Purification non chromatographique de polypeptides recombinants élastine et de leurs fusions avec des peptides et des protéines Escherichia coli

Résumé

Polypeptides élastine sont des biopolymères de relance sensible avec des applications allant de la purification de protéines recombinantes à l'administration de médicaments. Ce protocole décrit la purification et la caractérisation de polypeptides d'élastine-like et leurs fusions peptidiques ou protéiques provenant d'Escherichia coli en utilisant leur comportement critique inférieure de transition de phase de la température de la solution comme une simple alternative à la Chromatographie.

Résumé

Polypeptides d'élastine sont des biopolymères tels que répétitives qui présentent un comportement critique inférieure de transition de phase de la température de solution, comme unimères solubles existant en dessous d'une température de transition caractéristique et en agrégeant coacervats l'échelle du micron au-dessus de leur température de transition. La conception de polypeptides de type élastine au niveau génétique permet un contrôle précis de leur séquence et de la longueur, qui dicte leurs propriétés thermiques. Polypeptides élastine sont utilisés dans une variété d'applications, y compris les biocapteurs, ingénierie tissulaire, et l'administration de médicaments, où la température de transition et de l'architecture de biopolymère du PEL peuvent être accordés pour l'application spécifique d'intérêt. En outre, le comportement de transition de phase de la température de solution critique inférieure de polypeptides d'élastine-like permet leur purification par leur réponse thermique, de telle sorte que leur coacervation sélective et resolubilisation permet l'élimination des contaminants à la fois solubles et insolubless suivant l'expression dans Escherichia coli. Cette approche peut être utilisée pour la purification seuls ou comme un outil de purification pour peptides ou de protéines fusions où des peptides ou des protéines recombinantes génétiquement annexées à étiquettes de polypeptide de type élastine peut être purifié sans chromatographie polypeptides de type élastine. Ce protocole décrit la purification de polypeptides de type élastine et de leurs peptides ou de protéines fusions et traite des techniques de base de caractérisation afin d'évaluer le comportement thermique de produits de polypeptides de type élastine pures.

Introduction

Polypeptides élastine (PEL) sont des biopolymères composé de la VPGXG pentapeptidique répétition où X, le résidu d'hôtes, est un acide aminé sauf la proline. PEL exposition température de solution critique inférieure (LCST) un comportement de transition de phase, de telle sorte qu'une solution homogène PEL va se séparer en deux phases lors du chauffage à la LCST qui est communément appelé la température de transition inverse (T _t) dans la littérature ELP ^1. Les deux phases sont constituées d'une phase très diluée de globule PEL et une phase riche en sédiment de ELP. Les riches sédiments PEL est formée sur une courte échelle de temps sur l'agrégation des chaînes de PEL en particules micrométriques qui fusionnent par la suite. Ce problème se produit dans une plage de un quelques degrés Celsius et est typiquement réversible, sous forme de solution homogène, on récupère lors de son retour à une température inférieure à la _{T t.}

PEL sont typiquement synthétisés dans Escherichia coli (E. coli) from un gène artificiel qui est ligaturé dans un plasmide d'expression. Ce plasmide est ensuite transformé dans un E. Lignée cellulaire coli qui est optimale pour l'expression de protéines. Nous avons utilisé exclusivement le système de vecteur T7-lac animal de compagnie pour l'expression d'une grande variété de PEL dans E. coli, bien que d'autres systèmes d'expression dans la levure ^{2-4, 5} champignons, plantes et ^6-8 ont également été utilisés par d'autres chercheurs. Un certain nombre d'approches existent pour construire génétiquement gènes PEL répétitives, y compris la ligature récursive directionnelle (RDL) ^9, récursif ligature directionnelle par la reconstruction de plasmide (pré-RDL) ^10, et se chevauchent prolongation amplification par cercle roulant (OERCA) ^11. La capacité de construire PEL au niveau génétique offre la possibilité d'utiliser des techniques de l'ADN recombinant pour créer PEL avec une variété d'architectures (par exemple, monoblocs, diblocs, triblocs, etc), qui peut encore être ajouté avec fonctionnellepeptides et protéines. Contrôle au niveau génétique garantit également que chaque PEL est exprimée par la longueur et la composition exacte dicté par son modèle de plasmide génétique, la fourniture de produits de biopolymères parfaitement monodisperses.

