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Article de méthode

In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie

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⸱

DOI :

10.3791/51669

⸱

6 août 2014

 ,  , 
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

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Résumé

Combinatoires 5 protéines fluorescentes de marquage des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques permet in vivo suivi clonale par confocale et microscopie à deux photons, apportant des éclairages sur la moelle osseuse hématopoïétique architecture lors de la régénération. Cette méthode permet de cartographier de sort non-invasif des cellules HSPCs dérivés spectrale codés dans des tissus intacts pour de longues périodes de temps après la transplantation.

Résumé

Nous avons développé et validé une méthodologie pour le suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPCs) avec une résolution spatiale et temporelle pour étudier dans l'hématopoïèse in vivo en utilisant la greffe de moelle osseuse modèle expérimental murin marquage fluorescent. Marquage utilisant des vecteurs lentiviraux codant pour des protéines fluorescentes (PC) combinatoire génétique activé cartographie du destin cellulaire grâce à l'imagerie par microscopie de pointe. Vecteurs codant pour cinq médecins de famille différents: Cerulean, EGFP, Vénus, tdTomato, et mCherry ont été utilisés pour la transduction simultanément HSPCs, la création d'une palette variée de cellules de couleur marquée. Imagerie confocale / microscopie à deux photons hybride permet simultanée évaluation à haute résolution de cellules marquées unique et leur progéniture en association avec des composants de structure des tissus. Analyse volumétrique sur de grandes surfaces révèlent que les cellules dérivées de HSPC spectralement codées peuvent être détectées de manière non invasive dans divers tissus, y compris les intactes de la moelle osseuse (BM), Pendant de longues périodes de temps après la transplantation. Études en direct combinant multiphotonique vidéo-taux et imagerie confocale time-lapse en 4D démontrent la possibilité de suivi cellulaire clonale et dynamique de manière quantitative.

Introduction

La production de cellules sanguines, appelé hématopoïèse, est maintenue par une petite population de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (hspC). Ces cellules se trouvent dans la moelle osseuse (BM) dans un créneau de microenvironnement complexe constitué des ostéoblastes, les cellules stromales, le tissu adipeux, et les structures vasculaires, tous impliqués dans le contrôle de l'auto-renouvellement et de différenciation 1,2. Comme intact BM a toujours été inaccessible à l'observation directe, les interactions entre les CSPS et leur microenvironnement reste largement non caractérisés in vivo. Auparavant, nous avons établi une méthodologie de visualiser l'architecture 3D de BM intact confocale de fluorescence et microscopie de réflexion 3. Nous avons caractérisé l'expansion de HSPCs EGFP-marquées dans la BM, mais l'utilisation d'un seul FP empêchés analyse de régénération à un niveau clonale. Très récemment, nous avons profité de la Lentiviral Gene Ontology (Lego) vecteurs exprimant de manière constitutive flprotéines fluorescents (MF) pour marquer efficacement les cellules 4,5. Co-transduction de CSPS avec 3 ou 5 vecteurs génère une palette variée de couleurs combinatoires, permettant le suivi de plusieurs clones individuels CSPS.

Marqué CSPS combiné avec la nouvelle technologie d'imagerie permis de retracer individu homing CSPS et la prise de greffe à la BM de souris irradiées. LEGO vecteurs ont été utilisés pour marquer CSPS avec 3 ou 5 MF différentes (de Cerulean, eGFP, Vénus, tdTomato, et mCherry) et suivre leur greffe dans le temps du BM par microscopie confocale et 2 photons, ce qui permet une visualisation claire de l'os et d'autres structures de matrice, et la relation de clones de HSPC composantes de leur micro-environnement. CSPS ont été purifiés que les lignées de cellules négatives de souris C57BL / 6 BM, transduites avec des vecteurs LEGO, et réinjecté par injection dans la veine de la queue des souris congéniques myélo-ablation. En surveillant de grands volumes de tissu sternum BM nous avons visualisé greffe endo-osseux survenant au début deRégénération BM. des agrégats de cellules avec des spectres de couleur variée apparus initialement à proximité immédiate de l'os et a progressé au centre dans le temps. Fait intéressant, après plus de 3 semaines la moelle composée de grappes clonales macroscopiques, suggérant la propagation de l'hématopoïèse dérivé de HSPCs individuels contiguë dans la moelle, plutôt que de la diffusion généralisée de HSPCs via la circulation sanguine. Il y avait moins de diversité de couleurs aux points de temps de retard, ce qui suggère des difficultés dans la transduction de repopulation à long terme des cellules avec des vecteurs multiples.

