Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l'expression des gènes

Résumé

Nous décrivons l'utilisation d'un virus de la vaccine rapporteur fluorescent qui permet la mesure en temps réel de l'infectivité virale et l'expression des gènes par le biais de l'expression spécifique au stade de fluorophores spectralement distincts rapporteurs. Nous détaillons une méthode basée plaque pour identifier avec précision l'étape à laquelle la réplication du virus est affecté en réponse à petite molécule inhibition.

Résumé

Les poxvirus sont une famille de virus à ADN à double brin qui comprennent des agents pathogènes humains actifs tels que la variole du singe, le molluscum contagiousum et Contagalo virus. La famille comprend également le virus de la variole, de la variole. En raison de la complexité de la réplication du virus de la variole, de nombreuses questions restent encore en ce qui concerne leur stratégie de l'expression des gènes. Dans cet article, on décrit la conception et l'utilisation des virus de la vaccine recombinants qui permettent de mesurer en temps réel des étapes uniques et multiples de l'expression du gène viral dans un format à haut débit. Cela est rendu possible grâce à l'utilisation de protéines fluorescentes spectralement distinctes comme reporters pour chacune des trois étapes de la réplication virale. Ces virus constituent un rapport signal-bruit tout en conservant les modes de scène spécifiques d'expression, permettant des analyses basées sur plaque et observations microscopiques de la propagation du virus et la réplication. Ces outils ont des utilisations pour la découverte d'antiviraux, les études de l'interaction virus-hôte, et bio évolutivelogie.

Introduction

Traditionnellement, l'expression de virus est étudiée en utilisant des techniques de biologie moléculaire (par exemple de transfert de Northern, Western blot, hybridation microarray, etc) ^1. Bien que ces méthodes sont capables de fournir des informations détaillées en ce qui concerne la catégorisation des changements de l'expression des ARNm ou des protéines individuelles, ils ne sont généralement pas prêter à des processus en temps réel et à haut débit. Des approches alternatives à l'aide de journalistes basés sur la fluorescence ont été appliquées auparavant lorsque vous travaillez avec des poxvirus; Cependant, leur développ....

Protocole

1. Cellules de la plaque

1. Dissocier les cellules HeLa de la plaque et diluer dans un milieu de croissance (DMEM, 2 mM de L-surabondance, 10% de FBS) à environ 2,0 x 10 ⁵ cellules / ml. Distribuer 100 pl / puits dans une plaque à fond plat noir clair paroi de 96 puits (20 000 cellules / puits).
2. Incuber les cellules pendant 24 heures jusqu'à la confluence dans un incubateur à 37 ° C + 5% CO _2.

2. Infecter les cellules

1. Diluer virus et infecter les cellules.
   1. Dégel TRPV (virus Triple; début Vénus, intermédiaire mCherry, fin TagBFP) et PLV (promoteur-moins Vénus) virus fluo....

Résultats

A titre d'exemple de l'utilisation normale de ces virus, le virus triple fluorescence reporter a été utilisé pour comparer le point d'inhibition de plusieurs inhibiteurs de poxvirus bien définies.

Des cellules HeLa ont été étalées dans une culture tissulaire traitée claires des plaques à 96 puits à fond plat à parois noires et incubées pendant une nuit. Des monocouches confluentes ont été infectées à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 en utilisant soit virus rapporteur .......

Discussion

Ici, nous avons décrit l'utilisation pratique d'un virus de la vaccine reporter multi-étape (TRPV), qui fournit reproductibles, en temps réel des mesures de rétroaction de la réplication du virus. En utilisant des inhibiteurs de poxvirus bien définis, nous avons pu montrer que TRPV répond d'une manière compatible avec le mécanisme d'action compris pour chaque inhibiteur. Alors que le virus TRPV fournit l'information la plus complète à propos de la progression de la phase de virus, en deux étapes (IRE.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Sérum de veau fœtal - Optima, inactivé par la chaleur (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-Glutamine, (L-glut)	Gibco	25030-081
96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrène TC Treated Microplates	Corning	3603
384 Puits plat à fond transparent Polystyrène noir traité TC Microplaques	Corning	3712
Trypsine, 2X, stérile, irradiée	Worthington Biochemical Corp.	TRLVMF
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Gibco	10010-023
Dimethyl Sulfoxide, culture cellulaire (DMSO)	American Bioanalytical AB03091
1-&beta ;-D-Arabinofuranosylcytosine  ; (AraC), MW= 280 g/mol	SigmaAldrich Co	C6645
isatine &beta ; -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol	Fisher Scientific	NC9075202
rifampicine, MW= 823 g/mol	SigmaAldrich Co	R3501
ST-246, MW= 376 g/mol	SIGA Labs, Corvallis, OR
8 % Paraformaldéhyde (formaldéhyde) solution aqueuse	Microscopie électronique Sciences	157-8
TempPlate RT film optiquement transparent	USA Scientific	2978-2700
Opti-MEM Sérum réduit moyen	Gibco	31985-070