Les propriétés thermiques de chaque PEL dépendent des paramètres intrinsèques au biopolymère tel que son poids moléculaire (PM) et de la séquence, ainsi que des facteurs extrinsèques, notamment sa concentration en solution et la présence d'autres co-solutés, tels que des sels. La longueur du PEL ¹² et sa composition de résidus d'hôtes ^{1, 13, 14} sont deux paramètres orthogonaux dans la conception du PEL qui peuvent être utilisés pour contrôler la T _t, où les résidus de voyageurs hydrophobes et des longueurs de chaîne entraînent inférieure T _t s, tandis hydrophile résidus de voyageurs et des longueurs de chaînes plus courtes donnent une plus haute T _t s. Concentration PEL est inversement proportionnelle à la T _t, où des solutions de grconcentration mangeur de PEL ont inférieure T _t s ^12. Le type et la concentration de sels influencent aussi le PEL T _t, où l'effet de sels suite à la série de Hofmeister ^15. Anions kosmotropiques (Cl ^- et plus sur la série de Hofmeister) abaissent le PEL T _t et l'augmentation de la concentration en sel augmente cet effet. Ces paramètres intrinsèques et extrinsèques peuvent être ajustées pour obtenir un comportement thermique dans une plage de température cible qui est nécessaire pour une application spécifique d'un PEL.

Le comportement de stimulus-réponse de PEL est utile pour un large éventail d'applications, y compris les biocapteurs ^{16, 17,} ingénierie tissulaire ^18, et l'administration de médicaments ^{19, 20.} En outre, lorsque les PEL sont fusionnés à des peptides ou des protéines au niveau génétique, le PEL peut servir de marqueur de purification simple de proposer un procédé de traitement par lots peu coûteux pour la purification de pep recombinantmarées ou des protéines qui ne nécessite pas Chromatographie ^21. Modification du procédé de purification permet de s'assurer que l'activité du peptide ou de la protéine fusionnée à l'ELP est maintenue. Peptide ou protéine ELP fusions peuvent être purifiés pour des applications dans lesquelles le mot-clé PEL est utile ^{22, 23} ou en variante, lorsque la protéine ou le peptide libre est nécessaire, un site de reconnaissance de protéase peut être inséré entre le peptide ou la protéine et le PEL. Retrait de l'étiquette PEL peut alors être obtenue par digestion avec une protéase libre ou un PEL fusion de la protéase, lorsque celui-ci fournit la facilité supplémentaire de traitement comme une ronde finale de purification PEL peut séparer le PEL tag et protéase PEL fusion du peptide cible ou protéine en une seule étape ^{24, 25.} Le protocole suivant décrit la procédure de purification pour les PEL et les peptides ou protéines ELP fusions au moyen de leurs propriétés thermiques et traite des techniques de base pour caractériserla réponse thermique de produits de PEL.

Protocole

1. PEL Expression

1. Inoculer 3 ml de milieu Terrific Broth stériles avec un DMSO actions ou agar colonie de plaque de E. coli appropriée pour l'expression de la protéine qui contient le plasmide codant PEL désirée sous le contrôle du promoteur T7-lac. Ajouter l'antibiotique approprié et incuber à 37 ° C pendant la nuit (O / N) avec agitation continue à 200 rpm.
2. Ajouter 1 ml de la culture O / N pour 1 L de bouillon Terrific milieu stérile dans un ballon de 4 litres. Ajouter l'antibiotique approprié et incuber à 37 ° C pendant 24 heures avec agitation continue à 200 rpm. NOTE: L'expression «fuite» de base vu avec le promoteur T7-lac est suffisante pour l'expression de haut niveau de plusieurs PEL si la culture est incubée pendant 24 heures. Cependant, une approche plus classique peut être utilisé, dans lequel l'expression des protéines est en outre induite par l'addition de 0,2 à 1 mM d'isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) lorsque la densité optique de la culture atteint 0,6.
3. Transférer la culture à partir de la 4-L à un flacon de 1 L bouteille de centrifugation et centrifuger à 4 ° C pendant 15 min à 2000 x g.
4. Jeter le surnageant. REMARQUE: Si plus de 1 L de la culture est cultivé ils peuvent être condensés en ajoutant un autre litre de culture au culot et l'étape 1.3 répéter. Jusqu'à 2 L de la culture peut être condensé en un seul culot cellulaire.
5. Remettre en suspension le culot dans du tampon phosphate salin (PBS), de l'eau, ou un autre tampon désiré pour atteindre 45 ml de suspension cellulaire et transférer dans un tube conique de 50 ml.