En outre, les groupes HSPCs formé dans la rate, un organe aussi responsable de l'hématopoïèse chez des souris. Cellules individuelles HPSC dérivés pourraient être résolus dans le thymus, les ganglions lymphatiques, la rate, le foie, les poumons, le cœur, la peau, le muscle squelettique, le tissu adipeux, et les reins ainsi. Les images 3D peuvent être évaluées qualitativement et quantitativement pour apprécier la répartition des cellules avec des perturbations minimales des tissus. Enfin, nous illustronsd la faisabilité des études dynamiques vivantes en 4D en combinant résonance multiphotonique à balayage et imagerie confocale time-lapse. Cette méthodologie permet une grande résolution non-invasive, multidimensionnelle cellulaire sort traçage des populations cellulaires spectrale marqués dans leur architecture 3D intact, offrant un outil puissant dans l'étude de la régénération des tissus et de la pathologie.

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Protocole

Toutes les souris ont été logés et manipulés conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health, et inscrits dans un protocole de soins et d'utilisation des animaux NHLBI approuvé par le Comité. Femme B6.SJL-PTPRC (d) pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) et C57BL / 6 souris, 6-12 semaines, ont été utilisés comme donneur et le receveur, respectivement.

Une liste des matériaux, les réactifs et le matériel est fourni dans le tableau 1.

1. LEGO transduction de souris HSPCs et greffe de moelle osseuse

Exécuter les procédures décrites ci-dessous dans un niveau de sécurité biologique certifié 2 (BSL-2) cabinet (culture de tissus capot).

