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Article de méthode
Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont un grand potentiel pour l'étude du développement embryonnaire humain, pour la modélisation des maladies humaines dans le plat et comme une source de cellules transplantables pour des applications de régénération après la maladie ou les accidents. Les cellules de la crête neurale (CN) sont les précurseurs pour une grande variété de cellules somatiques adultes, comme les cellules du système nerveux périphérique et les cellules gliales, les mélanocytes et les cellules mésenchymateuses. Ils sont une source précieuse de cellules pour étudier les aspects du développement embryonnaire humaine, y compris la spécification du destin cellulaire et la migration. En outre la différenciation de cellules progénitrices CN en types de cellules à différenciation terminale offre la possibilité de modéliser les maladies humaines in vitro, étudier les mécanismes de la maladie et de générer des cellules pour la médecine régénératrice. Cet article présente l'adaptation d'un protocole in vitro de différenciation actuellement disponibles pour la dérivation de cellules NC de hPSCs. Ce nouveau protocole nécessite 18 jours de différenciation, est facilement extensible et hautement reproductible entre cellules embryonnaires humaines (CSEh souches) des lignes ainsi que les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) des lignes sans chargeur. Les anciens et les nouveaux protocoles donnent des cellules NC de l'identité égale.
Introduction
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) ont montré un immense potentiel, en particulier pour l'enquête et le traitement futur des maladies humaines, pour laquelle aucun des modèles animaux de bonnes ni de tissus primaires sont disponibles. Exemples d'applications pour la technologie CSEh / hiPSC sont les suivantes: les cellules d'intérêt particulier peuvent être générés à partir de CSEh / hiPSCs pour la médecine régénérative à une quantité illimitée. Les cellules peuvent être produites à partir de patients porteurs d'une maladie spécifique et utilisées pour établir des <....
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Protocole
1. Préparation de milieux de culture, des boîtes recouvertes et entretien de hPSCs
Préparation 1.1 Médias
Remarque: Filtrez tous les médias pour la stérilisation et conserver à 4 ° C dans l'obscurité pendant 2 semaines. noms de réactifs, la société et numéros de catalogue sont répertoriés dans le tableau des matières.
- DMEM/10% de FBS: Mélanger 885 ml de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml Pen / Strep et 5 ml de L-glutamine.
- HES-moyen: Mélanger 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml de L-glutamine, 5 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution essentielle d'acides aminés, de 1 ml ....
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Résultats
Les deux améliorations les plus importantes du protocole R-NC-dessus du protocole MS5-R-CN 11 sont les conditions de différenciation, définies libre-desserte et le raccourcissement global de l'exigence de délai. MS5 cellules nourricières 13 sont des cellules murines de moelle osseuse provenant stromales qui ont été présentés à l'appui différenciation neurale de CSEh 14. HESCs cultivées sur des cellules nourricières MS5 à former des structures épithéliales de faible densité et des.......
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Discussion
Pour la différenciation réussie de cellules R-NC de CSEh / hiPSCs les considérations suivantes doivent être prises. Il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles à tout moment. En particulier, il est important de tester les cultures HPSC pour contamination par des mycoplasmes régulièrement, depuis cette contamination va entraver la différenciation réussie, mais ne peut pas être facilement détecté visuellement dans les cultures HPSC. La différenciation R-NC doit être instauré à la densité cellula.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont aucun intérêt à divulguer contradictoires.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par une bourse pour chercheurs avancés du Fonds national suisse de la science et par des subventions de NYSTEM (C026446; C026447) et l'initiative sur les cellules souches Tri-institutionnel (Fondation Starr).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Sérum fœtal de veau (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Remplacement du sérum knockout | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Le lot doit être testé |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Pénicinline/Streptomycine | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| Solution d’acides aminés essentiels minimaux MEM ; | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| &beta ;-Mercaptoéthanol ; | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxique |
| Recombinant humain FGF basique (FGF2) | R& D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 poudre ; | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Bicarbonate de sodium ; | Sigma | S5761 | |
| APO transfert humain | Sigma | T1147 | |
| Insuline humaine ; | Sigma | I2643 | |
| Dichlorhydrate de putriscine | Sigma | P5780 | |
| Sélénite | Sigma | S5261 | |
| Progestérone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrice | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Bromhydrate d’ornithine | Sigma | P3655 | |
| Laminine-I de souris | R& ampère; D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectine | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase dans la solution saline équilibrée de Hank 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsine-EDTA ; | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dichlorhydrate | Tocris-R& D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Acide ascorbique ; | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R& D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R& D Systems | 423-F8 | |
| Souris recombinante sonic hedgehog (SHH) | R& D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| EGF humain recombinant | R& Gélatine D Systems | 236EG | |
| (PBS sans Mg/Ca) | interne | ||
| Anticorps : | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | le lot doit être testé |
| Anti-p75 mIgG1 (récepteur du facteur de croissance nerveuse) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | le lot doit être testé |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot doit être testé |
| AlexaFluor 488 chèvre anti-souris IgG1 ; | Le lot d’Invitrogen | A21121 | doit être testé |
| Anti Oct4 mIgG2b (utilisé à une dilution de 1:200) | Le lot Santa Cruz | sc-5279 | doit être testé |
| Matériel/Équipement : | |||
| Fibroblastes embryonnaires de souris (7 millions de cellules/flacon) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Boîtes de culture cellulaire : plaques de 10 cm et 15 cm, tubes à centrifuger, tubes FACS, pipettes, pipette | |||
| en verre | |||
| Centrifugeuse | |||
| Incubateur de culture cellulaire (CO2, humidité et température contrôlées) | |||
| Hotte à flux laminaire de culture cellulaire avec microscope | |||
| Capot | de biosécurité pour la culture cellulaire | ||
| Trieuse cellulaire, i.e. MoFlo | |||
| Microscope | |||
| 1 ml TB seringue 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Élévateur de cellules Polyéthylène | Corning Incorporated | 3008 |
Références
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
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Réimpressions et autorisations