2 PEL purification:. Étapes préliminaires et premier cycle de transition inverse vélo

1. Sonication du culot cellulaire remis en suspension pour un total de 9 min à des cycles de 10 sec "marche" et 20 secondes "arrêt" à une puissance de sortie de 85 W, tout en maintenant l'échantillon sur de la glace. Permettre brièvement l'échantillon refroidir sur glace, puis répéter le cycle 9 min une fois de plus. REMARQUE: Si le PEL est prévu d'avoir une très faible T _t l'intervalle "off" peut être augmenté jusqu'à 40 secondes pour éviter un échauffement de la solution au-dessus de la _{T t.}
2. Transférer le lysat à un rond de 50 ml tube de centrifugeuse bas.
3. Ajouter 2 ml de 10% (p / v) polyéthylèneimine (PEI) pour chaque litre de culture et agiter pour mélanger. REMARQUE: PEI est un polymère chargé positivement qui aide à la condensation des contaminants génétiques chargés négativement. Ne pas effectuer cette étape si le PEL est chargée négativement, comme le PEI peut aussi condenser et retirer le produit PEL.
4. Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 x g.
5. Transférer le surnageant dans un endroit propre de 50 ml tube à centrifuger fond et jeter le culot.
6. Option "cuire sur" étape: Incuber l'échantillon à 60 ° C pendant 10 minutes pour dénaturer les contaminants protéiques et puis transfert à 4 ° C ou à la glace jusqu'à ce que le PEL est complètement resolubilisée. Centrifuger l'échantillon à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 x g. Transférer le surnageant dans un clean 50 ml rondes tube à centrifuger fond et jeter le culot. NOTE: Ne pas effectuer cette étape si un peptide ou une protéine est fusionnée au PEL et on s'attend à dénaturer la condition de la chaleur élevée. Cela peut provoquer la transition PEL pour devenir chaleur irréversible ou peut détruire l'activité de la fraction fondue.
7. Induire la transition PEL avec l'ajout de cristallin NaCl (ne dépassant pas 3 M). En variante, le citrate de sodium (n'excédant pas 0,3 M) peut être utilisé pour les PEL qui ont plus élevée T _t de s ou de faibles rendements. NOTE: La solution doit devenir trouble une fois que le sel soit dissout, indiquant la séparation de phase du PEL de la solution. PEL très hydrophiles à haute _{T t} s peuvent nécessiter un certain degré de chauffage, en combinaison avec l'addition de sel, pour provoquer la séparation de phase du PEL dans cette induction préliminaire de la transition ELP.
8. Centrifuger à temperatue ambiante (RT) pendant 10 min à 16 000 xg (spin chaud). REMARQUE: Une pastille PEL be observé, dont la taille dépend du rendement de l'expression du PEL. Ce culot PEL peut apparaître au premier abord opaque, mais après refroidissement, il apparaît translucide et peut être de couleur brune. Le culot PEL deviendra plus incolore que des produits et contaminants purification sont supprimés.
9. Jeter le surnageant et ajouter 5.1 ml de tampon souhaitée de la pastille. Reprendre le culot par la pipette ou insérer le tube de tourner à 4 ° C. NOTE: Le volume de tampon requis dépendra de la taille de la pastille de PEL, et donc le rendement d'expression ELP, où une quantité suffisante de tampon doit être ajouté pour permettre la resolubilisation de la pastille ELP. PEL à haute teneur en cystéine de bénéficier de purification dans de l'eau avec du Tris 10 mM de chlorhydrate de (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP-HCl) à pH 7 afin d'éliminer les interactions disulfure avec des protéines contaminantes. PEL à haute teneur de charge bénéficient de purification à un pH ajusté pour neutraliser leur charge et réduire élémentctrostatic interactions avec les protéines contaminantes.
10. Transférer la solution remis en suspension PEL aliquots de 1 ml dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml propres.
11. Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 xg (de filage à froid). Une petite pastille de contaminants insolubles doit être observé.
12. Transférer le surnageant dans un tube propre et jeter le culot.

. 3 PEL Purification: Les rounds suivants de transition inverse vélo

1. Induire la transition PEL avec la chaleur et / ou l'ajout de NaCl. Les échantillons peuvent être mises en incubation sur un bloc chauffant ou dans un bain-marie pendant 15 min à une température supérieure à la _{T t.} Si, toutefois, le PEL est fusionné à une protéine (excluant l'utilisation de la chaleur) ou si le PEL a un T _t grande que ne peut pas être atteint avec la chaleur seule, une solution 5 M de NaCl peut être ajouté goutte à goutte à induire la transition PEL. NOTE: La solution doit devenir trouble, indiquant la séparation de phase de PEL de solution.
2. Centrifugeuse pendant 10 min à 16 000 xg (spin chaud). Si la chaleur a été utilisé dans l'étape 3.1, effectuer cette étape de centrifugation à une température supérieure à celle qui était nécessaire pour induire la transition ELP. Si NaCl seul a été utilisé dans l'étape 3.1, cette étape de centrifugation à température ambiante. NOTE: Une pastille PEL doit être observé.
3. Jeter le surnageant, ajouter 500-750 pi de tampon souhaitée, et remettre le culot par la pipette ou insérer le tube de tourner à 4 ° C.
4. Centrifuger à 4 ° C pendant 10 min à 16 000 xg (de filage à froid). Une petite pastille de contaminants insolubles doit être observé.
5. Transférer le surnageant dans un tube propre et jeter le culot.
6. Répétez les étapes 3.1 à 3.5 jusqu'à ce qu'aucun contaminant culot est observée lors de l'étape 3.4.