  1. Production de Lego vecteurs codant 5fps
    1. Utilisez le lentivirus "Gene Ontology" (LEGO) Les plasmides vecteurs, chaque codant pour une FA différente d'un promoteur fort de la SFFV constitutif, y compris LEGO CER2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Vénus), Lego-T2 (tdTomato), et Lego-C2 (mCherry) aimablement fourni par le Dr Boris Fehse (Centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf, Hambourg, Allemagne); maintenant aussi disponible à partir de Addgene 5-7.
    2. Pour produire des vecteurs Lego, graines 5 x 10 6 cellules 293T en boîtes de 10 cm (utiliser 12 plats pour chaque vecteur) 24 h avant la transfection dans 8 ml de milieu I10 (IMDM supplémenté avec 10% de FCS et glutamine / pénicilline / streptomycine).
    3. Transfecter les cellules avec de phosphate de calcium à l'aide des recommandations du kit de CAPHOS légèrement modifiées:
      1. Pour chaque vecteur plaque de mélange 15 pg de Lego, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 pg préc-TAT, et 1 ug pMD2.G-VSV-G plasmides présence de 50 ul de 2,5 M CaCl 2, et ajouter de l'eau à obtenir un volume total de 500 pi.
      2. Précipiter l'ADN des plasmides avec 500 pi de HeBS 2x (HEPES-Buffered Saline) et incuber pendant 20 min à température ambiante avant d'ajouter à chaque plaque de cellules 293T.
      3. Incuber les cellules pendant6 h à 37 ° C une 5% de CO 2 incubateur; retirer le support et ajouter frais des milieux de culture de 6 heures après la transfection.
    4. Collecter les surnageants de culture contenant les particules lentivirales de chaque plaque, chaque jour, pendant 3 jours. Chaque collection de surnageant lendemain ajouter médias I10 frais à chaque plaque.
      1. Filtre de 0,22 um pores, piscine et concentrer les surnageants par ultracentrifugation sur un rotor SW28 pendant 2 heures à 71 900 xg et 4 ° C.
      2. Remettre en suspension les surnageants dans 1 ml de StemSpan médias. Aliquoter stocks lentiviraux à 200 pi et conserver à -80 ° C.
  2. Titration de Particules Lentivirales
    Déterminer le titre de particules de vecteur LEGO dans les surnageants recueillis par la quantification de la transduction unités / ml en utilisant des cellules NIH3T3. Les titres permettent de calculer le volume de chaque surnageant de vecteur nécessaire pour aboutir à la multiplicité désirée par rapport d'infection (MOI) de cible expérimentalcellules.
    1. Plaque 5 x 10 4 cellules NIH3T3 par puits (plaque 12 puits) dans 2 ml de milieu I10 Un jour avant le titrage.
    2. Préparer des dilutions en série de 5 fois de surnageants de vecteurs dans des milieux I10 supplémenté avec du sulfate de protamine (4 mg / ml est 1,000x).
    3. Retirez le support de cellules, et les remplacer par 500 pi de dilutions du surnageant contenant l'équivalent de 2, 0,8, 0,32, et 0,128 pi de virus concentré.
    4. Déterminer le nombre (n) de cellules présentes dans chaque puits au moment de la transduction, en comptant bien un contrôle.
    5. 6 heures après la transduction, ajouter 2 ml de milieu I10 et incuber pendant 3 jours à 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Récolter les cellules de chaque puits en utilisant de la trypsine-EDTA, et déterminer le pourcentage de cellules fluorescentes (% PP) via cytométrie de flux.
    7. Calculer le titre de la manière suivante, la moyenne des titres obtenus pour chaque puits (dilution) résultant en un FP% entre 1 et 50% (titre: particules de vecteur / ml) = nx% FP / volume de surnageant de vecteur (ml). Faire la moyenne des titres obtenus pour chaque dilution si l'% PP est comprise entre 1 et 50%.
  3. Souris Collection cellulaire, de purification, de transduction, et la transplantation (schématisé sur la figure 1A adapté de Malide et al. 4).
    1. Sacrifiez souris donneuses par une procédure approuvée. Récolte de moelle osseuse antérieure et postérieure des membres: disséquer humérus, le fémur et le tibia, enlever complètement tous les muscles, les ligaments et les tissus en excès à partir d'os, couper à travers l'extrémité de chaque os aussi près que possible de l'articulation, et rincer la moelle osseuse de l'os à l'aide d'une aiguille 27-0 G sur une seringue contenant médias I10.
