Ce protocole décrit une procédure de prélèvement en série de moelle osseuse fémorale (BM) sans nécessiter le sacrifice de souris. Cette procédure facilite les études longitudinales de la composition en BM des souris au fil du temps et fournit un accès en série aux cellules à l’intérieur de la BM pour les études ex vivo et de transplantation.
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Article de méthode
Fémorale aspiration de moelle osseuse chez des souris en direct
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’échantillonnage en série de la composition cellulaire de la moelle osseuse (BM) est une procédure de routine essentielle à l’hématologie clinique. Ce protocole décrit une procédure technique détaillée, étape par étape, pour une procédure analogue chez la souris vivante qui permet la caractérisation en série des cellules présentes dans la BM. Cette procédure facilite les études visant à détecter la présence de cellules administrées de manière exogène dans la BM de souris, comme cela serait fait dans les études de xénogreffe par exemple. De plus, cette procédure permet de récupérer et de caractériser des cellules enrichies en BM telles que les cellules souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices (HSPC) sans sacrifier les souris. Étant donné que la composition cellulaire du sang périphérique ne reflète pas nécessairement les proportions et les types de cellules souches et progénitrices présentes dans la moelle osseuse, les procédures qui permettent d’accéder à ce compartiment sans nécessiter l’élimination des souris sont très utiles. L’utilisation de l’aspiration de la moelle osseuse fémorale est illustrée ici pour l’analyse cytologique des cellules de la moelle osseuse, la caractérisation cytométrique en flux du compartiment souche/progéniteur hématopoïétique et la culture de HSPC triées obtenues par aspiration de la moelle osseuse fémorale par rapport au prélèvement de moelle conventionnelle.
Introduction
Toutes les cellules sanguines sont dérivées de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Les procédures qui permettent d’accéder à la moelle osseuse (BM), le site de la grande majorité des CSH chez la souris et l’homme, sans nécessiter de sacrifice d’animaux, fournissent une ressource pour surveiller la source de l’hématopoïèse en série. L’objectif général de la procédure décrite ici est de fournir un protocole détaillé pour l’échantillonnage des cellules BM du fémur de souris vivantes qui fournit du matériel représentatif des cellules qui seraient récupérées par la récolte conventionnelle de cellules BM par le sacrifice des souris. L’avantage de cette procédure par rapport à la récolte conventionnelle de cellules BM est qu’elle ne nécessite pas le sacrifice de souris et permet donc une étude longitudinale de la moelle osseuse des souris au fil du temps.
Bien que cette procédure d’aspiration de la moelle osseuse murine ait été utilisée dans un certain nombre d’études et décrite précédemment (voir Sundberg et al. pour une revue historique1), des procédures formelles étape par étape illustrant cette technique n’ont pas été publiées auparavant. Ce protocole permet un échantillonnage en série régulier du BM à des fins telles que l’évaluation de la greffe dans le BM de cellules introduites de manière exogène chez la souris (comme cela serait fait dans les études de xénogreffe par exemple2,3), l’analyse du chimérisme dans le BM pour comparaison avec celui du sang périphérique (où les résultats ne sont pas nécessairement congruents), le suivi de l’abondance de types de cellules spécifiques normalement enrichis dans la moelle tels que les cellules souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices, et le prélèvement de cellules BM à des fins de culture et/ou de transplantation ex vivo. De plus, l’évaluation du contenu de la moelle osseuse peut être très utile dans les modèles murins de maladie hématologique, car l’aspiration est utile pour évaluer le fardeau de la maladie hématologique à des moments où la maladie peut ne pas être évidente dans le sang périphérique3-5. De plus, cette technique peut être utilisée pour évaluer la réponse des maladies hématologiques de la moelle osseuse aux médicaments administrés dans le cadre d’études thérapeutiques. Ainsi, la procédure décrite ici est idéale pour les chercheurs souhaitant obtenir l’accès aux cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse de souris pour l’analyse cytologique, l’analyse cytométrique en flux, la culture in vitro et/ou les études de transplantation in vivo sans nécessiter de sacrifice ou de préjudice aux souris.
Le protocole de prélèvement de BM décrit ici est assez similaire à la technique utilisée pour l’injection intra-fémorale de matériel directement dans la cavité médullaire3,6. La principale différence est que ce protocole détaille la procédure de prélèvement des cellules de la moelle par opposition à l’instillation de matériel directement dans l’espace de la cavité de la moelle comme c’est le cas avec l’injection intrafémorale.