4. Traitement post-purification (facultatif)

1. Si vous le souhaitez, dialyser l'échantillon contre un tampon approprié pour éliminer l'excès de sel de la solution purifiée PEL. REMARQUE: PEL être lyophilisés doivent êtredialysées contre le trou DDH ₂ OO / N à 4 ° C.
2. Si on le désire, on lyophilise le PEL pour le stockage de longue durée par la congélation de la solution à -80 ° C pendant 30 min avant la lyophilisation O / N. NOTE: La lyophilisation doit pas être utilisé pour les PEL avec des protéines annexées.
3. Si vous le souhaitez, récupérer gratuitement peptide ou une protéine à partir d'un peptide ou une protéine PEL fusion en supprimant la balise PEL:
   1. Digérer le peptide ou une protéine PEL fusion avec une protéase biotinylé (tel que recommandé par le fournisseur de la protéase) ou avec une fusion protéase PEL correspondant au site de la protéase génétiquement conçu entre le peptide ou une protéine et PEL.
   2. Le cas échéant, retirez la protéase biotinylé en utilisant des billes de streptavidine modifiée (tel que recommandé par le fournisseur de la protéase).
   3. Induire la transition du PEL clivé et / ou protéase PEL fusion par l'addition goutte à goutte d'une solution 5 M de NaCl.
   4. Centrifuger à température ambiante pendant 10 min à 16 000 x g. NOTE: Une pastille PEL doit être observé.
   5. Recueillir le surnageant et jeter le culot PEL. Dialyser le surnageant contre un tampon désiré ou d'utiliser un filtre centrifuge pour effectuer un échange de tampon afin d'éliminer la forte concentration en sel du peptide pur ou une solution de protéine.
   6. Confirmer le clivage complet de libre peptide ou une protéine à partir de la balise PEL par le dodécylsulfate de sodium gel de polyacrylamide (SDS-PAGE).

5 Caractérisation:. SDS-PAGE

1. Préparer les échantillons de PEL pour SDS-PAGE en mélangeant 10 ul de PEL dilué dans de l'eau avec 10 ul de tampon d'échantillon contenant du 2-mercaptoéthanol. NOTE: 40 pg de PEL est souvent suffisante pour évaluer la taille et la pureté du produit PEL.
2. Incuber l'échantillon à 100 ° C pendant 2 min et ensuite charger sur un gel de polyacrylamide avec une échelle de protéines de taille appropriée.
3. Exécuter le gel à 180 V jusqu'à ce que le colorant se rapproche du fond du gel (environ 45 min).
4. Colorer legel avec une solution 0,5 M _CuCl2 pendant 5 min, tout en basculant. NOTE: PEL ne sont généralement pas visualisés par bleu de Coomassie tache, comme certaines séquences PEL n'interagissent pas avec ce colorant. Bleu brillant de Coomassie interagit principalement avec des résidus d'arginine et interagit faiblement avec d'autres résidus histidine-lysine et de base-et-aromatiques des résidus de tryptophane, la tyrosine, la phénylalanine et ^26. Ainsi PEL et peptides ou protéines ELP fusions peuvent être colorées avec Coomassie Brilliant Blue uniquement si leur séquence primaire comprend un nombre suffisant de ces résidus spécifiques.
5. Vérifiez que le PM de la bande PEL correspond à celle de la MW théorique attendue à partir du gène PEL et qu'aucune bande de contaminants étrangers sont présents. NOTE: Certaines PEL migrent avec un poids moléculaire apparent de 20% plus élevé que leur MW attendu ^{9, 27.}

6 Caractérisation:. Désorption laser assistée par matrice /ionisation à temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF-MS)

1. Préparer une solution ELP dans 50% d'acétonitrile aqueux contenant de l'acide trifluoroacétique à 0,1% pour atteindre une concentration d'environ ELP 25 uM. NOTE: Cette solution doit être exempte de sel, afin PEL doit être dialysée contre H ₂ O après purification.
2. Préparer une solution de matrice d'acide sinapinique saturé à 50% d'acétonitrile aqueux contenant de l'acide trifluoroacétique à 0,1%.
3. Ajouter 1 pi de la solution ELP à 9 pi de la solution de matrice pour parvenir à une concentration de PEL environ 2,5 pmol / ul. NOTE: Ce mélange peut être dilué avec une solution de matrice pour optimiser le signal de MALDI-TOF.
4. Caution 1-2 pi de mélange ELP-matrice sur une plaque MALDI de métal et de laisser la place sécher complètement.
5. Obtenir 5-10 spectres MALDI-TOF pour déterminer le rapport masse sur charge (m / z) du PEL et déduire son MW mesurée.