    2. Pellet les cellules de moelle osseuse entière pendant 10 min à 500 x g, 4 ° C et de lyser les globules rouges à deux reprises avec 50 ml de tampon ACK. Resuspendre les cellules dans 10 ml de milieu de I10.
    3. Purifier lignée négatifs (Lin-) des cellules progénitrices avec le kit lignée d'épuisement MACS selon un Protoco kit modifiél:
      1. Utilisez 30 pi de microbilles anti-biotine au lieu de 10 ul / 10 7 cellules; compléter les étapes de lavage avec les médias de I2 (IMDM additionné de 2% de FCS) au lieu de tampon.
      2. Insérer une étape de lavage entre l'incubation avec la biotine-anticorps Cocktail et l'incubation avec des microbilles anti-biotine; et équilibrer la colonne avec un tampon au lieu de I10.
    4. Culture des cellules Lin- pendant 48 heures à une densité initiale de 5 x 10 5 cellules / ml dans un milieu StemSpan supplémenté avec 10 ng / ml d'IL-3 murin, 100 ng ml d'IL-11 murine, 100 ng ml / / humain Flt-3 ligand, et 50 ng / ml de facteur de souris sur les cellules souches.
    5. Transfert 1 à 4 x 10 5 cellules à 12 puits des plaques revêtues de rétronectine et la transduction avec des surnageants de Lego, chacun à une multiplicité d'infection (MOI) de 6-7 pour atteindre 50% d'efficacité d'expression pour chaque FP, en présence de StemSpan médias et des cytokines détaillés ci-dessus et 4 pg / ml de sulfate de protamine.
    6. Transduire des cellulesà chaque vecteur LEGO individuellement comme décrit dans l'étape 1.3.5 et cellules mélanger suivante transduction (appelé Mix) ou co-transduction des cellules avec toutes les surnageants de vecteur 5 LEGO simultanément (appelé Co). Éliminer les cellules 24 heures plus tard, laver une fois avec StemSpan médias sans cytokines, et les remettre en suspension dans un milieu sans StemSpan cytokines pour la transplantation, ou les transférer à un milieu frais avec des cytokines, et la culture de plus de 96 heures avant la microscopie confocale et la cytométrie de flux.
      1. Effectuer une greffe de moelle osseuse en infusant transduction Lin- HSPCs par injection dans la veine de la queue des receveurs 11 d'une dose unique Gy pré-irradiés (6-18 heures avant la transplantation) bénéficiaires, dans un volume de 100 pi, à une dose de cellules par souris correspondant à 1 cellules -4 x 10 5 Lin- origine plaqué pour la transduction. Dans chaque expérience, transplanter toute une cohorte d'animaux avec la même population de cellules BM donateurs transduction.
      2. Pour la caractérisation in vitro de transduction HCCP, la culture des cellules pour un 4-5 jours supplémentaires dans StemSpan complété par des cytokines et d'analyser par cytométrie en flux pour l'efficacité de transduction, et par microscopie de la diversité des couleurs.
        1. Sacrifiez souris individuelles et de récupérer les tissus et les organes de l'imagerie, à divers moments jusqu'à 120 jours après la transplantation.
          1. Pulvériser avec de l'éthanol de la fourrure de la souris et inciser la peau sur la face ventrale d'éviter la diffusion de cheveux.
          2. Disséquer et accises selon les procédures standard de la rate, les ganglions lymphatiques poplités, les poumons, le cœur, la peau, le tissu adipeux, le muscle squelettique, le rein, le foie, ainsi que la tête à l'accès à la voûte crânienne.
          3. Vous pouvez également utiliser la voûte crânienne ou mettre en place une fenêtre de l'os pour l'imagerie en direct à plusieurs reprises au fil du temps 2,8,9 ou image organes superficiels comme les ganglions lymphatiques et de la peau chez l'animal vivant.
        2. Placez les différents organes en 35 mm des boîtes de culture numéro 0 couvercle en verre dans 50-10056; l PBS pour eux imagerie intact sans sectionnement, la fixation ou le traitement ultérieur comme décrit dans l'étape 2.5.
        3. Pour l'imagerie volumétrique, maintenir les organes en dans du PBS froid jusqu'à utilisation. Pour l'imagerie time-lapse de procéder immédiatement à l'imagerie des organes en DMEM, 10% de FBS contenant 20 mM d'HEPES à 37 ° C

