Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d'un gène

Résumé

Le dosage Focus Formation fournit une méthode simple pour évaluer le potentiel de transformation d'un oncogène candidat.

Résumé

La transformation maligne des cellules est généralement associée à une prolifération accrue, à une perte d’inhibition du contact, à l’acquisition d’un potentiel de croissance indépendant de l’ancrage et à la capacité de former des tumeurs chez les animaux de laboratoire¹. Dans les cellules NIH 3T3, la voie de transduction du signal Ras est connue pour déclencher bon nombre de ces événements, ce que l’on appelle la transformation Ras. L’introduction d’un gène surexprimé dans les cellules NIH 3T3 peut favoriser la transformation morphologique et la perte d’inhibition de contact, ce qui peut aider à déterminer le potentiel oncogénique de ce gène d’intérêt. Un test qui fournit une méthode simple pour évaluer un aspect du potentiel de transformation d’un oncogène est le Focus Formation Assay (FFA)². Lorsque les cellules NIH 3T3 se divisent normalement en culture, elles le font jusqu’à ce qu’elles atteignent une monocouche confluente. Cependant, en présence d’un oncogène surexprimé, ces cellules peuvent commencer à se développer en foyers¹ denses et multicouches qui peuvent être visualisés et quantifiés par coloration en violet cristallin ou en Hema 3. Dans cet article, nous décrivons le protocole FFA avec transduction rétrovirale du gène d’intérêt dans les cellules NIH 3T3, et comment quantifier le nombre de foyers par coloration. La transduction rétrovirale offre une méthode d’administration de gènes plus efficace que la transfection, et l’utilisation d’un rétrovirus murin écotrope fournit un contrôle de biosécurité lors de l’utilisation d’oncogènes humains potentiels.

Introduction

Les cellules tumorales peuvent être distingués de leurs homologues normales par un large éventail de modifications, de profils d'expression génique pour Epigenomics à des changements morphologiques et proliferatives. Parmi ces derniers, réduction de la dépendance sur le sérum, la perte de contact (densité) l'inhibition, l'acquisition de la prolifération indépendante de l'ancrage et, finalement, la capacité de former des tumeurs lorsqu'elles sont injectées dans les animaux sont des indicateurs utiles, mesurables de transformation maligne ^3. Plusieurs in vitro et in vivo ont été développés pour une transformation cellulaire. Les essais in vitro pour but d'identifier et de mesurer des changements dans la morphologie de culture (test de formation de mise au point), la dynamique de culture (taux de croissance, la densité de saturation) et le facteur de croissance (croissance en sérum réduite) ou un mouillage (croissance dans la gélose molle) exigences. La méthode de référence pour la détermination de la nature maligne d'un type de cellule reste la formation de tumeurs (les xénogreffes) chez les animaux expérimentaux. Cependant, til a coûté et la longueur des études in vivo ne font pas toujours les justifier comme une première étape de validation ou de dépistage des oncogènes candidats. Bien qu'aucun essai in vitro fournit une évaluation précise du potentiel oncogène d'un gène, ils ne donnent un aperçu de potentiel oncogène qui peuvent affiner l'avenir des études in vivo. L'un des systèmes les plus utilisés pour l'évaluation du potentiel oncogénique in vitro est la Focus Formation Assay ^2. Cette approche repose sur l'utilisation de fibroblastes de souris NIH 3T3, une lignée cellulaire non transformée qui montre une forte inhibition de contact. Surexpression d'un oncogène résultats en perte de croissance dépendante de la densité; les cellules transformées peuvent ensuite se développer dans des couches multiples, formant "foyers", facilement visualisés contre la monocouche de cellules non transformées fond. La mise au point Formation Assay, puis, mesure la capacité d'un oncogène candidat à induire une transformation maligne, comme le montre la perte de contact inhibition comme un phénotype mesurable. La FFA a été utilisée pour évaluer la transformation par la surexpression de protéines kinases (par exemple Src ^4, BRAF ^5), des facteurs de transcription (par exemple, N-myc ⁶⁾ récepteurs, G couplés à la protéine (par exemple, P2RY8 ⁷⁾ et GTPases (par exemple, , Ras ^1), entre autres. La relative facilité de ce test, il est un bon choix qui fournira une réponse rapide et visuellement évident de savoir si la surexpression du gène est suffisante pour transformer des cellules de fibroblastes de souris NIH 3T3 in vitro.

