Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

Summary

Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO _2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.

Abstract

Membranes bicouches lipidiques forment les membranes plasmiques des cellules, et définissent les limites des organites subcellulaires. Dans la nature, ces membranes sont des mélanges hétérogènes de nombreux types de lipides, contiennent des protéines membranaires et sont décorées avec des hydrates de carbone. Dans certaines expériences, il est souhaitable de découpler les propriétés biophysiques et biochimiques de la bicouche lipidique de celles de la membrane naturelle. Ces cas nécessitent l'utilisation de systèmes modèles tels que vésicules géantes, des liposomes ou des bicouches lipidiques supportées (BLP). Les tableaux de BLP sont particulièrement attrayants pour les applications de détection et imitant les interactions cellule-cellule. Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour former des tableaux SLB. Submicronique diamètre SiO ₂ perles sont d'abord revêtus de bicouches lipidiques pour former BLP sphériques (SSLBs). Les billes sont ensuite déposés dans une matrice de micro-puits de micro-fabriqué sous-micron de diamètre. La technique de préparation utilise un "raclette" pour nettoyer la surface du substrat, tandis que leaving derrière SSLBs qui se sont installés dans des micropuits. Ce procédé ne nécessite aucune modification chimique du substrat de micropuits, ni aucun des ligands de ciblage particulier sur la SSLB. Les micropuits sont occupés par des billes uniques parce que le diamètre du puits est réglée pour être juste supérieur au diamètre du bourrelet. En règle générale, plus de 75% des puits sont occupés, tandis que le reste demeure vide. Dans tampon tableaux SSLB affichent une stabilité à long terme de plus d'une semaine. Plusieurs types de SSLBs peuvent être placés dans un tableau unique par dépôt en série, et les matrices peuvent être utilisées pour la détection, dont on démontre par la caractérisation de l'interaction de la toxine cholérique avec le ganglioside GM1. Nous montrons également que les vésicules de phospholipides sans supports de talon et des membranes biologiques à partir de sources cellulaires peuvent être disposés avec la même méthode et les lipides membranaires spécifiques de cellules peuvent être identifiées.

Introduction

Membranes bicouches lipidiques sont des structures essentielles dans la nature. Les membranes plasmiques et les membranes cellulaires des organites sont composées de bicouches lipidiques incorporant un certain nombre de molécules qui sont nécessaires à la vie. De nombreux procédés de survie se produisent sur la surface de cellules ou sont médiées par des molécules associées aux membranes bicouches de lipides. En fait, de nombreux procédés pharmaceutiques ou des molécules cibles se trouvent sur ​​ou dans les membranes ^1,2. Il est donc nécessaire d'étudier analytiquement les processus, tels que des réactions chimiques ou des événements de liaison non covalentes qui se produisent sur les surfaces de la membrane. Les membranes naturelles peuvent être difficiles à isoler et / ou l'interface de capteurs, de nombreux chercheurs utilisent des membranes modèles simplifiés de réaliser des études analytiques. Un certain nombre de systèmes de membrane modèle sont décrits dans la littérature, allant de vésicules géantes qui peuvent être des dizaines à des centaines de microns de diamètre à des liposomes de dimensions nanométriques ^3,4. Alterntivement, des bicouches lipidiques planes déposés sur des supports solides, à savoir, soutenus bicouches lipidiques (BLP), peuvent être formées sur un certain nombre de surfaces différentes et ont été largement utilisés dans des applications biophysiques, biochimiques et d'analyse ^5. Couplage BLP avec des matériaux électriques ou optiques permet l'étude de la biochimie et de la biophysique de la membrane grâce à l'utilisation de différentes techniques d'analyse. Microscopie de fluorescence ^{6, 7} électrochimie, la spectroscopie optique ^8, la microscopie à sonde de balayage ^9, la résonance plasmonique de surface ^10, et la spectrométrie de masse ¹¹ ont tous été utilisés pour étudier la structure et les propriétés de BLP.

Tableaux SLB offrent plus de polyvalence dans la conception de capteurs pour les essais multiplex ^12,13. D'autres applications utilisent des tableaux SLB pour imiter la jonction qui se forme entre les cellules immunitaires ^14. Méthodes de préparation pour les tableaux SLB ont varié de microfluidic atteint près ^{de 15} pour ceux qui emploient des barrières physiques entre les parcelles adjacentes SLB. ¹⁶ autres groupes ont utilisé des méthodes d'impression ^{17, 18} et structuration photochimique diverses approches nanogénie ¹⁹ pour créer des tableaux SLB.