2. confocale et biphotonique microscopie et analyse d'images

  1. Effectuer imagerie microscopique en utilisant un cinq canaux confocale et multiphotonique système Leica SP5 équipé de plusieurs lignes Argon, diode 561 nm, 594 nm HeNe, et HeNe 633 nm lasers visibles. Utilisation en mode 2-photon, une femtoseconde pulsé Ti: saphir (Ti-Sa) laser accordable pour une excitation de 680 à 1080 nm avec correction de dispersion. Utilisation dans des expériences impliquant décalée vers le rouge MF (tdTomato et mCherry), un oscillateur paramétrique optique (OPO) laser pour étendre la gamme de longueurs d'onde de sortie dans la mesure où 1,030-1,300 nm, successivement ou simultanément avec til Ti-Sa laser.
  2. Image divers tissus à l'aide d'un HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA objectif à immersion (WD = 2,5 mm), un PLAPO-CS HC 20X / 0,70 NA objectif à sec (WD = 0,6 mm), ou HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA objectif à immersion d'eau (WD = 0,6 mm).
  3. Obtenir spectres de fluorescence confocale collecte des piles lambda (de xyλ) de la lumière émise dans 5 nm-largeurs de bande du spectre visible à partir de cellules BM transduction avec un vecteur unique FP Lego ainsi que de contrôle, pas transplanté BM.
    1. Traiter les images avec le logiciel Leica LAS v2.4.1-AF pour créer des spectres de référence de tous les 5 MF ainsi que des auto-fluorescence (figure 2A). En utilisant les spectres individuels FP et la différence de fluorescence luminosité (exprimée en% de l'EGFP) de Cerulean (79%), Vénus (156%), tdTomato (283%) et mCherry (47%) fixé 5 canaux d'imagerie successives comme suit: Cerulean (458/468 à 482 nm), EGFP (488/496 à 514 nm), Vénus (514/523 à 558 nm), tdTomato (561/579 à 597 nm), et mCherry (594/618 à 670 nm) ( Figure 2B).
    2. Valider une séparation précise MF, que les cellules transduites avec chaque individu FP ne sont visibles que dans le canal correspondant et absent du reste (figure 2C). En outre, cette approche multi-canal défini crée un 5 canaux uniques "Colorprint" qui permet l'analyse de la couleur suivante et le suivi clonale et a l'avantage de réduire le temps d'acquisition par rapport à l'imagerie spectrale.
  4. Fluorescence séparé émission, en mode 2-photon, par un rendement élevé miroirs dichroïques personnalisé et de recueillir avec quatre canaux détecteur non balayée (NDD) comme suit: un miroir dichroïque à 568 nm suivie par un miroir dichroïque à 465 nm, suivi par un 452/45 nm filtre d'émission pour SHG ou autofluorescence et Cerulean, un filtre 525/40 nm d'émission pour EGFP ou de Vénus, et un miroir dichroïque 648 nm et 620/60 nm filtre d'émission pour tdTomato ou mCherry.
    1. Révéler des informations structurales par microscopie à deux photons iimagerie de contraste Ntrinsic (tel que décrit ci-dessus) de l'autofluorescence des tissus de l'élastine, le NADH, (excité à 780 nm), et le second harmonique généré signal (SHG) de l'os et du collagène fibrillaire (excité à 920 nm ou 860 nm recueilli dans un rétrodiffusée- direction) 10,11.
  5. En raison du volume rendu 3D, recueillir série d'images xyz (typiquement de 1 x 1 x 4 um 3 de la taille de voxel) le long de l'axe z à 5 um intervalles sur une gamme de profondeurs (150-300 um) tout au long de la moelle osseuse et d'autres tissus, sur de grandes régions à l'aide de la fonction de tuile du logiciel pour générer automatiquement des volumes cousus comprenant un ensemble de fosses de poitrine, d'environ 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) et 300 um (z) (figures 2D-2E) et vidéo 1.