La FFA décrit dans le présent protocole utilise la lignée cellulaire d'encapsidation Plat-E ^8, qui fournit les protéines virales d'emballage, et le vecteur rétroviral ⁹ pBabePuro (Addgene plasmidique 1764) pour produire des retrovirus. Après la transfection avec la construction d'pBabePuro contenant le gène d'intérêt, la lignée cellulaire Plat-E produira retrovirus écotrope qui peut être utilisé pour infecter des cellules NIH 3T3. Tsa méthode virale de la livraison de gènes est plus efficace que les méthodes de transfection chimique traditionnels et offre un moyen d'exprimer le gène ¹⁰ durable. Une fois incorporé dans le génome de cellules NIH 3T3, la surexpression du gène d'intérêt est entraîné par le virus de longues répétitions terminales (LTR), le promoteur ^11. Cette expression constante peut être utilisée pour déterminer si le gène d'intérêt a une activité oncogène, tel que mesuré par la formation de foyers sur les cellules NIH 3T3.

Protocole

1. Faire les vecteurs viraux

Les séquences codant pour le gène d'intérêt, ainsi que des contrôles positifs et négatifs, sont insérés dans pBabePuro par des méthodes traditionnelles de clonage (amplification par PCR, digestion par restriction et ligature). Il ya quatre sites de restriction sur le vecteur où l'ADN peut être inséré: BamHI, SnaBI, EcoRI et Sali.

1. Préparer transfection qualité plasmide ADN provenant de cellules compétentes en utilisant le kit de plasmide QIAGEN midi.
2. Mesurer la concentration de l'ADN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop2000.

2. rétrovirus production

La lignée cellulaire d'encapsidation Plat-E est utilisé pour produire des retrovirus écotrope qui fournira l'ADNc d'intérêt à des cellules NIH 3T3.

1. Établir Plat-E cultures de cellules congelées
   1. Dégeler rapidement les cellules Plat-E dans une ° C bain d'eau 37 et transférer dans un tube de 15 ml conique. Ajouter lentement 9 ml de milieu Plat-E (Dumilieu de Eagle modifié lbecco (DMEM) + 10% de sérum bovin fœtal (FBS) + pénicilline et streptomycine).
   2. Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
   3. Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu et de transfert Plat-E pour une boîte de culture de 10 cm.
   4. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur jusqu'à ce qu'elles soient confluentes à 80-90% (environ 2 jours).
2. Fractionnement cellulaire
   1. Aspirer le milieu et laver les cellules une fois avec PBS.
   2. Ajouter 2 ml de 0,05% de trypsine-EDTA et incuber pendant 1 min à température ambiante.
   3. Détacher les cellules par tapotement des doigts, ajouter 10 ml de milieu Plat-E, et transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml.
   4. Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
   5. Reprendre les cellules avec 10 ml de milieu Plat-E et semences dans de nouveaux plats au 1: 4-1: 6 dilutions.
3. Plat-E semis et transfection
   1. Graine 2 x 10 ⁶cellules par boîte de culture de 10 cm en utilisant un milieu Plat-E sans antibiotiques.
   2. Incuber les cellules O / N dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.
   3. Le lendemain, transférer 300 pi d'Opti-MEM dans 1,5 ml tube de centrifugeuse.
   4. Ajouter 27 ul de polyéthylènimine (PEI), un réactif de transfection rentable ^12, au tube préparé avec Opti-MEM. Mélanger doucement par tapotement des doigts et incuber pendant 5 min à température ambiante.
   5. Ajouter 9 pg d'ADN plasmidique transfection de qualité dans le tube Opti-MEM / PEI, mélanger doucement au vortex et incuber pendant 15 min à température ambiante.
   6. Ajouter l'ADN / PEI goutte à goutte complexe dans le plat Plat-E, et incuber O / N à 37 ° C, 5% de CO _2.
   7. Le lendemain, aspirer le milieu contenant le réactif de transfection et ajouter 10 ml de milieu Plat-E frais (sans antibiotiques).
   8. Remettre les cellules dans l'incubateur.