Dans le présent document vidéo d'accompagnement et nous démontrons une méthode pour former des réseaux par dépôt SLB SLB-SiO ₂ revêtues perles en ensembles ordonnés de micropuits ^20. Nous nous référons aux SLB-revêtus de SiO ₂ perles en bicouches sphériques soutenues lipidiques (SSLBs). Cette technique est une extension des travaux antérieurs qui a créé des tableaux de vésicules de phospholipides et les membranes biologiques dérivés de sources naturelles ^21, à partir de laquelle nous montrons aussi par exemple des résultats. D'autres procédés pour rangeant particules de biomembrane ou vésicules se sont appuyés sur les modes de ligands de ciblage spécifiques sur des surfaces qui s'associent avec des ligands complémentaires contenues sur la surface des vésicules. Les exemples incluent la biotineassociation avidine ^22,23 et systèmes d'hybridation d'ADN ^24. Notre approche ne nécessite qu'un réseau de micro-puits sans ciblage ou de reconnaissance des groupements nécessaires. La taille de SSLBs est défini par le diamètre des supports de SiO ₂ de perles, qui ont une faible poly-dispersité. En ajustant le diamètre de microtitration à un peu plus grand que le diamètre SSLB, un seul SSLB se dépose dans chaque micropuits. Un poly (diméthyl siloxane) (PDMS) racloir enlève ensuite la surface de tous les SSLBs qui ne sont pas immobilisés dans des micropuits. Les puits et les tableaux SSLB résultantes ont haute densité (~ 10 ⁵ SSLBs / mm ²⁾ avec 3 pm espacement centre à centre et la périodicité hexagonale. En déposant en série avec SSLBs compositions lipidiques différentes, il est possible de créer des tableaux à plusieurs composants avec SSLBs positionnées de manière aléatoire. Afin de démontrer la capacité de détection de réseaux SSLB, nous avons utilisé l'interaction de la toxine cholérique (CTx) avec un ganglioside (GM1) incorporés dans les SSLBs. Avecparticules membranaires naturelles, nous avons pu détecter des lipides spécifiques des cellules dans des tableaux à plusieurs composants contenant des matières de la membrane à partir de deux types de cellules différents.

Protocol

1. Microfabrication de Microwell tableau Substrat

1. Commencez avec une tranche de 4 pouces de silicium de 100 nm d'oxyde à croissance thermique.
2. Spin SPR-955 0,7 résine photosensible sur la tranche à 4000 tpm pendant 30 secondes.
3. Cuire au four sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 90 secondes.
4. Exposer résine photosensible.
   1. Utiliser un masque qui permettra de créer une um trous disposés suivant un réseau hexagonal avec une période de 3 um, où la matrice comprend une zone de 2 mm x 2 mm.
   2. Exposer la plaquette à un photorépéteur en ligne en utilisant une taille de pas de 6 mm et d'une exposition de 200 mJ / cm ^2.
5. Cuire au four sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 90 secondes.
6. Développer l'aide d'un développeur de spin de déposer deux flaques de CD-26 sur la tranche pour une durée totale de développement de 90 sec.
7. Rincez abondamment à l'eau ultra-pure de DI et sec avec N _2.
8. Graver l'oxyde dans un graveur ionique réactive pour 6 min 50 sccm d'Ar, 25 sccm de CF _4, et 50 sccm de CHF ₃ floaile à une pression de 75 mTorr.
9. Graver le silicium dans une tranchée profonde ICP graveur ionique réactive pendant 2 min à 63 sccm de C ₄ F _8, 27 sccm de _SF6, 40 sccm d'Ar et 10 sccm d'O ₂ qui s'écoule à une pression de 14 mTorr.
10. Rincer à l'acétone, le méthanol et l'isopropanol pour éliminer résister.
11. Placer dans un bain de H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ 01 heures 01 pendant 10 minutes pour nettoyer la surface.
12. Rincez abondamment à l'eau ultra-pure de DI et sec avec N _2.
13. Déposer 1080 Å de Al ₂ O ₃ par dépôt de couches atomiques à 250 ° C.

2. Préparation de poly (diméthyl) Raclette

1. Si possible, travailler en salle blanche. Travailler autrement dans l'environnement le plus propre possible.
2. Obtenir un plat en plastique Petri (ou un autre récipient propre et jetable) avec ≥ 13 mm de côté.
3. Dans ce plat, verser 5 g d'agent de durcissement PDMS, puis 50 g de PDMS base agent (ou quoi que ce soit avec un rapport de 1:10 qui la plupart du temps de remplir la boîte de Pétri). Mélanger soigneusement avec une pipette en plastique à usage unique ou d'une tige.
4. Enlever les bulles en plaçant les PDMS mélangés dans une chambre avec une ligne de vide, le vide est appliqué jusqu'à ce que les bulles sortent du mélange (environ 30 min).
5. S'il n'est pas déjà dans la boîte de Pétri, versez PDMS en boîte de Pétri, en évitant la création de bulles d'air.
6. Cure nuit sur une plaque chauffante à> 50 ° C (chaleur plus élevée pour moins de temps travaille aussi).
7. Avec la nouvelle lame propre / de rasoir, découpez soigneusement un morceau rectangulaire d'environ 2,5 x 2,5 cm, en gardant surface supérieure aussi propre que possible. Peler avec une pince propres. Coupez un bord (jusqu'à 1,5 cm) en appuyant sur la lame de rasoir en un seul mouvement, pour faire le bord supérieur aussi nette que possible (ce sera le bord utilisé dans le processus de raclette).
8. Nettoyez avec de l'acétone, le méthanol, l'alcool isopropylique et de l'eau déminéralisée ultra-pure, puis sécher avec de l'azote gazeux propre. Stocker dans une boîte de Petri propre.

