À haut débit de dosage de phénotype Salmonella enterica Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

Résumé

Une analyse à haut débit de Salmonella in vitro du phénotype bactérien ou autre association, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires avec une grande capacité de débit a été développé. La méthode a été utilisée pour évaluer Salmonella gène knock-out souches mutantes pour leur implication dans les interactions hôte-pathogène.

Résumé

espèces de Salmonella sont des agents pathogènes zoonotiques et principales causes de maladies d'origine alimentaire chez les humains et le bétail ^1. La compréhension des mécanismes sous-jacents aux interactions Salmonella de sont importants pour élucider la pathogenèse moléculaire des infections à Salmonella. Le dosage de la protection de gentamicine au phénotype association de Salmonella, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires a été adapté pour permettre le criblage à haut débit de définir les rôles des mutants de délétion de Salmonella enterica sérotype Typhimurium dans les interactions hôte à l'aide de RAW 264.7 macrophages murins. Dans ce protocole, la variance dans la mesure est considérablement réduite par rapport au protocole standard, parce que de type sauvage et des souches mutantes multiples peuvent être testés dans la même boîte de culture et dans le même temps. L'utilisation de pipettes multicanaux augmente le débit et améliore la précision. En outre, les préoccupations liées à l'utilisation de moins host cellules par puits dans 96 puits boîte de culture ont été abordés. Ici, le protocole de l'essai in vitro Salmonella modifié d'invasion en utilisant des cellules phagocytaires a été employée avec succès à phénotype 38 mutants individuels Salmonella de suppression d'association, l'invasion et la réplication intracellulaire. Les phénotypes in vitro sont présentées, dont certaines ont été confirmés par la suite avoir des phénotypes in vivo dans un modèle animal. Ainsi, l', test normalisé modifié au phénotype Salmonella association, l'invasion et la réplication dans les macrophages avec une grande capacité de débit pourrait être utilisé plus largement pour étudier les interactions bactéries-hôtes.

Introduction

Salmonella non typhoïdique, sont des causes importantes de maladies entériques dans tous les vertébrés. La salmonellose chez l'homme est parmi les maladies d'origine alimentaire bactériennes top ^1. Caractérisation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions de Salmonella avec leurs hôtes animaux se fait principalement à travers l'étude de Salmonella enterica sérotype Typhimurium (STM) en culture de tissus et des modèles animaux d'infection. Obtenir un aperçu des interactions hôtes-STM va nous aider à comprendre comment la bactérie Salmonella survivre et se développer à l'intérieur de....

Protocole

1 murin macrophage RAW264.7 culture cellulaire

1. Cultiver les cellules de macrophages murins faible numéro de passage, RAW264.7 (Le numéro ATCC ^®, TIB-71) dans une culture de cellules ballon évacué capuchon T-75 de filtre dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) , 0,5% de NaHCO _3, et 1% d'acides aminés non essentiels 100x (NEAA) à 37 ° C, dans un incubateur à _CO2 à 5%.
2. Une fois que les cellules atteignent une confluence de 60 à 80% dans le flacon, en utilisant un racleur de cellules pour récolter les cellules et compter les cellules dans un hémacytomètre et....

Résultats

Afficher les résultats représentatifs (figure 2) après que les données sont tracées sur la base de l'analyse de l'invasion des cellules phagocytaires modifié. Les données comprennent les cinq souches différentes, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A, et B. mutant Δ Inva, connu pour être défectueux pour l'invasion, et ΔphoP connus pour être défectueux pour la réplication ^8, sont utilisés comme témoins positifs pour évaluer la validité expérimentale . En effet, dans l'essai d'i.......

Discussion

Le test de protection gentamicine est largement utilisée pour étudier l'invasion et la réplication des bactéries pathogènes intracellulaires intérieur cellule hôte, et c'est surtout un outil biologique important pour l'étude des agents pathogènes, comme la salmonelle, dont l'invasion est l'étape préalable à l'établissement infection ^1. La protection dosage standard de gentamicine dans la communauté de recherche Salmonella est mis en œuvre dans 24 puits boîte de cultur.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965
Sérum fœtal	bovin HyClone	SH30910.03
T-75 Fiole de culture cellulaire bouchon filtrant ventilé	Nest Biotechnology	708003
100x Non-Essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Grattoir cellulaire	BD Falcon	353086
Plaque de culture cellulaire 96 puits	Corning Incorporated	3595
Bouillon Luria-Bertani (LB)	MP Biomedicals	3002-075
14 ml Tube à fond rond en polypropylène	BD Falcon	352059
PBS pH 7,4 (1x)	Life Technologies	10010
Triton X-100	Sigma	T-8787
Kanamycin solution	Sigma	K0254
Gentamicine solution	Sigma	G1272
0,25 % Trypsine-EDTA	Life Technologies	25200
Bleu trypan	Sigma	T8154