3. Les cellules NIH 3T3 et les infections

1. Établir NIHCultures et Semis 3T3
   1. Décongeler rapidement des cellules NIH 3T3 ° C dans un bain d'eau 37 et les transférer à un tube de 15 ml. Ajouter lentement 9 ml de milieu NIH 3T3 (DMEM + 10% de FBS).
   2. Centrifuger le tube à 180 x g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
   3. Remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu et NIH 3T3 transfert à une boîte de culture de 10 cm.
   4. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur. Il est très important que les cellules NIH 3T3 sont toujours maintenus underconfluent (50-60%), comme la fréquence de transformation spontanée (et donc les niveaux basaux de formation de foyers) augmente une fois par culture atteint la confluence.
   5. Seed 3 x 10 ⁵ cellules par boîte de 10 cm et incuber O / N de l'infection le lendemain.
2. Infection
   1. Récolter le surnageant retroviral de la boîte Plat-E en utilisant une seringue jetable de 10 ml, en le filtrant à travers un filtre en nylon de taille de la membrane de 0,45 um de pores, et en le transférant dans un 15 mltube.
   2. Ajouter 10 ml de milieu Plat-E frais aux cellules (sans antibiotiques), et les retourner à l'incubateur.
   3. Aspirer le milieu de l'antenne cellulaire NIH 3T3 d'être infectés, et ajouter 5 ml de milieu régulière NIH 3T3 et 5 ml de surnageant filtré contenant le virus.
   4. Ajouter à la boîte de polybrène à une concentration de 6 ug / ml.
   5. Incuber les cellules O / N à 37 ° C, 5% CO _2.
   6. Le jour suivant, répétez les étapes 3.2.1 - 3.2.5 pour un second tour de l'infection.
   7. Remplacez le support contenant le virus avec un milieu régulière NIH 3T3.
   8. Laisser les cellules NIH 3T3 à croître pendant 2-3 semaines, en remplaçant le milieu, si nécessaire. Vérifier expression de la protéine d'intérêt par électrophorèse des protéines classique et immunoblot des lysats de cellules entières de plaques de réplique.

4. coloration et quantification

1. Coloration au cristal violet
   1. Aspirer le milieu NIH 3T3 et placez les platssur la glace.
   2. Laver les plats deux fois avec PBS glacé.
   3. Fixer les cellules avec du méthanol glacé pendant 10 min.
   4. Retirez les plats de la glace, aspirer le méthanol, et ajouter 3 ml de solution de cristal violet à 0,5% réalisés dans 25% de méthanol (RT).
   5. Incuber les boîtes pendant 5 min à température ambiante.
   6. Aspirer la solution de cristal violet et rincer soigneusement le plat avec Milli-Q H ₂ O jusqu'au pas de couleur se détache dans le rinçage.
   7. Les laisser sécher O / N sur une paillasse (découverts).
2. Foci Quantification
   1. Une fois les plats sont à sec, utiliser une règle pour mesurer les collections de couleur sombre de cellules sur la plaque. Ne compter que ceux qui sont plus de 5 mm de diamètre comme «foyers». Notez le nombre de foyers et de calculer des moyennes et de l'importance par rapport aux contrôles.

Résultats

MXD3 est une base hélice-boucle-hélice leucine fermeture à glissière (bHLHZ) facteur de transcription qui est un membre de la MYC / MAX / MAD réseau. Ce est un membre de la famille atypique de MAD ^{13 à 15,} et il a été rapporté d'être impliqués dans la carcinogenèse ^16,17. Par rapport à pBabePuro (contrôle négatif) et MYC (contrôle positif), les plats NIH 3T3 où MXD3 a été surexprimé avaient significativement moins foyers (figure 1A). Les données de la figure 1B ont...

Discussion

La FFA fournit une méthode rapide et facile pour évaluer la transformation maligne in vitro. Il se prête à la projection d'un nombre relativement important de gènes candidats, et ses exigences techniques modestes rendre rentable. En outre, deux ou plusieurs gènes peuvent être co-exprimés (parfois appelé un dosage "coopération") pour évaluer le potentiel tumorigène de la combinaison. Les avantages de ce test se appuient sur sa technique simple, sa facilité de quantification et de sa relativement co...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Vecteur pBABE-puro	Addgene	Plasmide 1764	vecteur de clonage
Lignée cellulaire d’emballage rétroviral platine-E, Ecotropic	Cell Biolabs, Inc.	Lignée cellulaire RV-101	pour la production virale
NIH 3T3 Lignée cellulaire murine	Sigma-Aldrich	93061524	pour le test de formation de foyer
10 ml BD Seringue à embout Luer-Lok	BD Biosciences	309604	réactif de production virale
0,45 &mu ; m Puradisc Seringue Filtre	Whatman	6750-2504	réactif de production virale
Polyéthylénimine (PEI)	Polysciences, Inc.	23966-2	réactif de transfection cellulaire
Polybrène Réactif d’infection / transfection	EMD Millipore	TR-1003-G	réactif de transfection cellulaire
Crystal Violet	Fisher Scientific	C581-25	réactif de coloration cellulaire
Plasmid Plus Midi Kit	QIAGEN	12945	purification du plasmide
BD Falcon Tissue Culture Dishes	BD Biosciences	353003	Fournitures de culture cellulaire
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	milieu de culture cellulaire
0,05 % Trypsine-EDTA	Gibco	25300-054	fournitures de culture cellulaire
Opti-MEM I Reduced Serum	Medium Gibco	31985-062	milieu de culture cellulaire
Sérum de veau fœtal (FBS)	Gibco	16000-044	milieu de culture cellulaire