3. Préparation de vésicules

1. Recueillir lipidiques solutions de stockage de phosphatidylcholine à 25 mg / ml oeuf (PC) et 1 mg / ml de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) de sel d'ammonium (Rho-DPPE) dans le chloroforme et un ml de solution à 0,5 mg / stock de monosialoganglioside GM1 dans le chloroforme / méthanol (2:1 v / v).
2. Dans un flacon de petit verre faire un mélange qui résulte en 97% en moles de PC, de 2% en moles GM1 et 1% en moles de Rho-DPPE en ajoutant 18,9 pi de 25 mg / ml de PC, 39,6 ul de 0,5 mg / ml GM1 et 7,9 ul d' 1 mg / ml de Rho-DPPE en utilisant des seringues en verre.
3. Remarque:. Le matériel supplémentaire pour Nair et al ²⁵ contient une excellente feuille de calcul Excel personnalisable pour calculer les quantités de lipides nécessaires à la création des vésicules de toute composition souhaitée.
4. Placer le flacon dans un dessiccateur à vide et éliminer le solvant en laissant le flacon sous vide pendant 6 heures.
5. Faire une solution aqueuse de 0,1M NaCl. Ajouter 0,5 ml de la solution 0,1 M de NaCl dans le flacon contenant le film lipidique séché.
6. Laisser le mélange de lipides aqueuse au repos pendant une nuit.
7. Brièvement mélange vortex pour créer une suspension de vésicules, suivi d'une sonication pendant 20 min dans un bain de sonication à température ambiante.
8. Extruder la suspension de vésicules à travers une membrane de polycarbonate de 100 nm de taille de pores. Passez la suspension de vésicules à travers le filtre de 17x.
9. Stocker les vésicules extrudes dans un flacon en verre à 4 ° C.

4. Formation de bicouches lipidiques sphériques pris en charge

1. Recueillir 700 nm de diamètre SiO ₂ perles. Les perles sont livrés dans de l'eau distillée à une concentration de l'action de 1,4 x 10 ¹¹ billes / ml.
2. Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml préparer une suspension de billes de 1 ml avec une concentration de 1,5 x 10 billes / ml ¹⁰ par addition de 107 ul de solution de langue bourrelet à 893 ul de 0,1 M de NaCl.
3. Vortex la suspension pour s'assurer qu'il est bien mixe.
4. Centrifuger la suspension à 1700 g pendant 20 min, puis jeter le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 1 ml de 0,1 M de NaCl. Répétez cette étape deux fois plus de se laver les perles.
5. Pour former les SSLBs, dans un tube Eppendorf de 1,5 ml ajouter 25 ul de la suspension de billes de SiO ₂ de 200 ul de 1 mg / ml de suspension de vésicules. Vortex le mélange et laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante. A ce stade, la concentration devrait être SSLB 1,7 x 10 ⁹ / ml SSLBs.
6. Centrifugeuse à 1700 g pendant 20 min pour sédimenter les SSLBs. Le culot doit apparaître rose en raison de la rupture de vésicules avec Rho-DPPE sur les billes.
7. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 225 ul de phosphate (PBS), pH = 7,4. Répétez les étapes 4.6 à 4.7 deux fois de plus pour enlever les vésicules non rompues de la suspension SSLB.

5. Assemblée des SSLB tableau

1. Plaquette Cleave de réseaux de micro-puits résultant en morceaux rectangulaires avec 4-6 microrowell tableaux par pièce.
2. Vortex mélanger la suspension SSLB, puis placez 10 pi de SSLB suspension sur chaque réseau de puits. De peur reste pendant 1 heure pour permettre SSLBs pour régler à la surface.
3. Lavez délicatement la puce de réseau de micro-puits avec du PBS à partir d'une bouteille de lavage, puis plonger dans un bain de PBS préparé dans un plat peu profond.
4. Bien que submergé, placez doucement la PDMS chasse raclette sur la puce de réseau de micro-puits et faites glisser doucement le long de la surface 5x pour enlever SSLBs qui ne sont pas immobilisés dans des micropuits.
5. Saisissez la puce de réseau de micropuits avec des pincettes et secouez-la délicatement dans le bain de PBS pour éliminer tout excès SSLBs.
6. Enlever rapidement la puce du bain raclette et placer dans un bain de PBS frais jusqu'à utilisation ultérieure. Assurez-vous que la surface supérieure de la puce reste humide pour préserver les SSLBs.