7. Characterization Température programmée Turbidimétrie et Dynamic Light Scattering

1. Déterminer le T _t du PEL par turbidimétrie température programmée:
   1. Préparer une série de dilution (par exemple, 5 à 100 uM) de solutions de PEL dans le tampon souhaité.
   2. L'utilisation d'un spectrophotomètre UV-Vis à température contrôlée, mesurer la densité optique (DO) à 350 nm dans une gamme de températures (par exemple, 20-80 ° C) à une vitesse de 1 ° C / min de chauffage. REMARQUE: Si aucune augmentation de la DO est considéré le T _t peut dépasser la limite supérieure de température de l'instrument. L'apparente _{T t} peut être diminuée par l'addition de NaCl. Commencez à 1 M de NaCl et d'augmenter par paliers de 0,5 M jusqu'à ce que la transition PEL est détectée dans une plage de température mesurable.
   3. Vérifier la réversibilité de la transition PEL en mesurant la diminution de l'OD sur la même plage de température à une vitesse de refroidissement de 1 ° C / min.
   4. Déterminer le T _t de l'homopolymère PEL en identifiant le point du profil de la turbidité de l'inflexion (OD tracée en fonction de la température). NOTE: Cette température peut être aisément définie à partir de la dérivée de la courbe de DO, où la température correspondant au maximum de la dérivée est calculée selon la _{T t.} Architectures PEL plus complexes affichent des profils de turbidité plus complexes et doivent être analysés plus comme décrit dans la section 7.2.
2. Caractérisation supplémentaire de PEL qui affichent des propriétés thermiques plus complexes (par exemple, les copolymères diblocs PEL qui s'auto-assemblent en micelles sphériques) est réalisé par diffusion dynamique de la lumière (DLS):
   1. Préparer une solution PEL dans le tampon souhaité faire passer l'échantillon à travers un filtre avec une taille de pores 20-450 nm. NOTE: Le choix de la taille des pores filtre dépendra de la présence, la taille et la stabilité de tous les assemblages de PEL en solution. La plus petite taille possible des pores du filtre est préférable d'éliminer les contaminants, tels quepoussière, qui diminuent la qualité des mesures DLS. Un filtre de plus grande taille des pores doit être utilisé lorsque la résistance importante est vécue lors du passage d'une solution PEL par le biais de plus petites tailles filtre de pores.
   2. Mesurer le rayon hydrodynamique (R _H) sur une plage de températures qui correspond à une région d'intérêt identifiés dans le profil de la turbidité. REMARQUE: unimères PEL ont généralement un R _H <10 nm, les assemblages de nanoparticules ont une R _H ~ 20-100 nm, et les agrégats ont une R _H> 500 nm. Chaque augmentation de R _H doit correspondre à une augmentation de la DO à 350 nm mesurée par spectrophotométrie UV-visible, en fonction de la température, qui est proportionnelle à la taille de la particule.

Résultats

Nous décrivons ici des résultats représentatifs pour la purification et la caractérisation d'un homopolymère et d'un PEL copolymère dibloc ELP. Après 24 h d'expression dans E. coli, les cellules sont recueillies par centrifugation et lysées par sonication. En général, un changement subtil de couleur commence après la sonication, la lyse des cellules confirmant suffisant (figure 1A). Après l'addition de PEI, les composants génomiques et les débris cellulaires sont récupérés par centrifugation, la séparation d'un grand culot de contaminants insolubles de la ELP soluble dans le surnageant (figure 1B). PEL est encore purifié par inverse cycle de transition (ITC), qui exploite le comportement LCST pour séparer le PEL de contaminants solubles et insolubles (figure 2) ^28. La transition de phase de l'ELP est déclenchée par l'addition de chaleur et / ou de sel. les résultats de la centrifugation dans la formation d'un culot au fond du tube qui est constitué d'un PELe certains contaminants insolubles (figure 1C). Cette étape appelée une chaude spin-rejets contaminants solubles dans le surnageant tandis que le culot PEL est conservé et remis en suspension dans un tampon froid. Le resolubilisée PEL est de nouveau centrifugé à 4 ° C. Cette étape appelée le rhume spin-rejets le culot de contaminants insolubles tandis que le surnageant contenant PEL soluble est conservée. Répéter le cycle d'alternance des tours chauds et froids augmente la pureté du PEL, mais au prix d'une légère baisse de rendement, comme PEL résiduelle est perdue à chaque tour ITC dans des tubes de centrifugation et sur les embouts de pipette.

Purification réussie de PEL et peptides ou de protéines fusions PEL est confirmée par SDS-PAGE. De petites aliquotes prises pendant le processus de purification démontrent la purification progressive de PEL de l'E. lysat coli. PEL est surexprimée dans E. brut coli lysat et contaminants diminuent l'esprith cycles successifs de l'ITC (Figure 3). Purifiée PEL apparaît comme une seule bande près de la MW théorique prédit.