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Protocole
Toutes les procédures d'animaux décrits dans le présent protocole ont été menées en conformité avec les lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. D'aspiration de la moelle osseuse (BM) Les cellules de la cuisse
- Anesthésier la souris qui va subir fémorale aspiration de la moelle osseuse à l'isoflurane (1-4%) administré avec un vaporisateur de précision. Profondeur de l'anesthésie doit être surveillée tous les 5-10 minutes tout au long de la procédure en faisant observer qu'il n'y a pas de changement de la fréquence respiratoire associée à la manipulation chirurgicale et / ou de l'oreille, orteil, et pincement de la queue. L'anesthésie est induite par l'isoflurane et a également maintenu tout au long de la procédure à l'isoflurane. Une dose de pré-procédure de préemption de la buprénorphine à une dose de 0,05-0,1 mg / kg par voie sous cutanée toutes les 6-12 heures peut être utilisé pour prévenir la douleur associée à la procédure comme un adjl'équipe de pays de l'Carprofen.
- Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de la souris après l'induction de l'anesthésie pour éviter le dessèchement de la cornée.
- La fourrure est soigneusement coupée à partir d'une zone de peau d'environ 150% supérieure à la surface du site d'aspiration prévue. Fourrure en vrac est enlevé avec un tampon de gaze humide. S'il vous plaît garder la souris sur un tapis de l'eau chaude circulant ou autre surface thermostatique sécurité pour éviter l'hypothermie au cours de la procédure.
- Désinfecter la jambe entière contenant le fémur qui fera l'objet aspiration avec trois ensembles de gommages alternance (en alternance avec soit une povidone-iode (Bétadine) ou une chlorhexidine (Nolvasan) gommage et 70% d'alcool isopropylique ou éthanol à 70% imbibé de compresses de gaze).
- Mouiller une seringue 0,5 ml de tuberculine (volume: 0,5 cm; jauge: 27,5 G) avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) avant d'aspirer la BM. Remplir la seringue avec 200-500 ul de PBS et d'expulser immédiatement le PBS. Répétez cette procédure 2-3 times.
- Gardez la pente tibiale du fémur en appuyant sur le tibia soit avec la bague au doigt ou le cinquième doigt. Assurez-vous que le plan anesthésique approprié a été atteint. La seringue est tenue à l'aide du pouce et de l'index. Ceci permet aux condyles d'être exposés et facilite l'insertion de l'aiguille.
- Après avoir mouillé la seringue, insérer l'aiguille dans le tendon rotulien de sorte que l'aiguille est introduite en toute sécurité entre les deux condyles du fémur. En maintenant la diaphyse à proximité de l'épiphyse du fémur avec le pouce et l'index, l'aiguille est insérée dans le corps du fémur facilement.
- Faire pivoter l'aiguille vers l'extérieur et vers le haut de sorte qu'elle est parallèle à l'axe du fémur. Cette action facilite l'extraction du contenu de la moelle osseuse à partir de l'axe du fémur.
- Mettez l'aiguille dans le sens horaire et anti-horaire tout en poussant lentement dans la cavité de la moelle osseuse du fémur. Confirmer le bon positionnement de l'aiguille en déplaçant doucement le syRinge latéralement.
- Tirez doucement sur le piston de l'aiguille en arrière, créant une pression négative, tout en déplaçant l'aiguille d'avant en arrière dans la cavité BM. Remarque: le volume aspiré de la BM sera d'environ 5 pi qui correspond typiquement à 0,4 à 0,8 x 10 6 cellules mononucléaires. Aspiration retenu doit être confirmée visuellement par l'apparition de sang dans la partie supérieure de l'aiguille dans le fond de la seringue. En l'absence de sang est vu dans la seringue, il est probable que d'un petit fragment de l'os ou du tissu est coincé dans l'aiguille. Ceci peut être retiré de l'aiguille en déplaçant le piston vers le haut et vers le bas dans le PBS (c'est une des raisons pourquoi la seringue doit être prérempli avec du PBS avant d'aspirer la BM). Si le tissu ne peut être délogé de la seringue, utiliser une nouvelle aiguille et la seringue (nouveau mouiller la seringue avec 200-500 ul de PBS).
- Une fois BM est aspiré avec succès du fémur, retirez l'aiguille et la seringue du fémur et de la souris.
- Déplacez aspiré BM à un pr tube de centrifugeuseefilled avec 500 ul de PBS. Pour la plupart des applications, les cellules BM devraient ensuite être conservé sur de la glace jusqu'à ce que le traitement ultérieur si possible.
