Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.
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Article de méthode
In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie
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Résumé
Résumé
Nous avons développé et validé une méthodologie pour le suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) avec une résolution spatiale et temporelle pour étudier dans l'hématopoïèse in vivo en utilisant la greffe de moelle osseuse modèle expérimental murin marquage fluorescent. Marquage utilisant des vecteurs lentiviraux codant pour des protéines fluorescentes (PC) combinatoire génétique activé cartographie du destin cellulaire grâce à l'imagerie par microscopie de pointe. Vecteurs codant pour cinq médecins de famille différents: Cerulean, EGFP, Vénus, tdTomato, et mCherry ont été utilisés pour la transduction simultanément HSPCs, la création d'une palette variée de cellules de couleur marquée. Imagerie confocale / microscopie à deux photons hybride permet simultanée évaluation à haute résolution de cellules marquées unique et leur progéniture en association avec des composants de structure des tissus. Analyse volumétrique sur de grandes surfaces révèlent que les cellules dérivées de HSPC spectralement codées peuvent être détectées de manière non invasive dans divers tissus, y compris les intactes de la moelle osseuse (BM), Pendant de longues périodes de temps après la transplantation. Études en direct combinant multiphotonique vidéo-taux et imagerie confocale time-lapse en 4D démontrent la possibilité de suivi cellulaire clonale et dynamique de manière quantitative.
Introduction
La production de cellules sanguines, appelé hématopoïèse, est maintenue par une petite population de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (hspC). Ces cellules se trouvent dans la moelle osseuse (BM) dans un créneau de microenvironnement complexe constitué des ostéoblastes, les cellules stromales, le tissu adipeux, et les structures vasculaires, tous impliqués dans le contrôle de l'auto-renouvellement et de différenciation 1,2. Comme intact BM a toujours été inaccessible à l'observation directe, les interactions entre les CSPS et leur microenvironnement reste largement non caractérisés in vivo. Auparavant, nous avons établi un....
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Protocole
Toutes les souris ont été logés et manipulés conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health, et inscrits dans un protocole de soins et d'utilisation des animaux NHLBI approuvé par le Comité. Femme B6.SJL-PTPRC (d) pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) et C57BL / 6 souris, 6-12 semaines, ont été utilisés comme donneur et le receveur, respectivement.
Une liste des matériaux, les réactifs et le matériel est fourni dans le tableau 1.
1. LEGO transduction de souris HSPCs et greffe de moelle osseuse
Exécuter les ....
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Résultats
L'ensemble du montage 3D confocale / 2 photons microscopie reconstitutions de l'évolution temporelle de la moelle osseuse du sternum a révélé la prise de greffe et de l'expansion de co-5fps transplantés dans un modèle avec des caractéristiques remarquables: clones semblaient clairement délimitée, homogène marqués avec une large palette de couleurs d'abord et le progrès au fil du temps pour contenir préférentiellement les cellules de la plupart une couleur. Configuration de la microscopie confocale, et de.......
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Discussion
Nous décrivons ici les détails d'une méthodologie puissante récemment conçu pour le suivi des cellules clonales, combinant la grande diversité générée par marquage avec 5FP codant vecteurs Lego et imagerie en tandem microscopie confocale et 2 photons pour atteindre volumétrique et imagerie dynamique dans les tissus vivants combinatoire. Cette étendue d'utilisation du marquage par l'enregistrement de l'identité spectrale confocale à 5 canaux "distincts" 8-bits couleur à base de FP. Ainsi, le rap.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros de l’Institut national du cœur, des poumons et du sang des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions Boris Fehse (Centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf, Hambourg, Allemagne) pour la fourniture des cinq plasmides vectoriels LeGO ; Christian A. Combs et Neal S. Young (NHLBI, NIH) pour les discussions, le soutien et les encouragements tout au long de cette étude, et Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) pour l’aide pour les injections dans la veine de la queue.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Production de virus | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression de Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression de eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression de Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression de tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression de mCherry |
| Calciumm Kit de transfection de phosphate | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Boîte de culture tissulaire | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Sérum de veau fœtal Inactivé par la chaleur | Sigma | F4135-500ML | |
| Stylo streptocoque Glutamine | Gibco, Life Technologie | 10378-016 | |
| Tubes à centrifuger | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifugeuse | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Filtre à seringue Unite (0.22 µ ; m) | Millipore | SLGS033SS | |
| Collecte de cellules de souris, purification, transduction et transplantation | |||
| ACK tampon de lysing | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Kit d’appauvrissement des cellules de lignée (souris) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS colonnes + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Filtres de pré-séparation (30 µ ; m) | Miltenyi Biotec Inc. États-Unis | 130-041-407 | |
| Milieu sans sérum StemSpan SFEM pour la culture et l’expansion de cellules hématopoïétiques (500 ml) | StemCell Technologies Inc ; | 9650 | |
| Murin IL-11 CF | R & D Systems | Inc 418-ML-025/CF | 100 et micro ; g/ml est de 1 000 x |
| murin recombinant SCF | RDI Division de Fitzgerald Industries Intl ; | RDI-2503 | 100 et micro ; g/ml est 2 000x |
| IL-3 murin recombinant | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 & micro ; g/ml est de 2 000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. États-Unis | 130-096-480 | 100 µ ; g/ml est de 1 000 plaques |
| à 12 puits, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspension à 50 & micro ; g/ml |
| Sulfate de protamine | Sigma | P-4020 | 4 & micro ; g/ml est de 1 000x |
| Microscopie confocale et à deux photons | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Plat de culture à fond en verre P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Plat de culture à fond en verre P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Verre de protection en borosilicate ; 4 puits | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS Microscope confocal et multiphotonique à cinq canaux | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph Gamme laser 680-1 080 nm | Chameleon Coherent | ||
| Compact OPO Gamme laser 1 030-1 350 nm | Objectif d’immersion | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA (WD=2,5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA Objectif sec (WD=0,6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA Objectif à immersion dans l’eau (WD=0,6 mm) | Logiciel Leica Microsystems | ||
| Imaris version 7.6 | Bitplane |
Références
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