Le PEL T _t est caractérisé par turbidimétrie température programmée. Le profil de la turbidité d'un homopolymère PEL présente une forte augmentation unique de DO à 350 nm (environ 2,0 unités au-dessus de base pour une concentration de 25 uM PEL) (figure 4A). Refroidissement des balayages de turbidité confirment la nature réversible de la transition ELP comme la DO retourne à la ligne de base lorsque la température est abaissée en dessous de la T _t (Figure 4B). PEL copolymères diblocs présentent un profil plus complexe de la turbidité, par rapport au homopolymère PEL. La DO augmente généralement la première à 0,1-0,5 unités au-dessus de base, après quoi les OD augmente fortement à 2,0 unités au-dessus de base (figure 5A). DLS mesures fournissent des informations sur le changement de R _H par rapport à la température, co rroborating l'information obtenue à partir du profil de turbidité (figure 5B).

Figure 1. D'épuration PEL préliminaire. Après 24 h d'expression, E. coli cellules sont collectées par centrifugation et remises en suspension dans du PBS. A) Les cellules sont lysées par sonication, qui est accompagnée par un changement subtil de couleur de telle sorte que le lysat s'assombrit après sonication. B) Après addition de PEI pour condenser les contaminants d'ADN, le lysat est centrifugée et un grand culot de débris insoluble est séparé du PEL soluble dans le surnageant. C) La transition PEL est induite par l'addition de chaleur et / ou de sel et des formes de centrifugation une pastille PEL translucide.ank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Inverse transition vélo. PEL est purifié par son comportement LCST de contaminants solubles et insolubles. En commençant par le PEL riche lysat (1) la transition PEL est induite par l'addition de chaleur et / ou de sel et le PEL est séparé par centrifugation (spin chaud) (2). Le culot est conservé ELP (3a), tandis que le surnageant contenant les contaminants solubles est jeté (3b). Le PEL est remis en suspension dans du tampon froid (4) et de nouveau centrifugé à 4 ° C (essorage à froid) (5). Le culot contenant les contaminants insolubles est éliminée (6a), tandis que le surnageant contenant PEL soluble est retenue (6b). Les cycles de rotations alternées chaudes et froides sont répétées jusqu'à ce que la pureté souhaitée est atteinte, telle que déterminée avecSDS-PAGE. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Analyse SDS-PAGE de PEL produits de purification. Purification réussie d'un PEL est confirmée par SDS-PAGE. Surexprimée PEL est évident dans le E. brut coli lysat après sonication (2). Après l'addition de PEI et centrifugation du PEL soluble est largement conservée dans le surnageant (3), bien que certains PEL est perdue dans le culot écarté de contaminants insolubles (4). Le surnageant après la première centrifugation à chaud contient des niveaux élevés de contaminants solubles (5). Surnageant après la première rotation froid indique une bonne séparation des PEL de contaminants insolubles (6). Cycles supplémentaires de chaud (7) et cvieux tourne (8) éliminer les contaminants solubles et insolubles résiduels, respectivement, jusqu'à ce que chaudes (9) et d'essorage à froid (10) les surnageants ne présentent pas de bandes finales de contaminants extérieurs, ce qui confirme la pureté satisfaisante du produit ELP. Cette homopolymère de PEL, avec une séquence de SKGPG (VGVPG) _80-Y, a un poids moléculaire attendu de 33,37 kDa. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Caractérisation des PEL homopolymère par turbidimétrie température programmée. L'PEL T _t est déterminée par le suivi de la DO à 350 nm tout en augmentant la température à une vitesse de 1 ° C / min. A) homopolymères de PEL présentent une forte augmentation unique OD que defines leur _{T t} à une concentration donnée. B) La réversibilité de la transition PEL est vérifié par surveillance de la DO à 350 nm d'une solution à 25 μ M, tout en diminuant la température, où la réversibilité est confirmée par le retour de l'OD au niveau de référence. Cette homopolymère PEL a la séquence SKGPG (VGVPG) _80-Y. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Caractérisation des PEL copolymère dibloc par turbidimétrie température programmée et la diffusion dynamique de la lumière. PEL qui subissent nano-échelle d'auto-assemblage, comme PEL copolymères diblocs qui s'auto-assemblent en micelles sphériques, des profils de turbidité plus complexes d'exposition. B) DLS mesures confirment le comportement déduit du profil de la turbidité pour un solution à 25 uM en fournissant des informations sur la variation de R _H par rapport à la température. Voici la unimère PEL a une R _H ~ 8 nm et la micelle a une R _H ~ 25 nm. Ce copolymère dibloc PEL a la séquence GCGWPG (VGVPG) ₆₀ - (AGVPGGGVPG) ₃₀ PGGS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

PEL offrent un moyen peu coûteux et sans chromatographie-de purification par l'exploitation de leur comportement de phase de stimulus-réponse. Cette approche tire parti du comportement LCST de PEL et de peptides ou de protéines PEL fusions d'éliminer les contaminants solubles et insolubles après l'expression de PEL codés génétiquement dans E. coli. Cette facilité de purification peut être utilisée pour produire des PEL pour une variété d'applications, ou peut être exploitée pour la purification de peptides ou de protéines recombinantes dans laquelle le PEL peut agir comme un marqueur de purification qui peut être enlevée avec un traitement post-purification.