Remarque: La méthode d'assemblage décrite ci-dessus peut être utilisée pour créer des matrices de particules de membrane naturels, comme des particules de la myéline isolés à partir de cerveau de souris, ou phovésicules spholipid sans SiO ₂ supports de perles. Ce travail est décrit en détail dans Wittenberg et al. ²¹ et des résultats représentatifs sont présentés ci-dessous.

6. Toxine cholérique essai de liaison

1. Préparer une solution à 2 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS.
2. Préparer une solution à la concentration souhaitée de l'Alexa 488 conjugué à la toxine cholérique sous-unité B dans du PBS avec 2 mg / ml de BSA.
3. Retirez la puce de réseau SSLB du bain de PBS et évacuer plus de la solution PBS en utilisant un laboratoire essuyer. Laisser juste assez de PBS sur la puce de garder le tableau SSLB hydratée.
4. Pour éviter la liaison non spécifique, ajouter 200 ul de 2 mg / ml de solution de BSA à la puce de réseau SSLB. Laisser reposer pendant 1 heure dans une boîte humidifiée.
5. Avec une micropipette, enlever 200 pi de solution à partir du haut de la puce de réseau SSLB.
6. Ajouter 200 pi de solution de la toxine du choléra à la puce de réseau SSLB et laisser reposer pendant 1 heure dans une boîte humidifiée.
7. Lavez délicatement la puce de réseau SSLB avec du PBS à partir d'une bouteille de lavage pour éliminer toute toxine cholérique non lié.
8. Wick l'excès de PBS en utilisant un laboratoire essuyer. Avant imagerie puce de couverture avec un glissement de 24 mm de couverture x 40 mm.
9. tableaux de l'image avec un microscope droit en utilisant un filtre fixe approprié pour les fluorophores d'intérêt.
10. Analyser l'intensité de fluorescence de SSLBs individuels d'un tableau à l'aide de la fonction d'analyse de particules automatisé de logiciels ImageJ.
11. Compiler intensités moyennes de SSLBs individuels de fluorescence en histogrammes qui résument les intensités des SSLBs trouvés sur un réseau donné.

Results

Lorsque des billes _de SiO ₂ sont mélangées avec une solution de vésicules composées de phospholipides, des lipides et d'autres lipides fluorescents tels que les gangliosides, les vésicules se rompent sur ​​les surfaces de SiO ₂ de talon pour former SSLBs, comme représenté schématiquement sur ​​la figure 1a. Après lavage des SSLBs, une goutte de solution SSLB est placé sur une matrice de micro-puits, et les billes sont laisse décanter à la surface. (Figure 1b1)

Discussion

Dans ce travail, nous montrons que monodisperses SiO ₂ perles enrobées avec les bicouches lipidiques en charge peuvent être disposés en rangées de puits de microtitration, sans la nécessité de ligands de ciblage sur les bicouches lipidiques ou la surface du substrat, et les matrices peuvent être utilisées pour la caractérisation des interactions de toxine-lipide. Le nous constante de dissociation calculée pour la liaison CTx/GM1 compare favorablement, compte tenu de la grande disparité des valeurs dans la lit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaquettes de silicium de 4 pouces	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 développeur	MicroChem	CD-26
i-line stepper	Canon	2500 i3 stepper
Vision 320 graveur ionique réactif	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Graveur d’ions réactifs en tranchée profonde	Plasma Therm	SLR-770
Système de déposition de couche atomique	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(diméthylsiloxane) kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Phosphatidylcholine d’œuf	Avanti Polar Lipids	840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) sel d’ammonium	Avanti Polar Lipids	810158C
Monosialoganglioside GM1	Avanti Polar Lipids	860065P
Perles de silice	Bangs Laboratories	SS03N/4666	L’emballage sur le récipient à billes indique que les billes ont un diamètre de 900 nm. Cependant, après diffusion de la lumière et microscopie électronique, nous avons déterminé que les billes ont un diamètre d’environ 700 nm.
Sous-unité B de la toxine cholérique, sondes moléculaires conjuguées Alexa 488		C-34775
Anticorps anti-oligodentrocytes IgM O4, conjugué NorthernLights 557	R& D Systems	NL1326R
FM1-43	Sondes moléculaires	T-3136
Centrifugeuse Eppendorf MiniSpin	Fisher Scientific	05-401-09