthanol	Fisher Scientific	M/4056/17	Fumées 'ATTENTION' - Chlorforme de qualité HPLC
	Fisher Scientific	C/4966/17Fumées	'ATTENTION' - Grade HPLC BHT
	Sigma- Aldrich	W218405'ATTENTION' Fumées de poussière - Anhydre
NaCl	Sigma- Aldrich	S9888	Hexane anhydre
	Fisher Scientific	H/0406/17	Fumées -
Acide acétique glacial	Sigma- Aldrich	695084'ATTENTION	' Brûlures - 99,85 %
Acide sulfurique	Sigma- Aldrich	339741'ATTENTION	' Brûlures - 99.999 %Carbonate de
potassium	Sigma- Aldrich	209619	99 % ACS Bicarbonate
potassium	Sigma- Aldrich	237205	99,7 % ACS
Acétate d’éthyle	Fisher Scientific	10204340	Fumées - 99+ % GLC Spécifié
Toluène	Fisher Scientific	T/2300/15	' Fumées
Éther diéthylique	Sigma- Aldrich	309966'ATTENTION	' Fumées Bouteille d’azote
(sans oxygène)	BOC	44-w	'ATTENTION' Gaz comprimé - risque d’explosion
Cartouches SPE de silice aminopropylique	Agilent	12102014	Cartouche - Masse de billes 100 mg
Gel de silice Cartouches SPE	Agilent	14102010	Cartouche - Masse de billes 100 mg
Saisies moléculaires	Sigma- Aldrich	334324	Pellets, AW-300, 1,6 mm
Pipettes Pasteur en verre	Fisher Scientific	FB50251