- Après l'achèvement de la procédure, le carprofène administrer un analgésique à 5 mg / kg par voie sous cutanée. Ensuite, retirer la souris de l'anesthésie et les déposer sur un coussin chauffant jusqu'à ce que complètement rétabli. REMARQUE: Il devrait y avoir aucune complication ou détresse vécue en suivant la procédure d'aspiration si c'est fait correctement.
- Avant de retourner la souris pour le domaine du logement, de s'assurer qu'ils sont capables de déambuler et d'atteindre la nourriture et de l'eau. Observez la souris pour des signes de détresse ou de la procédure après l'infection dans le 24 heures suivant. Les signes comprennent: saignement constant, l'anémie, de la léthargie. Si l'un de ces signes apparaît procédure de post, l'animal (s) devrait être euthanasié. Remarque: BM aspiration / d'échantillonnage peut être répété, mais la procédure de répétition doit être effectuée sur le fémur opposée pour empêcher un traumatisme répété de la même jambe. Il ya peu d'informations disponibles sur le frequency BM que l'aspiration peut être effectuée. Fémorale aspiration de la moelle osseuse est généralement répété pas plus souvent que toutes les 2 semaines.
2. L'évaluation de contenu cellulaire dans les cellules aspiration BM
- cellules à granules extraites de BM aspiration et placer dans un tube de centrifugeuse par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 o C ou RT.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul de sang rouge ACK lyse cellulaire tampon ("ammonium chlorure de potassium" tampon de lyse).
- Incuber les cellules dans un tampon de lyse des globules rouges pendant 10 minutes, puis ajouter 1 ml de PBS et centrifuger à nouveau le mélange à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C ou à la température ambiante. Remarque: Le culot lysées de globules rouges se compose désormais de cellules mononucléaires BM. Ceux-ci peuvent être remises en suspension de coloration FACS, le comptage des cellules, la transplantation, l'analyse de cytospin et / ou toute autre utilisation (comme les cellules BM récoltées à partir de souris sacrifiées seraient utilisés).
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Résultats
Fémorale BM aspiration d'une souris C57/B6 direct a été utilisé pour obtenir des cellules mononucléées BM suivie par la récolte de la BM conventionnel de la même souris, après sacrifice. Cellules mononucléaires BM obtenus par les deux méthodes ont ensuite été analysées par (1) l'analyse cytologique des cellules de MO, (2) la détermination de la fréquence relative des cellules souches / progénitrices hématopoïétiques (HSPCs), et (3) la culture ex vivo de HSPCs triées. Dans l'expérience ci, lignée nég...
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Discussion
Serial aspiration BM est une procédure de routine critique à l'investigation clinique des troubles hématologiques chez les humains. La possibilité d'effectuer un échantillonnage de série analogue de BM dans les souris pour la caractérisation de la composition cellulaire et constituants de BM à travers de longues expériences est également très précieux. Cette procédure est utile pour la caractérisation de HSPC, sans sacrifier de la souris, mais également pour la détection de la présence de types de cellules suppl...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
O.A.-W. est soutenu par une bourse NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), une bourse postdoctorale du U.S. Department of Defense Fellow en recherche sur l’insuffisance de la moelle osseuse (W81XWH-12-1-0041), le Josie Roberston Investigator Program et une Damon Runyon Clinical Investigator Award avec le soutien de la Fondation Evan.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Albumine sérique bovine | PAA | K41-001 | |
| Tampon de lyse ACK Fait | maison | dans 1 L. Ajuster le pH 7,2 ~ 7,4 et filtrer stérile avec 0,22 &mu ; Filtre à vide M. | |
| 8,3 g Chlorure d’ammonium | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Bicarbonate de potassium | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 &mu ; l 0,5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0,5 ml Seringue à tuberculine 27,5 g | Becton Dickinson | 305620 | |
| Passoire à cellules stériles 70 &mu ; m | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC :66794-014-25 | |
| Aiguille à extrémité arrondie | Stemcell Technologies | 28110 | |
| Aiguille PrecisionGlide 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| Seringue Luer-Lok de 3 ml | Becton Dickinson | 309657 | |
| Plaque non traitée pour culture tissulaire, 6 puits | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 tubes de 75 mm 5 ml ; | Coloration FACS | Becton Dickinson | 352054 |
| 12 tubes de 75 mm 5 ml avec capuchon de filtre cellulaire | Coloration FACS | 352235 | Becton Dickinson |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | ||
| Ly-6G et Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | ||
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4&prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | Pour la culture de la méthocellulose |
| Carprofène | Crescent Chemical L’entreprise | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) ; |
| Cytomètre en flux, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vetement (pommade ophtalmique stérile à la vaseline) | Dechra-US | 17033-211-38 |
Références
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
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Réimpressions et autorisations