Purification PEL implique des étapes préliminaires à lyser E. coli et éliminer les débris cellulaires insolubles et génomique à partir du lysat brut de culture (Figure 1), suivie de l'élimination des contaminants solubles et insolubles résiduelles par le CCI (figure 2). Centrifugation après le déclenchement de la transition PEL par l'ajouttion de chaleur ou de sel se sépare du PEL de contaminants solubles dans le surnageant, dans une étape appelée un spin chaud. Après resolubilisation du PEL, la solution est centrifugée à nouveau à une température inférieure à la _{T t} pour éliminer le contaminant culot insoluble, dans une étape appelée un spin froid. Alternant tours chauds et froids améliore la pureté de la solution PEL à chaque cycle, à un faible coût de céder. rendements de purification varient selon le PEL T _t, longueur, et des peptides ou des protéines de fusion. Typiquement, ce protocole donne 100 mg de PEL purifié par litre de E. culture coli, mais les rendements peuvent atteindre jusqu'à 500 mg / L. La pureté finale du produit PEL est confirmée par SDS-PAGE (figure 3). Le MW du PEL purifiée doit correspondre étroitement avec le MW théorique codée par le gène PEL. Cependant, certains PEL migrent en SDS-PAGE avec un poids moléculaire apparent allant jusqu'à 20% plus élevée que leur MW attendu ^{9, 27.} Une analyse plus précise du PELMW peut être obtenue par MALDI-TOF-MS, qui peut également fournir des informations supplémentaires sur la pureté du produit ELP ainsi que des techniques analytiques orthogonales telles que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC).

Après purification, le PEL T _t est mesurée par turbidimétrie température programmée. Cette technique surveille la densité optique d'une solution ELP tandis que la température est augmentée. Le T _t est dépendante de la concentration il est donc conseillé de caractériser une série de concentration pertinent pour l'application prévue du PEL. Pour PEL homopolymères le profil de turbidité présente une forte augmentation unique qui correspond à la transition du PEL de Unimer agrégats à l'échelle du micron (figure 4A). Le _{T t} est définie comme étant la température correspondant au point dans le profil de la turbidité de l'inflexion, précisément déterminé comme le maximum de la dérivée première de la DO à l'égard de la température. La réversibilité de l'ELP transition de phase est confirmée par une baisse de la DO à la ligne de base en tant que la température est abaissée en dessous de la T _t (Figure 4B). Le profil de la turbidité avec l'augmentation et la diminution des rampes de température varie en amplitude et la cinétique due à régler des coacervats PEL et hystérésis variable de PEL redissolution. Peptide ou protéine ELP fusions présentent un comportement similaire LCST de cette façon, où le peptide ou la protéine de fusion à l'ELP affecte la _{T t.} Pour les protéines ELP fusionne la transition est réversible en dessous de la température de fusion de la protéine. Alors que turbidimétrie température programmée est une excellente méthode pour la caractérisation thermique initiale des produits PEL, techniques alternatives, telles que la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), peut également être utilisé pour mesurer le PEL T _t.

PEL ayant des comportements thermiques des architectures plus complexes exposition plus complexes qui peuvent aussi être caractérisées par la température prograturbidimétrie MMed. PEL copolymères diblocs, par exemple, présentent un profil de turbidité caractéristique correspondant à leur auto-assemblage déclenché de température dans des micelles sphériques à leur température de micellisation critique. Pour ces copolymères diblocs PEL la DO augmente généralement la première 0,1-0,5 unités au-dessus de référence indiquant le passage de unimères de micelles, après quoi, une forte augmentation de la DO (2,0 unités par rapport au départ) à une température supérieure indique la formation de l'échelle du micron agrégats (figure 5A). Informations supplémentaires sur les structures PEL déclenché température auto-assemblées est obtenu avec DLS, une technique qui mesure la R _H d'ensembles de PEL en solution. Les variations de R _H conviennent en étroite collaboration avec les changements dans OD mesurées avec turbidimétrie (figure 5B). Unimères PEL présentent généralement un R _H <10 nm tandis que les ensembles de nanoparticules présentent une R _H ~ 20-100 nm et agrégats présentent une R _H > 500 nm. Informations supplémentaires sur les nanoparticules auto-assemblées PEL, tels que le nombre d'agrégation et de la morphologie, peut être obtenue par diffusion de lumière statique ou microscopie cryogénique électronique à transmission ^{17, 23, 29.}