    1. L'image de la voûte crânienne osseuse directement dans le crâne sans sectionnement 2, 8.
    2. Section sternum long du plan sagittal (bissectrice), puistransversalement à l'articulation entre l'image 2 sternale fosse et à travers la face de coupe 3,4,12 (Vue d'ensemble de la figure 1B adapté de Takaku et al 3).
  6. Pour 4D imagerie time-lapse, placez fraîchement excisées poplité ganglions lymphatiques, la rate, les poumons, ou des échantillons d'os de la voûte crânienne intacte sur 35 mm boîtes de culture 0 Numéro de lamelle, dans 50-100 ul DMEM, 10% de FBS contenant 20 mM d'HEPES à 37 ° C et utiliser 2 photons Ti-Sa excitation (860 nm) combiné avec excitation confocale (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) et Leica scanner de résonance (8000 Hz / s), en prenant z-piles (~ 80 um) à 20 secondes d'intervalle pendant 1 h.
    1. Pour simultanée de trois couleurs utilisation de l'imagerie par 2P Ti-Sa réglé à 860 nm simultanément avec le laser OPO (mise au point en 1130 nm pour tdTomato; ou 1140 nm mCherry) (Film 2).
  7. La reconstruction et l'analyse des volumes 3D et 4D séquences temporelles
    1. Utilisez softw Imaris x64sont la version 7.6, ou des logiciels alternatifs pour transformer les meules de tuiles d'images brutes en volume rendu (3D) des données de cellules fluorescentes à l'intérieur de la moelle osseuse et des tissus différents et de les exporter sous forme de films 3D-rotation, comme décrit précédemment 3,4 (Film 1) étape par étape exemple:
      1. Dans Imaris, Ouvrez l'image z-pile; Sélectionnez "surpasser" pour afficher la visualisation de volume 3D.
      2. Utilisez "naviguer" pour augmenter le volume d'environ 360 °.
      3. Sélectionnez "Animation" pour créer une animation; utiliser des images clés pour ajouter des vues sélectionnées, zoom, rotations du volume; Visionner le film, modifier si nécessaire et enregistrez le fichier dans un format de film de votre choix (ex: avi, mov).
    2. Pour l'évaluation quantitative des cellules 3D et clone fréquences, positions, tailles et de distribution, outre les processus z-piles à l'aide des modules Imaris XT qui intègrent des applications MATLAB spectacle AME à distanceme- (en utilisant un algorithme de transformation à distance) et des groupes d'analyse, comme précédemment décrit 3,4. Transformer les séquences de piles d'images au fil du temps en quatre dimensions (4D) des films de volume-rendu avec le logiciel x64 Imaris, et utiliser place et l'analyse de surface pour le suivi semi-automatique de la motilité cellulaire en trois dimensions en utilisant des algorithmes de mouvement autorégression.
    3. Effectuer l'analyse multispectrale de cellules comme suit: extraire le multi-couleur des taches marquées en ajoutant les 5 canaux par canal arithmétique des Imaris XT dans un nouveau canal; déterminer pour tous les spots (cellules) de la fluorescence d'intensité moyenne dans chacune des voies 5 d'éléments. Exporter les valeurs dans le logiciel Excel pour tracer des graphiques affichant le "Colorprint" unique c'est à dire le rapport% de chaque FP en cellule individuelle (Figure 2E graphique). Corrigez l'ensemble de la dérive des tissus de données, et calculer la vitesse de la cellule et le déplacement au fil du temps, la longueur des pistes, chemins, et les distances; la valeur des exportations dans Excel software pour tracer des graphiques. Assemblez les chiffres composites avec Adobe Photoshop logiciel CSS 5.