En raison de l'accordabilité de propriétés thermiques PEL, une gamme de T _t s est obtenue par différents modèles de PEL. Il est important de garder à l'esprit que le propre T _t influencera l'optimisation du protocole de purification pour chaque PEL, où extrêmement basses ou élevées T _t s, il faudra le plus modification de ce protocole standard. PEL avec des températures de transition extrêmement élevées peuvent être inappropriés pour la purification de cette approche. Si la conception de nouveaux PEL et peptides ou protéines PEL fusions peut compromettre la réponse thermique du PEL, une étiquette histidine simple peut être inclus pour la purification de remplacement par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé. De plus,caractéristiques de la séquence PEL peuvent nécessiter une modification de ce protocole si le résidu d'hôtes est chargée. Manipulation du pH du tampon peut être utilisé comme une méthode pour modifier la charge globale du PEL dans un effort pour éliminer les interactions électrostatiques avec les contaminants ^17. En outre, ce protocole est appropriée dans le cas particulier des fusions PEL avec des peptides et des protéines lorsque des mesures appropriées sont prises pour s'assurer que le processus de purification ne perturbe pas l'activité du groupe fusionné. Remarques à travers le protocole relatif à ces modifications servent à diriger la purification des PEL qui peuvent présenter ces défis par rapport à T _t, charge, ou de fusion préoccupations.

La purification de PEL par le biais de leur comportement LCST présente une approche simple et gratuit Chromatographie à purifier la majorité des PEL et de peptides ou de protéines PEL fusions exprimé dans E. coli. Le protocole résumées ici permet de purifier of PEL en un seul jour à l'aide de l'équipement qui est commun à la plupart des laboratoires de biologie. La facilité de purification des PEL et leurs fusions sera, nous l'espérons, encourager une diversité toujours croissante de modèles de PEL pour de nouvelles applications en science des matériaux, la biotechnologie et la médecine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
pET-24a(+) pET-25b(+)	Novagen	69749-3 69753-3	T7-lac résistants à la kanamycine (pET-24) ou à l’ampicilline (pET-25).
Cellules ultra compétentes BL21 (DE3)	Edge BioSystems	45363	Compétentes E. coli pour l’expression des protéines recombinantes.
Terrific Broth (TB) Milieu de croissance en poudre sèche	MO BIO Laboratories	12105	Le milieu est reconstitué en DI H2O et autoclavé avant utilisation.
Isopropyl-bêta-D-thiogalactoside (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	L’IPTG est reconstitué en DI H2O, filtré de manière stérile et ajouté à des cultures pour induire une expression améliorée.
Comprimé de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Calbiochem	524650	Ces comprimés de PBS, lorsqu’ils sont dissous dans 1 L de DI H2O, produisent un tampon de phosphate de 10 mM avec 140 mM de NaCl et de 3 mM de KCl avec un pH de 7,4 à 25 °C.
Solution de polyéthylèneimine (PEI) (~50 % p/v)	MP Biomedicals	195444	PEI est préparée sous forme de solution à 10 % (p/v) dans du H2O désionisé.
Nalgene Oak Ridge Tubes à centrifuger à grande vitesse, 50 ml	Thermo Scientific	3138-0050	Ces tubes à fond rond résistent à une centrifugation à grande vitesse de 30 à 50 ml.
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP-HCl)	Thermo Scientific	20491	Une solution mère de TCEP-HCl est préparée à 100 mM dans du DI H2O et ajustée à pH 7,0. Pour les PEL à forte teneur en cystéine, la solution mère de cet agent réducteur est ajoutée à la pastille de PEL pour atteindre 10 mM en H2O.
Ready Gel Gel Tris-HCl, gel polyacrylamide à gradient linéaire 4-20 %, 10 puits, 30 &mu ; l	Bio-Rad Laboratories	161-1105	Ces gels à gradient linéaire offrent une bonne visualisation des ELP avec une gamme de MW.
Chlorure cuivrique dihydraté (CuCl2· ; 2H2O)	Fisher Scientific	C454-500	Une solution filtrée de 0,5 M est préparée pour la coloration négative des gels de polyacrylamide Tris-HCl.
Filtre à seringue Anotop 10 : 0.02 &mu ; m 0.1 &mu ; m 0.2 &mu ; m	Whatman	6809-1002 6809-1012 6809-1022	Ces filtres pour seringue de 10 mm de diamètre permettent de préparer de petits volumes pour les mesures DLS.
Filtre Millex-HV : 0,45 &mu ; m	EMD Millipore	SLHVX13NK	Ces filtres à seringue de 13 mm de diamètre permettent de préparer de petits volumes de solutions avec de grands assemblages de nanoparticules pour les mesures DLS.