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Résultats

L'ensemble du montage 3D confocale / 2 photons microscopie reconstitutions de l'évolution temporelle de la moelle osseuse du sternum a révélé la prise de greffe et de l'expansion de co-5fps transplantés dans un modèle avec des caractéristiques remarquables: clones semblaient clairement délimitée, homogène marqués avec une large palette de couleurs d'abord et le progrès au fil du temps pour contenir préférentiellement les cellules de la plupart une couleur. Configuration de la microscopie confocale, et de...

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Discussion

Nous décrivons ici les détails d'une méthodologie puissante récemment conçu pour le suivi des cellules clonales, combinant la grande diversité générée par marquage avec 5FP codant vecteurs Lego et imagerie en tandem microscopie confocale et 2 photons pour atteindre volumétrique et imagerie dynamique dans les tissus vivants combinatoire. Cette étendue d'utilisation du marquage par l'enregistrement de l'identité spectrale confocale à 5 canaux "distincts" 8-bits couleur à base de FP. Ainsi, le rap...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros de l’Institut national du cœur, des poumons et du sang des Instituts nationaux de la santé. Nous remercions Boris Fehse (Centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf, Hambourg, Allemagne) pour la fourniture des cinq plasmides vectoriels LeGO ; Christian A. Combs et Neal S. Young (NHLBI, NIH) pour les discussions, le soutien et les encouragements tout au long de cette étude, et Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) pour l’aide pour les injections dans la veine de la queue.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Production de virus
LeGO-Cer2Addgene27338Expression de Cerulean
LeGO-G2Addgene25917Expression de eGFP
LeGO-V2Addgene27340Expression de Venus
LeGO-T2Addgene27342Expression de tdTomato
LeGO-C2Addgene27339Expression de mCherry
Calciumm Kit de transfection de phosphateSigmaCAPHOS-1KT
Boîte de culture tissulaireBD Falcon353003
IMDMGibco, Life Technology12440-053
Sérum de veau fœtal Inactivé par la chaleurSigmaF4135-500ML
Stylo streptocoque GlutamineGibco, Life Technologie10378-016
Tubes à centrifugerBeckman Coulter326823
SW28 UltracentrifugeuseBeckman CoulterL60
Millex Filtre à seringue Unite (0.22 µ ; m)MilliporeSLGS033SS
Collecte de cellules de souris, purification, transduction et transplantation
ACK tampon de lysingQuality Biologicals Inc.118-156-101
Kit d’appauvrissement des cellules de lignée (souris)Miltenyi Biotec Inc. USA130-090-858
LS colonnes + tubesMiltenyi Biotec Inc. USA130-041-306
Filtres de pré-séparation (30 µ ; m)Miltenyi Biotec Inc. États-Unis130-041-407
Milieu sans sérum StemSpan SFEM pour la culture et l’expansion de cellules hématopoïétiques (500 ml)StemCell Technologies Inc  ;9650
Murin IL-11 CFR & D SystemsInc 418-ML-025/CF100 et micro ; g/ml est de 1 000 x
murin recombinant SCFRDI Division de Fitzgerald Industries Intl  ;RDI-2503100 et micro ; g/ml est 2 000x
IL-3 murin recombinantR & D Systems Inc403-ML-05020 & micro ; g/ml est de 2 000x
FLT-3 LigandMiltenyi Biotec Inc. États-Unis130-096-480100 µ ; g/ml est de 1 000 plaques
à 12 puits, CostarCorning Inc.3527
RetronectinTakara Bio IncT100A/BResuspension à 50 & micro ; g/ml
Sulfate de protamineSigmaP-40204 & micro ; g/ml est de 1 000x
Microscopie confocale et à deux photons
DMEMLonza12-614F
1 M HepesCellgro, Mediatech Inc.25-060-CI
Plat de culture à fond en verre P35G-0-20-CMatTek CorporationP35G-0-20-C
Plat de culture à fond en verre P35G-0-14-CMatTek CorporationP35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Verre de protection en borosilicate ; 4 puitsThermo Scientific155383
Coverslips 22 mm No 2Thomas Scientific6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS Microscope confocal et multiphotonique à cinq canauxLeica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph Gamme laser 680-1 080 nmChameleon Coherent
Compact OPO Gamme laser 1 030-1 350 nmObjectif d’immersion
HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA (WD=2,5 mm)Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA Objectif sec (WD=0,6 mm)Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA Objectif à immersion dans l’eau (WD=0,6 mm)Logiciel Leica Microsystems
Imaris version 7.6Bitplane
dans l’eau cohérent

Références

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
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Réimpressions et autorisations

Erratum


Formal Correction: Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

This was corrected in the discussion from:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

to:

This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and “on-the-fly”) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 μm, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

Mots-clés

Cellules souches et prog nitrices h matopo tiquesMarquage par prot ines fluorescentesMicroscopie confocaleMicroscopie biphotoniqueGreffe de moelle osseuseTransduction par vecteur lentiviralAnalyse du suivi clonalImagerie multicoloreTime lapse 4DD convolution spectrale
In vivo suivi clonale de cellules souches hématopoïétiques et progénitrices Marqué par cinq protéines fluorescentes confocale et multiphotonique Microscopie
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